李向永，姜　龍，王薪淇，景桂昕，邢　政，鄧昆鵬，趙仁貴

( 吉林農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，吉林 長春 130118)

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糯玉米單倍體誘導和加倍的研究

李向永，姜龍，王薪淇，景桂昕，邢政，鄧昆鵬，趙仁貴

( 吉林農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，吉林 長春 130118)

【目的】 探索單倍體誘導系在糯玉米單倍體育種應用中的可能性及適宜的糯玉米單倍體誘導和加倍方法，以加快我國糯玉米育種進程，提高糯玉米育種效率?！痉椒ā?誘導試驗中以吉林農(nóng)業(yè)大學選育的5個誘導系(HG1-HG5)作為誘導材料對不同糯玉米母本材料進行誘導，比較不同花絲長度、授粉時期和果穗部位對糯玉米單倍體誘導率的影響；加倍試驗中，以秋水仙素作為糯玉米單倍體人工染色體加倍藥劑，采取4 種(浸種法、浸芽法、滴心葉法、針刺生長點法)處理方法，每種方法設(shè)置3個秋水仙素質(zhì)量濃度梯度(0.3，0.5 和0.7 mg/mL)并輔以2.5%二甲基亞砜(DMSO)作為助滲劑，篩選適宜的糯玉米單倍體加倍方法。【結(jié)果】 誘導試驗結(jié)果表明，延遲授粉(花絲長度≥8 cm)單倍體誘導率均值為17.9%，約為正常授粉(花絲長度≤4 cm)條件下的2.9倍；伏后授粉單倍體誘導率均值為19.4%，約為伏期授粉的3.1倍；果穗頂部的誘導率(6.87%)高于底部(5.61%)。加倍試驗結(jié)果表明，浸種法對植株傷害較嚴重，存活率低于50%；針刺生長點法(0.7 mg/mL)和滴心葉法(0.5 mg/mL)的散粉率較高(45.9%，28.9%)，相應的結(jié)實率也較高(15.2%，11.1%)，說明針刺生長點法處理效果最好，滴心葉法次之?！窘Y(jié)論】 糯玉米單倍體育種能提高糯玉米育種效率。

糯玉米；單倍體誘導率；單倍體加倍率

糯玉米(ZeamaysL.ceratina Kulesh)是起源于中國的一個玉米亞種，它的胚乳直鏈淀粉極端降低甚至缺失，這是由第9號染色體基因wx控制[1]。糯玉米又叫蠟質(zhì)玉米，因為其籽粒成熟干燥后，呈現(xiàn)不透明角質(zhì)、磨砂蠟型胚乳，煮熟后的味道黏，也被稱為黏玉米。鮮食糯玉米營養(yǎng)豐富、口感好，越來越受到人們的關(guān)注和喜愛，在我國已發(fā)展成為一項新興產(chǎn)業(yè)。大量的研究表明，鮮食糯玉米具有良好的營養(yǎng)和保健價值，為保健的“黃金食品”，使其作為主食谷物的可行性增強，進而掀起了糯玉米育種的熱潮[2]。我國的糯玉米種質(zhì)資源豐富，但是對于糯玉米的研究起步較晚，育種者對種質(zhì)資源的了解程度不夠，對大量的種質(zhì)資源缺乏有效的鑒定、篩選和評價，從而造成糯玉米田間常規(guī)育種工作量大、組合組配盲目性高、育種效率比較低。

基于孤雌生殖誘導的單倍體技術(shù)可大大縮短玉米選系時間，僅需2代即可獲得DH(Doubled Haploid)系，提高了育種效率。因此，國內(nèi)外各大公司、科研院所和高等院校相繼開展了玉米DH育種，以加速培育優(yōu)良自交系、育成新品種步伐，并應用于玉米育種實踐。然而玉米DH育種受兩個因素所限制：一是難以獲得足夠數(shù)量的單倍體，即單倍體誘導率低，Stock6僅為1.14%[3-4]；二是單倍體二倍化時困難，即加倍率低，目前加倍率達10%以上是很難實現(xiàn)的[5-7]?，F(xiàn)如今，單倍體技術(shù)已成為國內(nèi)外普通玉米的主流選系技術(shù)，但目前關(guān)于采用單倍體技術(shù)選育糯玉米自交系，并應用于糯玉米單倍體育種的相關(guān)研究卻罕見報道。鑒于此，(1)本研究以吉林農(nóng)業(yè)大學特用玉米育種組選育的玉米單倍體誘導率10%以上、遺傳標記明顯、花粉量大、持粉時間長、抗病性好的新型誘導系HG1-HG5為父本，以高抗絲黑穗病糯玉米自交系京糯6和高感絲黑穗病糯玉米自交系浚白34的雜交F1代及5個糯玉米雜交種作為母本材料，雜交誘導產(chǎn)生單倍體，探討了不同誘導因素下糯玉米單倍體誘導率的變化特點，以期為提高誘導系的誘導效率、充分發(fā)揮誘導系的誘導效能提供理論依據(jù)；(2)以秋水仙素作為糯玉米單倍體人工染色體加倍藥劑，采取4 種(浸種法、浸芽法、滴心葉法、針刺生長點法)處理方法，每種方法設(shè)置3個質(zhì)量濃度梯度(0.3，0.5 和0.7 mg/mL)并輔以2.5%二甲基亞砜(DMSO)作為助滲劑，進一步探討糯玉米單倍體加倍技術(shù)，對糯玉米單倍體育種進行初步探索，以期加快我國糯玉米育種進程，提高糯玉米育種效率。

1　材料與方法

1.1雜交誘導試驗

(1)以高抗絲黑穗病糯玉米自交系京糯6和高感絲黑穗病糯玉米自交系浚白34的雜交F1代為母本，以吉林農(nóng)業(yè)大學特用玉米育種組選育的5個新型誘導系HG1-HG5作為父本，于2014年在吉林農(nóng)業(yè)大學特用玉米育種基地(長春)雜交誘導單倍體。試驗設(shè)置花絲長短和授粉時期2個因素?；ńz長短設(shè)2個處理：在長花絲(≥8 cm)和短花絲(≤4 cm)條件下用誘導系授粉；授粉時期設(shè)2個處理：伏期(07-15-08-01) 和伏后(08-15-09-01)授粉。用于研究的母本材料分別于2013年5月中旬和6月上旬播種(錯期播種以利于試驗進行)。

(2)選用5個糯玉米雜交種吉白糯155、吉香糯187、京科糯2000、吉糯288、吉糯420作為母本，以誘導系HG1作父本，于2013年11月種植于吉林農(nóng)業(yè)大學特用玉米育種基地(三亞)，雜交誘導各雜交種30穗，收獲后選擇結(jié)實性好的果穗，按底部(約為果穗長度的1/2)和頂部(約為果穗長度的1/2)分開脫粒。

上述試驗中父母本材料及血緣見表1。根據(jù)Chase[8]提出的遺傳標記法，即胚乳糊粉層呈現(xiàn)紫色標記，胚芽部位無色，且胚面較小，凹陷較深的籽粒為準單倍體籽粒，對收獲的雜交種子均逐粒鑒定。根據(jù)雜交當代籽?？偭?shù)和準單倍體籽粒數(shù)，計算單倍體誘導率。

單倍體誘導率=(準單倍體籽粒數(shù)/誘導的總籽粒數(shù))×100%。

表 1　試驗所用玉米雜交種父母本名稱及血緣Table 1　Names and consanguinities of the parents of waxy maize hybrids used in the experment

1.2加倍試驗

試驗于2014年5月在吉林農(nóng)業(yè)大學特用玉米育種基地(長春)進行。加倍藥劑為長春百金生物試劑經(jīng)銷有限公司生產(chǎn)的秋水仙素原藥、2.5%二甲基亞砜(DMSO)。采取浸種法、浸芽法、滴心葉法、針刺生長點法等4種處理方法，每種方法分3個質(zhì)量濃度梯度(0.3，0.5和0.7 mg/mL)[9]。

加倍材料源于試驗1.1節(jié)中雜交誘導產(chǎn)生的糯玉米單倍體，將部分準單倍體均分4等份(各100粒)后根據(jù)不同的秋水仙素加倍處理需求種植田間，去除非單倍體植株。田間觀察單倍體植株成活率、散粉率、結(jié)實率和藥害情況。以糯玉米單倍體植株是否散粉和結(jié)實來判斷是否加倍成功。

計算公式為：

成活率=(成活株數(shù)/總株數(shù))×100%；

散粉率=(散粉株數(shù)/單倍體總株數(shù))×100%；

結(jié)實率=(單倍體自交結(jié)實株數(shù)/單倍體總株數(shù))×100%。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)通過Excel 2007和DPS 7.1軟件進行計算分析[10]。

2　結(jié)果與分析

2.1糯玉米單倍體誘導

2.1.1花絲長度對糯玉米單倍體誘導率的影響從表2可以看出，花絲長度對糯玉米單倍體誘導率有很大影響，花絲長度≥8 cm時的單倍體誘導率均值明顯大于花絲長度≤4 cm時的誘導率均值。在花絲長度≤4 cm時的誘導系中，HG4的誘導率最高(8.8%)；花絲長度≥8 cm時誘導系HG3的誘導率最高(22.0%)。各誘導系長花絲處理糯玉米單倍體的誘導率均高于短花絲處理。

表 2　不同花絲長度授粉糯玉米的單倍體誘導率Table 2　Waxy maize haploid inducing rate for pollination with different silk lengths

對花絲長度與不同誘導系間進行方差分析，結(jié)果見表3。表3結(jié)果表明，誘導系間單倍體誘導率達到顯著水平，花絲長度間單倍體誘導率達到了極顯著水平，說明花絲長度對單倍體誘導率有很大影響，且長花絲條件下授粉可以提高單倍體誘導率。

表 3　花絲長度與不同誘導系間單倍體誘導率的方差分析Table 3　Variance analysis of haploid inducing rate between silk length and inducer

注：*表示達5%顯著相關(guān)水平；**表示達1%極顯著相關(guān)水平。表5同。

Note:* means significant correlation at 5% level;** means extremely significant correlation at 1% level.The same table 5.

2.1.2授粉時期對糯玉米單倍體誘導率的影響由表4可知，授粉時期對糯玉米單倍體誘導率亦有很大影響，伏后授粉的誘導率均值明顯高于伏期授粉的誘導率均值。其中在伏期授粉時，誘導率最高的是誘導系HG4(9.0%)；伏后授粉時誘導率最高的誘導系為HG3(23.6%)。各誘導系伏后授粉糯玉米單倍體誘導率均高于伏期授粉。

表 4　不同授粉時期糯玉米的單倍體誘導率Table 4　Waxy maize haploid inducing rate at different pollinating dates

對授粉時期與不同誘導系間進行方差分析，結(jié)果見表5。表5結(jié)果表明,誘導系間、授粉時期處理間單倍體誘導率均達到了極顯著水平，說明不同授粉時期對單倍體誘導率有很大影響，且伏后授粉可以提高單倍體誘導率。此外，相對于花絲長短，授粉時期對誘導系彼此間的差異影響更大。

表 5　授粉時期與不同誘導系間單倍體誘導率的方差分析Table 5　Variance analysis of haploid inducing rate between pollinating date and inducer

2.1.3果穗不同部位對糯玉米單倍體誘導率的影響糯玉米果穗頂部和底部的單倍體誘導率見表6。

表 6　糯玉米果穗頂部和底部的單倍體誘導率Table 6　Comparison of haploid induction rates between top and bottom parts of ear

由表6可知，吉白糯155、吉香糯187和吉糯288等3個糯玉米雜交種果穗頂部單倍體誘導率均明顯高于底部，頂部和底部單倍體誘導率分別為吉白糯155 (7.93%，5.45%)，吉香糯187(8.05%，5.31%)，吉糯288(8.31%，6.15%)。而京科糯2000和吉糯420頂部的單倍體誘導率低于底部，頂部和底部單倍體誘導率分別為京科糯2000(4.80%，5.02%)，吉糯420(5.72%，6.11%)，但兩部位單倍體誘導率相差不大。綜合5個糯玉米雜交種果穗的頂部與底部來看，果穗頂部的誘導率(6.87%)高于底部(5.61%)。綜合整個果穗單倍體誘導率均值發(fā)現(xiàn)，不同雜交種(不同基礎(chǔ)材料)的單倍體誘導率存在差異，其中吉糯288最高，為 7.23%；京科糯2000最低，為4.91%。

2.2糯玉米單倍體加倍

2.2.1不同加倍方法對糯玉米單倍體植株成活率的影響表7結(jié)果顯示，糯玉米單倍體植株成活率在各處理不同秋水仙素質(zhì)量濃度下均表現(xiàn)不同。滴心葉法中適宜秋水仙素質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL，浸芽法的適宜質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL,針刺生長點法的適宜質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL。在秋水仙素各質(zhì)量濃度梯度下浸種法處理時，糯玉米單倍體植株受害程度都較其他3種方法嚴重，在3種質(zhì)量濃度下存活率分別僅為39.3%，42.2%和25.6%。

表 7　不同質(zhì)量濃度秋水仙素加倍處理糯玉米單倍體的成活情況Table 7　Survival rates of waxy maize haploid plants with different colchicine concentrations

2.2.2不同加倍方法對糯玉米單倍體植株散粉和結(jié)實的影響不同加倍方法對糯玉米單倍體植株散粉和結(jié)實的影響結(jié)果見表8和表9。

表 8　不同質(zhì)量濃度秋水仙素加倍處理糯玉米單倍體的散粉情況Table 8　Fertility rates of waxy maize haploid plants with different colchicine concentrations

表 9　不同質(zhì)量濃度秋水仙素加倍處理糯玉米單倍體的結(jié)實情況Table 9　Seed rates of waxy maize haploids with different colchicine concentrations

由表8和表9可知，在4種加倍方法中，針刺生長點法的效果最好，散粉率均超過10%；在秋水仙素質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL時散粉率達到45.9%，結(jié)實率也最高，為15.2%。滴心葉法在秋水仙素質(zhì)量濃度0.5 mg/mL下散粉率為28.9%，結(jié)實率為 11.1%；浸種法各處理的散粉率均低于10%，在秋水仙素質(zhì)量濃度為0.5和0.7 mg/mL下結(jié)實率都極低(1.1%和1.2%)；浸芽法雖在0.5 mg/mL下散粉率超過10%，但其結(jié)實率卻很低(1.1%)。綜上可以看出，在散粉性和結(jié)實率方面，針刺生長點法和滴心葉法相對較好。

3　討　論

3.1糯玉米單倍體的誘導率

3.1.1單倍體誘導系HG1-HG5的誘導效果自1957年Coe[11]發(fā)現(xiàn)第一個單倍體誘導系Stock6到美籍華人Chang提出玉米DH育種的流程之后[12]，國內(nèi)外各育種單位與機構(gòu)相繼開展玉米DH育種工作。如杜邦先鋒、孟山都等國際公司已經(jīng)大規(guī)模運用玉米DH育種技術(shù)，實現(xiàn)了“工廠化”[13-14]，但在主要技術(shù)上仍存在嚴重缺陷，其中單倍體誘導率低是限制玉米DH育種的瓶頸。吉林農(nóng)業(yè)大學以CAU5為輪回親本，從中選育出單倍體誘導率10%以上、遺傳標記明顯、花粉量大、持粉時間長、抗病性好的新型誘導系HG1-HG5。2013年，本課題組以玉米單倍體誘導系HG1-HG5為材料，研究了誘導系對不同糯玉米基因型材料的誘導效果，結(jié)果表明，HG1-HG5對糯玉米雜交種具有誘導產(chǎn)生單倍體的能力，該誘導系的育成對玉米DH育種將有一定作用。

3.1.2花絲長度、授粉時期的選擇本研究結(jié)果表明，延遲授粉(花絲長度≥8 cm)的單倍體誘導率均值為17.9%，約為正常授粉(花絲長度≤4 cm)條件下的2.9倍，花絲長度對玉米單倍體誘導率造成重要影響的原因可能是隨著花絲的增長，卵核接受精核的能力減弱，極核與精核結(jié)合的能力相對較強，由此導致胚乳正常發(fā)育，而雌配子由于沒有受精而發(fā)育為單倍體。劉志增等[15]研究表明，精核間距在誘導單倍體過程中起重要作用?；ńz長時，從花粉粒萌發(fā)后花粉管到達胚囊距離延長，可能造成兩個精核的間距加大，從而更容易誘導形成單倍體。

伏后授粉(08-15-09-01)的誘導率均值(19.4%)約為伏期授粉(07-15-08-01)均值(6.3%)的3.1倍，說明授粉時期對糯玉米單倍體誘導率有較大影響。授粉時期對單倍體誘導率的影響可能同氣溫有密切關(guān)系。授粉時期早時溫度相對較高，進而促進父本花粉管加速生長，新陳代謝及呼吸作用隨之加強。基于上述條件，父本體內(nèi)能量和物質(zhì)的消耗加快，但此時供給的能量和物質(zhì)不會相應地增加，而對于誘導系的花粉粒來說，本身內(nèi)含物就很少，這種狀況會加速花粉管的衰老，不正?；ǚ鄣母偁幜p弱，繼而導致單倍體產(chǎn)生數(shù)目降低。與之相反，授粉時期晚時溫度相對較低，父本新陳代謝相對較慢，其體內(nèi)不正常花粉粒的兩個精核在花粉管中有充足的時間分開運輸，從而達到單受精產(chǎn)生玉米單倍體的效果。此外，母本花絲在溫度較低時接受花粉的時間延長，也可能增加了單受精的幾率?？紤]到本研究母本基因型較少，有關(guān)溫度、花絲活力和母本基因型等因素對誘導性能的影響仍需進一步研究。

3.1.3果穗不同部位的影響本研究發(fā)現(xiàn)，除京科糯2000和吉糯420頂部的單倍體誘導率與底部差異不大之外，其他糯玉米果穗頂部籽粒的單倍體誘導率均高于底部，這與Sarkar等[16]、Chalyk[17]、Rotarenco等[18]的研究結(jié)果相類似。這可能與卵細胞成熟的不同步、營養(yǎng)功能的變化、某些外界因子的局部影響等，或者所有因素共同起作用相關(guān)。

3.2糯玉米單倍體的加倍率

Chase[19]曾提出用秋水仙素溶液注射普通玉米幼苗的盾片節(jié)進行加倍。Gayen等[20]曾采用浸種法使普通單倍體加倍率達到了18%。魏俊杰等[21]在玉米6葉期和拔節(jié)期用不同質(zhì)量濃度的秋水仙素配以DMSO注射處理普通玉米莖尖生長點，發(fā)現(xiàn)在6葉期，以0.5%秋水仙素配以2.0% DMSO處理效果最好，加倍率高達32.3%。

本試驗利用秋水仙素加倍處理糯玉米單倍體，結(jié)果表明：浸種法對植株傷害較嚴重，成活率低于50%；針刺生長點法(0.7 mg/mL)和滴心葉法(0.5 mg/mL)的散粉率較高(45.9%，28.9%)，相應的結(jié)實率也較高(15.2%，11.1%)，說明針刺生長點法處理效果最好，滴心葉法次之。綜上所述，用針刺生長點法和滴心葉法加倍糯玉米單倍體效果較好，散粉率和結(jié)實率相對較高。

此外，由于秋水仙素對人體毒性很大，而且易對植物造成死苗、畸形等傷害，因此探尋無毒無害的化學試劑等其他加倍方式是今后單倍體染色體加倍研究的重點[22]。

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Haploid inducing and doubling of waxy maize

LI Xiangyong,JIANG Long,WANG Xinqi,JING Guixin,XING Zheng,DENG Kunpeng,ZHAO Rengui

(CollegeofAgronomy,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 The possibility of applying haploid inducing lines in breeding of waxy maize and the suitable inducing and doubling methods were investigated to accelerate the breeding process and improve the breeding efficiency of waxy corn in China.【Method】 Waxy maize haploid inducers (HG1-HG5) released by Jilin Agricultural University were used as male parents to conduct maize haploid inducing test.Waxy maize inducing rates were compared among silk length,pollinating date and parts of ears.Colchicine was used as doubling agent of waxy maize haploid artificial chromosome,2.5% DMSO was used as an auxiliary agent,and four approaches (dipping seed method,dipping bud method,dipping heart leaf method,and acupuncturing growing point method) and three concentration gradients (0.3,0.5 and 0.7 mg/mL) were tested to select suitable doubling method.【Result】 The haploid inducing rate of long silk (≥8 cm) pollination was 17.9% on average,almost 2.9 times of short silk (≤4 cm) pollination.Haploid inducing rate of late summer pollination was 19.4% on average,about 3.1 times of mid-summer pollination.Haploid inducing rate on top of ear (6.87%) was higher than that in bottom (5.61%).Dipping seed and dipping bud methods had the survival rates of less than 50%.Fertile rates of acupuncturing growing point method at 0.7 mg/mL and dipping heart leaf method at 0.5 mg/mL were 45.9% and 28.9% and their seed rates were 15.2% and 11.1%,respectively.Acupuncturing growing point method was the best followed by dipping heart leaf method.【Conclusion】 Application of haploid breeding may improve breeding efficiency of waxy maize.

waxy maize;haploid inducing rate;haploid doubling rate

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-07-1208:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.08.014

2014-12-10

國家星火計劃項目(2011GA660005)；吉林省財政廳科研育種項目(吉財2012002)；長春市科技支撐計劃項目(長科技合2011215號)

李向永(1991-)，男，河南周口人，碩士，主要從事玉米種質(zhì)資源創(chuàng)新與DH育種研究。 E-mail:191732014@qq.com

趙仁貴(1966-)，男，吉林松原人，教授，博士生導師，主要從事特用玉米遺傳育種與新品種選育研究。

E-mail:zhaorengui@sina.com

S513.035.2

A

1671-9387(2016)08-0090-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160712.0845.028.html