許方方，戴太強，徐海燕，安　然，劉　斌

聚乙烯醇復合富血小板纖維蛋白創(chuàng)傷敷料體外細胞毒性測定

許方方，戴太強，徐海燕，安然，劉斌

目的檢測聚乙烯醇復合富血小板纖維蛋白（PVA/PRF）創(chuàng)傷敷料的細胞毒性。方法制作PVA/PRF創(chuàng)傷敷料，利用小鼠成纖維細胞（L929）與不同濃度敷料浸提液共培養(yǎng)和直接黏附于敷料，通過MTT測定其相對增殖率；掃描電鏡和熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)。結果各濃度實驗組細胞生長形態(tài)良好；細胞緊密地黏附于敷料上，形態(tài)正常，細胞毒性評價為0～1級。結論PVA/PRF創(chuàng)傷敷料無細胞毒性。

聚乙烯醇；富血小板纖維蛋白；敷料；細胞毒性

皮膚位于人體表面，平時多因運動損傷、交通事故；戰(zhàn)爭中多因刀槍傷和火器傷造成皮膚缺損性破壞和連續(xù)性破壞，必須及時進行閉合修復。敷料是能夠起到暫時保護傷口、防止感染、促使愈合的醫(yī)用材料，是不可或缺的一種皮膚替代物。運用生物材料與工程材料的復合而產生的新一代創(chuàng)傷敷料——復合敷料，是目前創(chuàng)傷敷料發(fā)展的趨勢[1-2]。本研究通過MTT檢測實驗和細胞黏附實驗，檢測聚乙烯醇（PVA）和富血小板纖維蛋白（PRF）兩種材料復合制作的PVA/PRF創(chuàng)傷敷料(已獲得國家實用新型專利)對L929細胞活性的影響，評價其生物安全性，為此敷料下一步研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要材料與設備聚乙烯醇 （國藥集團化學試劑有限公司，聚合度=1750±50，純度≥99.0%）；小鼠成纖維細胞株L-929細胞系 （第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院生物教研室）；DMEM培養(yǎng)基（Hyclone，USA）；胎牛血清（杭州四季青公司）；MTT（Sigma）；酶標儀（Multiskan MK3，USA）；波形絲蛋白抗體（Abcam，USA）；羊抗鼠IgG/FITC標記（北京中彬金橋）；新西蘭兔（第四軍醫(yī)大學實驗動物中心）；冷凍干燥機（VirTis,USA）；倒置顯微鏡（Olympus IX70-121，Japan），倒置熒光顯微鏡（Olympus IX71，Japan）；掃描電鏡（S-4800，日本）。

1.2實驗方法

1.2.1PRF微粒的制備取兔耳中央動脈血10 ml，放入10 ml離心管中,3000 r/min離心10 min；離心后中層的淡黃色凝膠即是PRF，無菌鑷子取出，冷凍干燥24h后，取出研磨，200目的不銹鋼篩網過濾，進行微?；?/p>

1.2.2PVA/PRF創(chuàng)傷敷料的制備（1）分別取0.25、0.5、0.75、1 g的PRF微粒，放入10 ml的純水中，在室溫條件下，磁力攪拌1h，得到PRF微粒的懸浮液。（2）取10 g PVA顆粒，放入90 ml的純水中，在磁力攪拌器上，在90℃下磁力攪拌3h，得到PVA的清亮液體。（3）將PVA液體冷卻至室溫，在磁力攪拌下，把PRF懸浮液緩慢加入，直至充分混勻成10%PVA含不同量的PRF微粒的混合液。取0.5 ml上述PVA/PRF混合液，加入模具內，置于-20℃下24h，室溫下復融24h，即得到PVA/PRF水凝膠創(chuàng)傷敷料。

1.2.3PVA/PRF創(chuàng)傷敷料浸提液制備[3]上述制作的PVA/PRF創(chuàng)傷敷料，在紫外燈下消毒30 min，加入含有血清的培養(yǎng)液，細胞培養(yǎng)箱中放置24h后，浸提液經過0.22 mm濾器過濾，即可。

1.2.4MTT檢測敷料浸提液對細胞增殖活性影響[4]

將對數(shù)生長期的小鼠L929細胞以1×104個/ml細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔 200 μl。設陰性對照組 （細胞+完全培養(yǎng)液）、陽性組（細胞+5% DMSO）、實驗組（細胞+不同濃度敷料的浸提液），每組設5個復孔。置細胞培養(yǎng)箱中24h后，棄去原培養(yǎng)液，各組分別加入相應的浸提液，繼續(xù)培養(yǎng)。分別在2、4、6 d后，按MTT的常規(guī)步驟進行，在酶標儀490 nm波長下測定吸光度值（A490 nm），并計算其相對增殖率（RGR）。RGR=各實驗組A490nm/陰性組A490nm× 100%。毒性分級標準見表1[3]。

表1　相對增殖率（％）與毒性對應關系???????　??????????? ??　????? ??　?????? ??　?????? ??　?????? ??　?????

1.2.5細胞黏附于PVA/PRF創(chuàng)傷敷料生長情況將敷料（PRF與PVA的質量體積比為0.5%）裁剪成一定大小的試樣，放入96孔內，徹底干燥后，在紫外燈下消毒30 min，然后每孔加入200 μl的1× 105個/ml的L929細胞懸液，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。（1）倒置顯微鏡下觀察活細胞在敷料上生長狀態(tài)；（2）熒光顯微鏡下觀察細胞在敷料上的形態(tài)（一抗為波形絲蛋白，二抗為IgG/FITC標記，空白組為細胞直接黏附于96孔板上）；（3）掃描電鏡觀察細胞在敷料上的形態(tài) （空白組為細胞直接接種于栽玻片上）。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS19統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析對各實驗組和陰性對照組的A490 nm均值進行統(tǒng)計學分析，假設檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1PVA/PRF創(chuàng)傷敷料浸提液對細胞活性的影響

不同濃度的浸提液、不同培養(yǎng)時間，實驗組與陰性對照組的A490 nm均值均無統(tǒng)計學差異 （P>0.05，表2）。實驗組細胞的增殖率＞88%，細胞毒性分級為0～1級；陽性對照組細胞增殖率＜49%，細胞毒性為3～4級。見表3。

表2　各組不同培養(yǎng)時間A490nm值檢測結果（n=5）???　????　????　???? ??????　????????????　????????????　???????????? ??????　????????????　????????????　???????????? ????　????????????　????????????　???????????? ???????????????　????????????　????????????　???????????? ??????????????　????????????　????????????　???????????? ???????????????　????????????　????????????　???????????? ????????????　????????????　????????????　???????????? ?

2.2PVA/PRF創(chuàng)傷敷料對細胞形態(tài)的影響

2.2.1細胞培養(yǎng)72h后實驗組細胞形態(tài)良好，可見扁平多角形細胞和短梭形細胞，與陰性對照組相似。陽性對照組則可見細胞皺縮、變圓，漂浮在培養(yǎng)液中。見圖1。

2.2.2細胞黏附于敷料24h后（1）倒置顯微鏡觀察：敷料與96孔板接觸界面處(箭頭處)可觀察到細胞呈梭形、三角形（圖2B），與空白組形態(tài)相似（圖2A）。（2）熒光顯微鏡觀察：敷料因其透明度的原因，使圖像模糊，但細胞分布均勻，呈黃綠色熒光、外形清晰，呈梭形、三角形（圖3B），與空白組無差異(圖3A)。（3）掃描電鏡觀察：細胞和敷料同時呈現(xiàn)，細胞緊密地貼附于敷料上，細胞邊界清晰(圖4B），與細胞在載玻片的形態(tài)相似（圖4A）。

3　討論

敷料含有生長因子可以發(fā)揮主動修復作用，但是價格昂貴，且所含生長因子種類少、半衰期短、多為人工重組[5-7]，而得不到廣泛的應用。PVA是一種親水的高分子聚合物，具有良好的成膜性、機械強度和生物相容性，并可以釋放生長因子[8-11]，已廣泛應用于生物醫(yī)藥、食品工業(yè)。PRF是第2代血小板濃縮產品，現(xiàn)已證實其內富含多種生長因子[12]。目前，雖有大量的文獻和臨床證明PRF具有促進創(chuàng)傷愈合和組織再生的作用[13-17]，但將其作為創(chuàng)傷敷料的還未見報道。本課題組已將PRF應用于多種組織再生的研究[18-20]，并且獲得兩項涉及PRF的國家發(fā)明專利，為研制PRF創(chuàng)傷敷料奠定了基礎。

表3　各組不同培養(yǎng)時間PGR值及毒性平價結果（n=5）????　????　???? ???　???????????????????????????????????? ??????　???????　??　???????　??　???????　?? ??????　??????　??　??????　??　??????　?? ????　??????　??　??????　??　??????　?? ?????? ????????　??????　??　???????　??　??????　?? ?????? ???????　???????　??　??????　??　??????　?? ?????? ????????　??????　??　??????　??　??????　?? ?????? ?????　??????　??　??????　??　??????　?? ?

圖1　各組細胞培養(yǎng)72h細胞照片（×200）

敷料由于直接與創(chuàng)口接觸，必須具備良好的生物相容性[21]。通過MTT法檢測敷料的浸提液對L929細胞活性的影響已得到國際標準化組織認可[4]。為了全面評價PVA/PRF敷料的細胞毒性，本研究設置了一定濃度梯度的敷料浸提液做MTT實驗，結果表明，各組的敷料浸提液的細胞毒性為0～1級。通過倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、掃描電鏡觀察L929細胞直接在敷料表面生長的形態(tài)，均顯示細胞形態(tài)正常，符合生物材料應用的標準。

綜上所述，本課題組新研發(fā)的PVA/PRF創(chuàng)傷敷料具有良好的生物相容性，為進一步動物皮膚創(chuàng)傷實驗研究奠定了堅實基礎。

圖2　倒置顯微鏡觀察細胞黏附于敷料表面（×100）

圖3 熒光顯微鏡觀察細胞黏附于敷料表面（×200）

圖4　掃描電鏡觀察細胞黏附于敷料表面（×1000）

[1]Gonzalez JS,Luduena LN,Ponce A,et al.Poly(vinyl alcohol)/ cellulose nanowhiskers nanocompositehydrogels for potential wound dressings[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl,2014,34: 54-61.

[2]Amin MA,Abdel-Raheem IT.Accelerated woundhealing and anti-inflammatory effects of physically cross linked polyvinyl alcohol-chitosanhydrogel containinghoney bee venom in diabetic rats[J].Arch Pharm Res,2014,37(8):1016-1031.

[3]黃經春，由少華，朱雪濤，等.醫(yī)療器械生物學評價 第12部分：樣品制備與參照樣品 GB/T 16886.12-2005/ISO 10993-12; 2002[M].北京:中國標準出版社,2005.

[4]由少華，朱雪濤，劉欣，等.醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分：生物試驗方法 GB/T 14233.2-2005[M].北京:中國標準出版社,2005.

[5]Ulubayram K,Nur CA,Korkusuz P,et al.EGF containing gelatin-based wound dressings[J].Biomaterials,2001,22(11): 1345-1356.

[6]Losi P,Briganti E,Errico C,et al.Fibrin-based scaffold incorporating VEGF-and bFGF-loaded nanoparticles stimulates woundhealing in diabetic mice[J].Acta Biomater,2013,9(8): 7814-7821.

[7]Mohandas A,Anisha BS,Chennazhi KP,et al.Chitosanhyaluronic acid/VEGF loaded fibrin nanoparticles composite sponges for enhancing angiogenesis in wounds[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2015,127:105-113.

[8]JolantaStaskoMKAD.Poly(vinylalcohol)hydrogels[J]. Proceedings of the Estonian Academy of Sciences,2009,58(1): 63-66.

[9]Mongia NK,Anseth KS,Peppas NA.Mucoadhesive poly(vinyl alcohol)hydrogelsproducedbyfreezing/thawingprocesses: applications in the development of woundhealing systems[J].J Biomater Sci Polym Ed,1996,7(12):1055-1064.

[10]Bourke SL,Al-Khalili M,Briggs T,et al.A photo-crosslinked poly(vinyl alcohol)hydrogel growth factor release vehicle for woundhealing applications[J].AAPS PharmSci,2003,5(4):E33.

[11]Stasko J,Kalnin觢M,Dzene A,et al.Poly(vinyl alcohol)hydrogels[J].Proceedings of the Estonian Academy of Sciences, 2009,58(1):63-66.

[12]Dohan DM,Choukroun J,Diss A,et al.Platelet-rich fibrin(PRF): a second-generation platelet concentrate.PartⅡ:platelet-related biologic features[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,2006,101(3):e45-e50.

[13]Mohanty S,Pathakh,Dabas J.Platelet rich fibrin:a new covering material for oral mucosal defects[J].J Oral Biol Craniofac Res,2014,4(2):144-146.

[14]Yuanzheng C,Yan G,Ting L,et al.Enhancement of the repair of dog alveolar cleft by autologous iliac bone,bone marrow-derived mesenchymal stem cells and platelet-rich fibrin mixture[J].Plast Reconstr Surg,2015,135（5）:1405-1412.

[15]Mathur A,Bains VK,Gupta V,et al.Evaluation of intrabony defects treated with platelet-rich fibrin or autogenous bone graft: a comparative analysis[J].Eur J Dent,2015,9(1):100-108.

[16]ZhaoJH,TsaiCH,ChangYC.Clinicalapplicationof platelet-rich fibrin as the sole grafting material in maxillary sinus augmentation[J].J Formos Med Assoc,2015,http://dx.org/10.1016/ j.jfma.2015.02.009

[17]Yuanzheng C,Yan G,Ting L,et al.Enhancement of the repair of dogalveolarcleftbyanautologousiliacbone,bone marrow-derived mesenchymal stem cell,and platelet-rich fibrin mixture[J].Plast Reconstr Surg,2015,135(5):1405-1412.

[18]Liu B,Tan XY,Liu YP,et al.The adjuvant use of stromal vascular fraction and platelet-rich fibrin for autologous adipose tissue transplantation[J].Tissue Eng Part C Methods,2013,19(1): 1-14.

[19]楊勇，楊濤，劉斌，等.自體ADSCs復合PRF修復家兔耳軟骨缺損的實驗研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2013(12):2210-2214.

[20]王之發(fā).基于細胞膜片技術復合富血小板纖維蛋白（PRF）構建可注射的組織工程骨的實驗研究 [D].西安:第四軍醫(yī)大學, 2013.

[21]Harmand MF.In vitro study of biodegradation of a Co-Cr alloy using ahuman cell culture model[J].J Biomater Sci Polym Ed, 1995,6(9):809-814.

Cytotoxicity assay of polyvinyl alcohol/platelet-rich fibrin wound dressing in vitro

Xu Fangfang1,Dai Taiqiang1,Xuhaiyan2,An Ran2,Liu Bin21.State Key Laboratory of Military Stomatology,Department of Dentofacial Surgery;2.State Key Laboratory of Military Stomatology,Laboratory Animal Center,Dentalhospital of the Fourth Military Medical University,Xi'an,Shaanxi,710032,China

ObjectiveTo detect the cytotoxicity of polyvinyl alcohol/platelet-rich fibrin(PVA/PRF)wound dressing.Methods PVA/PRF wound dressing was prepared and co-cultured through L929 cells and dressing leaching liquor of different concentration. The relative growth rate was detected by MTT assay.Scanning electron microscope and fluorescence microscope were used to observe the cellular shapes.ResultsCell growth forms were in good condition in the groups of different concentration.L929 cells tightly adhered to the material with normal shape.The toxicity gradation of all the experimental groups was 0-1.ConclusionPVA/PRFhas no cytotoxicity.

polyvinyl alcohol;platelet-rich fibrin;dressing;cytotoxicity

Q813.1/R558.9

A

1004-0188（2016）01-0007-05

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.01.003

國家自然科學基金資助課題（31170942）

710032西安，第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院頜面外科軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室（許方方，戴太強），第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院實驗動物中心軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室（徐海燕，安然，劉斌）

劉斌，E-mail:kqyljd_liu@126.com

（2015-07-06）