俞承志，謝學(xué)輝，鄭秀林，徐樂銥，李然，柳建設(shè)

（1東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620；2國(guó)家環(huán)境保護(hù)紡織污染防治工程技術(shù)中心，上海 201620）

活性黑5的生物脫色、復(fù)色現(xiàn)象及機(jī)理

俞承志1,2，謝學(xué)輝1,2，鄭秀林1,2，徐樂銥1,2，李然1,2，柳建設(shè)1,2

（1東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620；2國(guó)家環(huán)境保護(hù)紡織污染防治工程技術(shù)中心，上海 201620）

印染廢水問題形勢(shì)依然嚴(yán)峻，目前常用生物法來治理，篩選高效降解染料的微生物是生物法處理印染廢水的關(guān)鍵。本文利用梯度濃度壓力馴化法，從印染廢水水解酸化反應(yīng)器中篩選出對(duì)染料活性黑 5具有良好脫色性能的混合菌群DDMY1。利用該菌群在兼氧條件下對(duì)活性黑5進(jìn)行脫色研究，首先采用拍照方式記錄其反復(fù)脫色、復(fù)色的直觀效果，其次運(yùn)用紫外-可見光分光光度計(jì)檢測(cè)其不同時(shí)間、不同狀態(tài)下脫色液吸光值情況，最后運(yùn)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀和傅里葉變換紅外光譜儀等檢測(cè)方法分析脫色、復(fù)色過程中產(chǎn)物情況。結(jié)果表明，混合菌群DDMY1對(duì)活性黑5的脫色性能顯著，24h脫色率能達(dá)到97.4%。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)活性黑5的兼氧生物脫色反應(yīng)可有效反復(fù)脫色、復(fù)色達(dá)17次之多，根據(jù)分析測(cè)試的結(jié)果，初步推測(cè)該現(xiàn)象可能是由活性黑5降解產(chǎn)物中的苯胺類物質(zhì)或萘醌類物質(zhì)造成的。

混合菌群；染料脫色；活性黑5；氧化還原反應(yīng)

染料廣泛應(yīng)用于紡織、皮革、塑料、化妝品和食品等行業(yè)［1］。全世界每年有7×105t合成染料生產(chǎn)，并且有5%～10%隨印染廢水排放［2］。而偶氮染料是在紡織工業(yè)中應(yīng)用最多的，約占70%［3］。每年有超過3000種偶氮染料用于各行業(yè)［4］。偶氮染料中有一個(gè)或多個(gè)偶氮鍵（—N==N—）［5］以及磺酸基團(tuán)，使得染料分子具有毒性，耐高溫，在酸性和堿性條件下非常穩(wěn)定，很難天然降解［6-8］，從而被認(rèn)為是持久性有 機(jī)污染物［9］。染料進(jìn)入天然水體中，不僅破壞美觀，而且減少陽(yáng)光透入，從而抑制水生植物光合作用［10］，而其降解產(chǎn)物通常含有芳香胺，芳香胺對(duì)生物體具有致癌、致畸、致突變的作用［11-12］，可通過食物鏈進(jìn)入人類體內(nèi)［13］。

目前，常用的處理偶氮染料的方法有絮凝法、吸附法、臭氧氧化法、光催化氧化法、膜過濾法和電化學(xué)氧化法等［14］。然而，它們各自均有局限性，比如高昂的成本、產(chǎn)生具有風(fēng)險(xiǎn)的副產(chǎn)品和大量的能耗需要［15］。而微生物處理技術(shù)以其低成本、環(huán)保、產(chǎn)生微量污泥等特點(diǎn)，成為越來越重要的印染廢水處理技術(shù)［16］。偶氮染料微生物處理過程，通常先厭氧還原染料分子為芳香胺，接著用好氧工藝徹底礦化芳香胺［17］。厭氧代謝能夠打開偶氮鍵，使染料分子還原為無(wú)色的芳香胺，降低色度，而芳香胺在厭氧狀態(tài)下無(wú)法進(jìn)一步降解［18］，但在好氧條件這些胺可以通過非特異性的酶羥化和打開芳環(huán)［18］。厭氧還原偶氮染料的細(xì)菌已有很多報(bào)道，如沼澤紅假單胞菌［19］和Enterobacter sp.EC3［20］。此外，水解酸化工藝是一種兼氧處理工藝，在偶氮染料的處理方面有越來越多的應(yīng)用。水解酸化工藝是通過微生物分泌出的胞外酶來實(shí)現(xiàn)的，這些微生物多為兼性厭氧菌，包括水解菌、發(fā)酵細(xì)菌及產(chǎn)酸菌。在染料降解過程中起主要作用的酶主要有偶氮還原酶、漆酶、過氧化物酶、NADH-DCIP還原酶和其他氧化還原酶等［21-23］。

本文利用梯度濃度壓力馴化法，從運(yùn)行良好的印染廢水水解酸化反應(yīng)器中馴化篩選出對(duì)活性黑 5具有良好脫色性能的混合菌群DDMY1，并對(duì)其菌群結(jié)構(gòu)采用高通量測(cè)序方法進(jìn)行了分析。在本實(shí)驗(yàn)中，采用2mL無(wú)色離心管作為培養(yǎng)容器，在兼氧狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)，混合菌群DDMY1對(duì)活性黑5具有良好的脫色效率。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，兼氧條件下，活性黑 5經(jīng)菌群DDMY1脫色后，脫色液呈淺黃色，而當(dāng)打開離心管蓋，脫色液接觸到空氣后，會(huì)立即變?yōu)樯钏{(lán)色。針對(duì)此現(xiàn)象，進(jìn)一步采用紫外可見分光光度法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜法等方法對(duì)脫色與復(fù)色機(jī)理進(jìn)行了探究。初步推測(cè)，偶氮染料在菌群的作用下被還原為某種淺色物質(zhì)，而這種物質(zhì)極易與氧氣發(fā)生反應(yīng)，變成深色的物質(zhì)。該物質(zhì)具有氧化、還原兩種狀態(tài)，能夠在兼氧狀態(tài)下被菌群DDMY1還原為淺色還原態(tài)，在氧氣存在時(shí)變?yōu)樯钌趸瘧B(tài)。這種染料脫色后又復(fù)色的現(xiàn)象可能在實(shí)際應(yīng)用過程中影響人們對(duì)生物脫色處理效果的判斷。

1　材料和方法

1.1 材料和儀器設(shè)備

（1）主要實(shí)驗(yàn)材料 本文選用染料為活性黑 5（reactive black 5，RB5）SIGMA-ALORICH公司生產(chǎn)雙偶氮類酸性染料，染料分子式為C26H25N5O19S6·4Na，相對(duì)分子質(zhì)量為991.82，熔點(diǎn)為300℃。特征波長(zhǎng)λmax=597nm，分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

（2）培養(yǎng)基 無(wú)水硫酸鈉 0.5g/L，氯化銨0.2g/L，磷酸二氫鉀2.66g/L，酵母提取物3g/L，染料0.05～0.40g/L。培養(yǎng)基均在1×105Pa滅菌20min后冷卻備用。

圖1　活性黑5的化學(xué)結(jié)構(gòu)

（3）主要儀器設(shè)備 微量紫外可見分光光度計(jì)，IMPLEN，德國(guó) Implen GmbH；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，7890A/5975C，美國(guó)Agilent Technologies；傅里葉紅外光譜儀，Nicolet 6700，美國(guó)Thermo Fisher。

1.2 研究方法

（1）脫色菌群的分離篩選過程 從本實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行良好的印染廢水水解酸化反應(yīng)器取新鮮活性污泥10mL至含90mL富集培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于35℃下恒溫培養(yǎng)24h。以未加菌液的富集培養(yǎng)基為空白對(duì)照，用分光光度法測(cè)定培養(yǎng)液的OD600值。當(dāng)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)大于108個(gè)/mL，且OD600在1.5左右時(shí)，對(duì)其用馴化培養(yǎng)基在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行梯度濃度壓力的馴化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35℃，待脫色率達(dá)到80%以上，則重新轉(zhuǎn)至富集培養(yǎng)基中，24h后轉(zhuǎn)入下一瓶馴化培養(yǎng)基中，并逐步增加馴化培養(yǎng)基中染料的質(zhì)量濃度，其質(zhì)量濃度梯度依次為50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L、400mg/L，直至其對(duì)400mg/L活性黑5脫色率能保持80%以上，則富集馴化培養(yǎng)結(jié)束。通過此過程獲得了對(duì)活性黑5具有良好脫色性能的混合菌群DDMY1。

（2）兼氧脫色活性黑5過程 用2mL無(wú)色離心管作為培養(yǎng)容器，接種10%菌液，然后加入10g/L的活性黑5母液80μL，最后加入培養(yǎng)基1720μL，培養(yǎng)液總體為2mL，蓋上離心管蓋密封（2mL離心管實(shí)際體積略大于2mL，培養(yǎng)體系中有一小部分空氣，并沒有完全厭氧，而是兼氧環(huán)境），于 35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，染料+培養(yǎng)基、染料+超純水、染料+10%菌液+超純水，每組染料濃度均為 400mg/L，每組設(shè)置 10個(gè)平行樣。每隔24h，觀察顏色并檢測(cè)特征峰吸光度值，計(jì)算脫色率。

（3）復(fù)色、再脫色過程 每隔24h后，離心管內(nèi)活性黑5被脫色為淺黃色，此時(shí)將離心管從培養(yǎng)箱中取出，在超凈臺(tái)內(nèi)，打開離心管蓋子，讓脫色后的染料溶液暴露在空氣中約3s，目的是讓新鮮空氣替換離心管內(nèi)原有的微量氣體。然后立刻蓋上離心管蓋子，用力搖勻離心管，搖晃的時(shí)間長(zhǎng)短不同表示新鮮空氣與溶液的混合均勻程度的不同，搖晃時(shí)間越長(zhǎng)，混合越均勻，猛烈搖晃約3s，即可明顯觀察到淺黃色溶液迅速變色成深藍(lán)色，蓋上離心管蓋后，重新放回培養(yǎng)箱中，24h后即可再次完成脫色。

（4）紫外-可見全波長(zhǎng)掃描并計(jì)算脫色率 把裝有脫色液的2mL離心管以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心 10min后，對(duì)上清液進(jìn)行 200～800nm范圍的紫外-可見全波長(zhǎng)掃描，獲得脫色后的特征峰值，A597。其余對(duì)照組稀釋20倍后掃描全波長(zhǎng)，并得到特征峰值；脫色液復(fù)色后，用超純水稀釋20倍后掃描全波長(zhǎng)，得到特征峰值。其脫色率根據(jù)式（1）計(jì)算，并以此來表示菌群的脫色能力。

式中，Ad為脫色率；A0為染料溶液脫色前在597nm的吸光度值；At為染料溶液脫色后在597nm的吸光度值。

（5）GC-MS法檢測(cè)復(fù)色后產(chǎn)物 取100mL復(fù)色液以1000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，之后用二氯甲烷以40mL、30mL、30mL液液萃取3次，將萃取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用 5mL二氯甲烷溶解后，通過0.22μm濾膜，轉(zhuǎn)移入氣相色譜樣品瓶待測(cè)。GC-MS分析：以氦氣（He）為載氣，流速為1.0mL/min，樣品進(jìn)樣量為 1μL，進(jìn)樣口溫度為280℃。產(chǎn)物鑒定通過與 GC-MS機(jī)器軟件內(nèi)部的標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)（NIST08）進(jìn)行比對(duì)分析。GC-MS分析測(cè)定的升溫程序如下：初始溫度80℃，保持10min；接著以10℃/min的速率升溫至280℃，保持7min。

（6）FTIR法檢測(cè)復(fù)色后產(chǎn)物 萃取方法同實(shí)驗(yàn)方法中步驟（5），萃取后得到的溶液經(jīng)氮?dú)獯蹈沙煞勰?，放在NICOLET 6700型（Thermo，美國(guó)）FTIR光譜儀上進(jìn)行分析，掃描范圍為 4000～600cm-1。測(cè)定特征譜帶的吸光度變化。

（7）高通量測(cè)序 從培養(yǎng) 24h的富集培養(yǎng)基中取10mL菌液，交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

2　結(jié)果與討論

2.1 脫色菌群的篩選及脫色性能

經(jīng)過100代傳代馴化后，篩選得到了對(duì)活性黑5具有良好脫色性能的混合菌群 DDMY1?；旌暇簩?duì)400mg/L濃度的染料于35℃恒溫培養(yǎng)24h后，脫色效果見圖2。

從圖2可以明顯看到，混合菌群DDMY1對(duì)活性黑5的兼氧脫色效果十分顯著，活性黑5本色為深黑色，色度極大，而經(jīng)過混合菌群DDMY1的兼氧脫色之后，脫色液呈現(xiàn)淺黃色（如圖 2中 RJP1所示），色度大幅度降低，從表觀達(dá)到去除色度的作用。通過紫外-可見光全波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定特征波長(zhǎng)處吸光值，運(yùn)用公式（1）計(jì)算求得脫色率為97.4%，明顯高于已報(bào)道的對(duì)活性黑 5具有脫色能力的菌株，如范鳳霞等［24］的混合菌群FF對(duì)200mg/L活性黑5的24h脫色率為94%，陳剛等［25］的菌株GY-1對(duì)50mg/L活性黑5的30h脫色率僅為85.9%。然而，打開離心管蓋接觸空氣后，脫色液迅速變色為深藍(lán)色，色度又明顯增加，但并沒有加深至原來活性黑5的色度，而且呈現(xiàn)的深藍(lán)色也與活性黑5的顏色不同，此時(shí)的脫色率仍有73.7%（如圖2中RJP2所示）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)了一種染料活性黑5脫色后又能復(fù)色的現(xiàn)象。此現(xiàn)象鮮有報(bào)道，目前僅有MOHANTY等［26］在對(duì)活性黑5的細(xì)菌脫色實(shí)驗(yàn)中提到過這個(gè)現(xiàn)象，但他們并沒有作進(jìn)一步深入的探究。

圖2　混合菌群DDMY1兼氧脫色活性黑5效果圖

通過高通量測(cè)序方法對(duì)該菌群群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，結(jié)果如圖3所示。

結(jié)果檢測(cè)到混合菌群DDMY1主要包括變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）類細(xì)菌，共7個(gè)菌屬的細(xì)菌。從圖3可以明顯看出，混合菌群中變形菌門細(xì)菌，尤其是變形菌門中的假單胞菌目占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，而假單胞菌對(duì)印染廢水具有高效降解能力已被廣泛報(bào)道［27-28］，其中檢測(cè)到的銅綠假單胞菌（Pseudomonas）已經(jīng)被報(bào)道有特異性的偶氮還原酶［29］，能夠高效斷裂偶氮鍵。另外，菌群中占比較少的克雷伯氏菌（Klebsiella）［30］和嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas）［31］等也經(jīng)常在廢水處理過程中被檢測(cè)到。推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中對(duì)活性黑5的脫色應(yīng)當(dāng)是以假單胞菌為主導(dǎo)的，各種其他菌屬細(xì)菌協(xié)作的復(fù)雜過程。

圖3　混合菌群在門、屬分類水平的結(jié)構(gòu)圖

2.2 反復(fù)脫色、復(fù)色現(xiàn)象

2.2.1 反復(fù)脫色、復(fù)色現(xiàn)象的記錄和描述

混合菌群DDMY1在兼氧條件下，能對(duì)活性黑5具有高效的脫色效率，24h脫色率均能穩(wěn)定達(dá)到97%以上，但是，當(dāng)脫色液接觸到空氣數(shù)秒后，即刻發(fā)生復(fù)色現(xiàn)象。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)染料初次被脫色至淺黃色需要約 24h，打開離心管蓋暴露于空氣中3s后，蓋上離心管蓋搖勻，約 3s可觀察到復(fù)色現(xiàn)象，復(fù)色之后的離心管重新放回恒溫培養(yǎng)箱中，經(jīng)過觀察，約8h后，可以再次脫色至淺黃色。實(shí)驗(yàn)中每隔 24h，開蓋使其復(fù)色。定義每次復(fù)色、脫色為一個(gè)周期，根據(jù)觀察，從0時(shí)刻至最終失去脫色能力，一共經(jīng)歷 18個(gè)周期，即可反復(fù)脫色、復(fù)色共18次，最終失去脫色能力后離心管內(nèi)溶液保持復(fù)色后的狀態(tài)。在整個(gè)過程里，每24h測(cè)定復(fù)色后培養(yǎng)液的紫外-可見光全波長(zhǎng)光譜，并進(jìn)行產(chǎn)物分析。在本文中以0天，5天，10天以及最終狀態(tài)時(shí)的培養(yǎng)液的脫色、復(fù)色效果圖為代表，見圖 4，其余時(shí)刻現(xiàn)象與此類似，未一一列出。

整個(gè)過程長(zhǎng)達(dá)18個(gè)周期，即從初始時(shí)刻至最終無(wú)法脫色歷時(shí)18天，期間17次脫色與復(fù)色，從顏色上觀察基本一致。推測(cè)脫色后的某組分具有較強(qiáng)還原性，每次打開蓋子后，可能是空氣中的氧氣將其氧化而變成深藍(lán)色。復(fù)色后的溶液重新密封培養(yǎng)8h后，再次脫色，推測(cè)可能是由于菌群在兼氧的環(huán)境下能將其重新還原。因此，淺黃色和深藍(lán)色應(yīng)該是該組分的還原態(tài)與氧化態(tài)，并且能夠相互轉(zhuǎn)化。而能夠反復(fù)出現(xiàn)17次，至第18天時(shí)脫色復(fù)色現(xiàn)象消失，恒定保持在復(fù)色狀態(tài)。為了確定是菌群的作用而引起該脫色、復(fù)色現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)曾將初次復(fù)色后的溶液高速離心，去除菌群，然后把呈復(fù)色狀態(tài)的上清液重新密封，于原來的培養(yǎng)條件下放置 10天，10天內(nèi)任何時(shí)刻均無(wú)重新脫色，故認(rèn)為是菌群DDMY1的生化作用導(dǎo)致復(fù)色液的重新脫色。在本實(shí)驗(yàn)上述的18個(gè)周期內(nèi)，不對(duì)反應(yīng)體系補(bǔ)充任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線［32］規(guī)律，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)將逐漸消耗殆盡，并且受代謝產(chǎn)物及空間大小等因素限制，細(xì)菌將逐漸進(jìn)入衰亡期，菌體數(shù)量將逐漸減少。陳剛［33］曾獲得一株對(duì)活性黑5具有高效降解能力的腸桿菌，研究表明，該菌株在培養(yǎng)20h以后即進(jìn)入衰亡期，菌體數(shù)量開始大幅減少，30h后培養(yǎng)液中菌體數(shù)量極低，并會(huì)按照生長(zhǎng)曲線規(guī)律繼續(xù)降低。因此推測(cè)，本實(shí)驗(yàn)18天時(shí)，離心管中細(xì)菌基本衰亡殆盡，不能提供足夠的生化作用對(duì)復(fù)色液進(jìn)行脫色，導(dǎo)致循環(huán)終止。

2.2.2 漸變的復(fù)色過程

復(fù)色的速度極其迅速，打開離心管蓋后，氣液兩相界面自動(dòng)開始發(fā)生復(fù)色現(xiàn)象，蓋上蓋子后，將進(jìn)入離心管上部的少量空氣與溶液搖勻，即發(fā)生均勻的復(fù)色，且復(fù)色后顏色的深淺與搖勻的程度有關(guān)，搖勻約 3s后，溶液復(fù)色至最終的深藍(lán)色，如圖 5所示。從圖5（a）可以看出，搖晃時(shí)間從1～3s，復(fù)色呈現(xiàn)的色度隨之加深，說明復(fù)色現(xiàn)象與脫色液、空氣混勻程度有關(guān)系，即再次證明，空氣中的某種氣體與復(fù)色有關(guān)，該氣體與脫色液混合越均勻，復(fù)色液的顏色就越深。從圖5（b）可知，即使初始搖晃時(shí)間長(zhǎng)短不一，但當(dāng)放置 3min及更長(zhǎng)時(shí)間后，離心管內(nèi)空氣會(huì)自動(dòng)與溶液徹底混勻，此時(shí)與初始搖晃時(shí)間長(zhǎng)短無(wú)關(guān)，最終復(fù)色后的 C、D、E、F，這 4只離心管內(nèi)溶液色度基本一致，而每只離心管內(nèi)存在的空氣量是基本一致的。因此，推測(cè)復(fù)色后最終色度與溶液的量與空氣的量有關(guān)。另外，從圖5（c）可以看到，在溶液與離心管頂部空氣兩相交界面上，溶液顏色逐步加深，由亨利定律［34］可知，這是空氣中某氣體組分向液相內(nèi)分配導(dǎo)致，而經(jīng)過24h兼氧培養(yǎng)，離心管內(nèi)的溶解氧被細(xì)菌消耗而大量減少。因此，推測(cè)應(yīng)該是空氣中的氧氣向液相分配，并與脫色液中某成分發(fā)生了氧化還原反應(yīng)造成此復(fù)色現(xiàn)象。

2.3 多種方法對(duì)脫色液、復(fù)色液進(jìn)行產(chǎn)物分析

2.3.1 紫外-可見分光光度法

用紫外-可見全波長(zhǎng)分光光度計(jì)分別測(cè)定純?nèi)玖先芤骸⑴囵B(yǎng)0h的溶液、培養(yǎng)24h后的脫色液以及培養(yǎng)24h后復(fù)色液的全波長(zhǎng)光譜，測(cè)定結(jié)果如圖6所示。

圖4　反復(fù)脫色、復(fù)色過程

圖5　混勻程度不同時(shí)的復(fù)色漸變過程

由于各組溶液直接測(cè)定全波長(zhǎng)時(shí)，300nm以下測(cè)定，但脫色液稀釋過程也會(huì)復(fù)色，因此，只能直接測(cè)定全波長(zhǎng)并將300nm以下部分截去。由圖6可知，脫色前活性黑5在597nm處有明顯的特征峰值，24h后，脫色液中該特征峰消失，復(fù)色液中該特征峰強(qiáng)度極弱，此外復(fù)色液在紫外區(qū)262nm處吸收峰明顯增大。上述現(xiàn)象表明，在活性黑5的脫色過程中，顯色基團(tuán)—偶氮鍵發(fā)生斷裂，生成新的物質(zhì)，比如芳香胺。而峰值在262nm附近正是芳環(huán)的紫外吸收特性，與SAGARIKA等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似［35］。

圖6　活性黑5的0h及24h培養(yǎng)液的紫外-可見全波長(zhǎng)光譜

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，共有18個(gè)周期，17次發(fā)生脫色-復(fù)色現(xiàn)象。本文測(cè)定了每個(gè)周期的復(fù)色液的紫外可見光全波長(zhǎng)光譜，見圖7。對(duì)圖7的分析可知，24h后，在活性黑5特征波長(zhǎng)597nm光譜基本一致，說明復(fù)色液的色度、降解產(chǎn)物組成在17天內(nèi)是幾乎一致的，即降解產(chǎn)物中顯色的物質(zhì)已經(jīng)無(wú)法被混合菌群DDMY1進(jìn)一步降解，因此脫色、復(fù)色可看作是一種穩(wěn)定的循環(huán)過程，而該現(xiàn)象還未見有關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道。

2.3.2 FTIR分析

由于一旦接觸空氣，脫色液即發(fā)生復(fù)色現(xiàn)象，因此未能對(duì)脫色液進(jìn)行FTIR分析，本文僅對(duì)48h時(shí)刻的復(fù)色液進(jìn)行了 FTIR 檢測(cè)。測(cè)試結(jié)果見圖8。

圖7　不同時(shí)刻復(fù)色液紫外-可見光全波長(zhǎng)光譜

圖8　復(fù)色液FTIR圖譜

圖8中，1578cm-1和1515cm-1處的峰代表的是苯環(huán)上的 C==C伸縮振動(dòng)，說明有苯環(huán)存在，3380cm-1處的峰是芳香仲胺的伸縮振動(dòng)，說明有偶氮鍵發(fā)生斷裂，1000～1300cm-1是C—O的伸縮振動(dòng)，吸收位置變化很大，但能引起很強(qiáng)的紅外吸收，因此這個(gè)范圍內(nèi)有2個(gè)強(qiáng)烈的吸收峰，說明—C—O—的存在。1635cm-1和1150cm-1處出現(xiàn)的峰代表的是羧酸中C==O和C—O的伸縮振動(dòng)，說明降解過程中出現(xiàn)酸化。1243cm-1處的峰是芳香醚結(jié)構(gòu)的伸縮振動(dòng)，2857cm-1處的峰CH2對(duì)稱伸縮振動(dòng)，2924cm-1處的峰是—CH2不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，719cm-1處的峰是—（CH2）n—（n＞4）的平面搖擺振動(dòng)。1150cm-1處吸收峰大幅下降，說明脫色效果顯著，脫色率經(jīng)計(jì)算為在 17天內(nèi)，每次復(fù)色后的全波長(zhǎng)掃描處的峰是—SO伸縮振動(dòng)，629cm-1表明了含硫基團(tuán)的存在。675～900cm-1低頻率處中等的吸收峰表明有多環(huán)芳烴在，推測(cè)應(yīng)當(dāng)是萘環(huán)結(jié)構(gòu)，1595cm-1處的峰指出—NH3+的存在［36］。1486cm-1處的峰是—NO鍵的伸縮振動(dòng)，1297cm-1是芳香胺上—CN伸縮振動(dòng)［37］。從FTIR光譜分析結(jié)果可以看出，至少有部分偶氮鍵被打開，形成了芳香胺類無(wú)色物質(zhì)，這被認(rèn)為是兼氧還原的主要過程，此外還有一些酰胺類物質(zhì)，并且在兼氧過程中產(chǎn)生羧酸以及醚類和具有萘環(huán)的物質(zhì)，說明兼氧過程并不能徹底將染料分子礦化［38］。

2.3.3 GC-MS分析

本文對(duì)48h時(shí)刻的復(fù)色液進(jìn)行了GC-MS檢測(cè)。測(cè)試結(jié)果見表1。

表1　復(fù)色液中成分GC-MS分析

本文通過GC-MS檢測(cè)到多種物質(zhì)，檢測(cè)到的組分與FTIR測(cè)定結(jié)果基本吻合，包括了菌群生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的產(chǎn)物，其中含有芳環(huán)或酰胺結(jié)構(gòu)的物質(zhì)可能就是活性黑 5的代謝產(chǎn)物，如 3-methylindole、N-（3-chlorophenyl）butanamide、4-methylphenol等。偶氮染料厭氧降解通常會(huì)有苯胺類物質(zhì)產(chǎn)生，如在KSHAMA等［39］的厭氧-好氧序批式處理紡織工業(yè)廢水的實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)到芳香胺類物質(zhì)，雖然本文中并未直接檢測(cè)到苯胺類物質(zhì)的存在，但有苯酰胺類存在，推測(cè)應(yīng)當(dāng)是偶氮鍵斷裂后形成苯胺類物質(zhì)，之后在細(xì)菌胞內(nèi)某種代謝途徑下與小分子有機(jī)酸發(fā)生酰基化。如本文中檢測(cè)到的 N-（3-chlorophenyl）butanamide，其可能的代謝途徑如圖9。

2.4 混合菌群DDMY1對(duì)活性黑5脫色、復(fù)色機(jī)理推測(cè)

偶氮染料厭氧還原的研究已經(jīng)有很多報(bào)道。通常認(rèn)為，偶氮染料分子在厭氧或微氧狀態(tài)下易被細(xì)菌還原［40］，而還原的機(jī)理通常認(rèn)為是依賴黃素酶的非特異性還原［41-42］，由于偶氮分子的極性和空間位阻較大，因此無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)［43］，而是通過氧化還原介體完成的還原反應(yīng)［44］，因此，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)活性黑5的兼氧還原過程也應(yīng)該與此相似，通過氧化還原介體在胞外完成偶氮鍵的斷鍵，實(shí)現(xiàn)脫色。而實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的復(fù)色現(xiàn)象，應(yīng)當(dāng)是活性黑5的兼氧降解的某種產(chǎn)物與空氣的反應(yīng)。本文推測(cè)，復(fù)色現(xiàn)象本質(zhì)上很可能是空氣中的氧氣參與的氧化還原反應(yīng)，被氧化的物質(zhì)是活性黑5的兼氧降解的某種產(chǎn)物。推測(cè)可能原因有兩種：第一種可能，是部分染料分子的偶氮鍵不完全氧化斷裂偶氮雙鍵中的一根，造成假脫色現(xiàn)象，而其氧化還原電位可能較低，因此一遇到氧氣就會(huì)復(fù)原成偶氮雙鍵，使培養(yǎng)液重新呈現(xiàn)深藍(lán)色［26］；第二種可能，芳香胺類物質(zhì)自氧化，形成醌型結(jié)構(gòu)［45-46］，尤其是有鄰羥基的萘胺，普遍對(duì)氧敏感，具有自氧化特性［47］，而醌型結(jié)構(gòu)就是一種發(fā)色基團(tuán)，如果環(huán)上還有取代基助色，物質(zhì)就會(huì)顯深色。KUDLICH等［48］對(duì)幾種磺化偶氮染料厭氧降解的產(chǎn)物進(jìn)行HPLC-MS監(jiān)測(cè)氧化過程的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)活性黑5的實(shí)驗(yàn)表明，活性黑5厭氧降解產(chǎn)生了 1,2,7-三氨基-8-羥基萘-3,6-二磺酸鈉，即TAHNDS，它是淺黃色的，而其對(duì)氧氣特別敏感，非常容易自發(fā)地脫去2個(gè)氫離子，形成一個(gè)中間過渡態(tài)物質(zhì) AP1TAHNDS，隨后又進(jìn)一步氧化成AP2TAHNDS，其氧化過程如圖10所示。

而且他們發(fā)現(xiàn)，AP2TAHNDS在氧氣能穩(wěn)定存在，不再被進(jìn)一步氧化，并且觀察到它是深藍(lán)色的，與本文觀察到的現(xiàn)象也比較符合。無(wú)論發(fā)生復(fù)色脫色的是以上哪種物質(zhì)，它都具有氧化型（深藍(lán)色）和還原型（淺黃色）兩種形態(tài)。復(fù)色只需要幾秒，而脫色需要8h，說明脫色是菌群活動(dòng)產(chǎn)生的結(jié)果。因此，推測(cè)在兼氧狀態(tài)下，該物質(zhì)可通過菌群再次獲得氫質(zhì)子和電子重新還原成淺色物質(zhì)，這個(gè)過程與偶氮鍵還原機(jī)制［49］可能相同，如圖11所示。

細(xì)菌胞內(nèi)代謝推動(dòng)NADH的循環(huán)再生機(jī)制，通過某種氧化還原介體將NADH、H+的電子和氫質(zhì)子傳遞給氧化態(tài)物質(zhì)，使其還原。當(dāng)引入新鮮空氣后，氧氣與還原態(tài)物質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，奪去2個(gè)氫，將其變成氧化型。之后，反復(fù)進(jìn)行氧化還原的循環(huán)，直至最終培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡，細(xì)胞凋亡，無(wú)法提供還原力而保持氧化態(tài)。

3　結(jié)　論

圖9　酰胺來源推測(cè)反應(yīng)式

圖10　TAHNDS暴露于空氣時(shí)的氧化過程［48］

圖11　脫色、復(fù)色循環(huán)機(jī)制推測(cè)

本研究篩選到一個(gè)混合菌群 DDMY1，對(duì) 400 mg/L濃度的偶氮染料活性黑5進(jìn)行脫色，24h脫色率能達(dá)到97.4%。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)脫色液具有一個(gè)反復(fù)脫色、復(fù)色的新現(xiàn)象。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，復(fù)色現(xiàn)象是由于脫色液被空氣中的氧氣氧化導(dǎo)致的，而重新脫色是通過菌群的生化作用而被重新還原。通過UV-Vis、GC-MS和FTIR對(duì)脫色液進(jìn)行了成分分析，檢測(cè)到的含有芳環(huán)和酰胺結(jié)構(gòu)的物質(zhì)可能是活性黑5的生物降解產(chǎn)物。結(jié)合染料分子結(jié)構(gòu)和相關(guān)文獻(xiàn)推測(cè)，實(shí)驗(yàn)中可反復(fù)發(fā)生脫色、復(fù)色現(xiàn)象的物質(zhì)可能是芳香胺類物質(zhì)自氧化形成的醌型結(jié)構(gòu)物質(zhì)如AP2TAHNDS，并進(jìn)一步推導(dǎo)了兼氧狀態(tài)下混合菌群DDMY1對(duì)活性黑5反復(fù)脫色、復(fù)色的機(jī)理，認(rèn)為這個(gè)過程與偶氮染料偶氮鍵還原機(jī)制可能相同，最終當(dāng)菌群凋亡后，這個(gè)循環(huán)終止，脫色液保持復(fù)色狀態(tài)。對(duì)于脫色、復(fù)色過程中的具體物質(zhì)有待進(jìn)一步檢測(cè)確定。

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Decolorization and repigmentation of reactive black 5 biodegradation and their mechanisms

YU Chengzhi1,2，XIE Xuehui1,2，ZHENG Xiulin1,2，XU Leyi1,2，LI Ran1,2，LIU Jianshe1,2
（1College of Environmental Science and Engineering，Donghua University，Shanghai 201620，China；2State Environmental Protection Engineering Center for Pollution Treatment and Control in Textile Industry，Shanghai 201620，China）

Wastewater from printing and dyeing industrials is still a severe problem，and biological treatment is the most widely used method currently，for which screening high efficient dye biodegradation microorganisms is the key.In this paper，by using the concentration gradient pressure screening method，we selected a mixed bacterial flora DDMY1，which has good decolorization performance to reactive black 5（RB5），from the well-running hydrolytic acidification reactor for subsequent printing and dyeing wastewater treatment.The bacterial flora was used to study the RB5 decolorization under the facultative-aerobic condition.Firstly，photos were taken in the process of decolorization and repigmentation to record the repeated results visually.Secondly，ultraviolet-visible spectrophotometry was used to scan the decoloring liquid at different times and different states.At last，GC-MS（Gas Chromatography-Mass Spectrometer）and FTIR（Fourier Transform Infrared Spectroscopy）were employed to analyze the degradation products.Results indicated that，the mixed flora DDMY1 performed satisfatorily in decoloring of RB5，and with 400mg/L RB5 for 24h cultivation，thedecolorization rate could reach 97.4%.At the same time，the study found that the biological oxygen decolorization reaction could effectively repeat the decolorization-repigmentation for 17 times.According to the analysis results of the tests，it could be speculated that RB5 degradation products such as aniline，naphthoquinones might be responsible.

bacterial consortium；biological decoloring；reactive black 5；redox

X 172

A

1000-6613（2016）09-2987-10

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.09.048

2016-03-28；修改稿日期：2016-04-28。

國(guó)家自然科學(xué)基金（21377023，51508083）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（2232015D3-22）及上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（B604）。

俞承志（1994—），男，本科生，從事水處理及環(huán)境微生物研究。聯(lián)系人：謝學(xué)輝，講師，從事環(huán)境微生物研究。E-mail xiexuehui@dhu.edu.cn。柳建設(shè)，教授，從事環(huán)境生物技術(shù)研究。E-mail liujianshe@dhu.edu.cn。