張曉茹，李 星，王 彬，王增凱，徐紅艷，*（.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉3300；.延吉秀愛食品有限公司，吉林延吉33000）

紅松松仁膜衣提取物體外抗氧化活性研究

張曉茹1，李 星2，王 彬2，王增凱1，徐紅艷1，*
（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002；2.延吉秀愛食品有限公司，吉林延吉133000）

本文旨在探明長白山紅松松仁膜衣提取物的體外抗氧化活性。分別采用60%乙醇和50%丙酮為提取劑，提取物凍干后，用分光光度法測其總多酚和總黃酮純度，研究其自由基清除能力和還原鐵離子的能力。結(jié)果表明，松仁膜衣乙醇提取物總多酚純度為39.02%，總黃酮純度為10.19%；丙酮提取物總多酚純度為44.09%，總黃酮純度為14.59%。紅松松仁膜衣提取物清除ABTS+·、DPPH·、羥自由基（·OH）的能力和還原鐵離子能力都呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，且對DPPH·的清除作用和還原鐵離子能力強于BHT；丙酮提取物對ABTS+·和·OH的清除能力顯著高于乙醇提取物，表明丙酮提取物的抗氧化能力強于乙醇提取物。同時，在實驗范圍內(nèi)，紅松松仁膜衣提取物的抗氧化能力與其總多酚、總黃酮的純度存在正相關(guān)性。

紅松，松仁膜衣，抗氧化

紅松（Pinus koraiensis），常綠喬木，又名海松、果松、朝鮮松，在我國主要分布在長白山到小興安嶺一帶，常與魚鱗松、臭松、椴樹、樺樹等形成混交林［1］，是東北地區(qū)重要的林業(yè)資源。紅松松仁富含營養(yǎng)物質(zhì)［2］，具有多種生物活性［3］，自古就是食療佳品。紅松松仁膜衣為松科植物紅松松仁外的薄皮，在松仁生產(chǎn)加工過程中，會脫去松仁膜衣，從而產(chǎn)生大量的膜衣廢棄物。目前我國紅松松仁膜衣未得到利用，營養(yǎng)成分特別是生物活性成分及功能作用的相關(guān)研究也未見報道。而俄羅斯產(chǎn)松仁膜衣中含蛋白質(zhì)、脂類、纖維素等營養(yǎng)成分，乙醇浸提物可達(dá)10%左右［4］，且已在焙烤食品中得到應(yīng)用［5］。

酚類化合物和黃酮類化合物都是植物的次生代謝產(chǎn)物，在自然界中儲量豐富。多酚類化合物是一種良好的抗氧化劑［6］，黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中的酚羥基可作為氫供體還原自由基，會終止或減少自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)生［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)，多酚類化合物和黃酮化合物具有的保護心腦血管系統(tǒng)、抗腫瘤、抗病毒以及抗炎抑菌等多種生物活性均與其抗氧化活性密切相關(guān)［9-10］。

本研究以加工紅松松仁產(chǎn)生的廢棄物即松仁膜衣為原料，經(jīng)乙醇、丙酮提取及真空冷凍干燥，制得提取物凍干粉，采用分光光度法測定總多酚和總黃酮純度，并通過建立多個氧化反應(yīng)體系，對其體外抗氧化活性進(jìn)行研究，旨在為紅松松仁膜衣活性成分的深入研究及其綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅松松仁膜衣 由延吉秀愛食品有限公司提供；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所；ABTS ［2，2′-連氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）］、DPPH ［2，2-二（4-叔辛基苯基）-1-苦肼基）］、BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚） Sigma公司；VC國藥集團化學(xué)試劑有限公司；其他試劑 均為分析純。

U-3900型紫外可見分光光度計 日本日立公司；N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；FA1104型分析天平 上海天平儀器廠；LGJ-18A真空冷凍干燥機 北京四環(huán)科學(xué)儀器有限公司；5804R離心機 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 紅松松仁膜衣→粉碎→溶劑提取→減壓濃縮→真空冷凍干燥→松仁膜衣提取物。

1.2.2 松仁膜衣提取物的制備

1.2.2.1 乙醇提取法 參考徐紅艷等［11］的方法，松仁膜衣粉末用60%乙醇提取，料液比為1∶20，60℃水浴5 h，抽濾，提取液減壓濃縮，-40℃、40 Pa、24 h真空冷凍干燥，得到乙醇提取物凍干粉。

1.2.2.2 丙酮提取法 參考湯務(wù)霞等［12］的方法，松仁膜衣粉末用50%丙酮提取，料液比為1∶10，室溫冷浸24 h，抽濾，提取液減壓濃縮，-40℃、40 Pa、24 h真空冷凍干燥，得到丙酮提取物凍干粉。

1.2.3 松仁膜衣提取物純度的測定

1.2.3.1 松仁膜衣提取物中總多酚純度的測定 參考李波等［13］的方法，精確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，加蒸餾水溶解并定容于100 mL容量瓶中，得濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別向7只10 mL容量瓶中加入1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL，加蒸餾水至刻度，分別配制成濃度為0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24 mg/mL的沒食子酸溶液。各吸取1 mL溶液于25 mL容量瓶中，分別加入福林酚試劑2 mL，充分振蕩后靜置4 min，加入10%碳酸鈉溶液10 mL，蒸餾水定容，50℃水浴1 h，測定765 nm處的吸光值。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取一定量的凍干粉并復(fù)溶，按上述方法測定總多酚的濃度，凍干粉的多酚純度計算公式如下：

式中，V為凍干粉復(fù)溶后溶液的體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；C為按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的復(fù)溶溶液的總多酚濃度；m為凍干粉的質(zhì)量（mg）。

1.2.3.2 松仁膜衣提取物中總黃酮純度的測定 采用NaNO2-Al（NO3）3比色法［14］。精密稱取蘆丁對照品20 mg，用少量60%乙醇溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，定容至刻度線。分別精密量取0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL蘆丁溶液置于試管中，加入5%的亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，靜置6 min，加入4%的氫氧化鈉溶液5 mL，搖勻，加入60%乙醇定容至10 mL，靜置25 min，在509 nm波長處測定吸光值，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取一定量的凍干粉并復(fù)溶，按上述方法測黃酮的濃度，凍干粉黃酮的純度計算公式如下：

式中，V為凍干粉復(fù)溶后溶液的體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；C為按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的復(fù)溶溶液的總黃酮濃度；m為凍干粉的質(zhì)量（mg）。

1.2.4 松仁膜衣提取物體外抗氧化活性測定

1.2.4.1 對ABTS+·清除活性測定 在乙醇提取物和丙酮提取物均為10、20、40、80、160 μg/mL，VC10、20、30、40、50 μg/mL，BHT 1、5、25、125 μg/mL時對其ABTS+·清除活性進(jìn)行測定。參照Werf等［15］的方法，略作修改。將2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液50 mL與7.4 mmol/L的ABTS溶液50 mL混合后于室溫避光靜置24 h，配成ABTS儲備液，后4℃避光儲存?zhèn)溆谩，F(xiàn)用時稀釋，使其在734 nm波長下吸光值為0.700±0.020即為ABTS工作液。

取ABTS工作液3.8 mL，加入樣品溶液0.2 mL，室溫下避光放置10 min，在734 nm波長下測A1，以蒸餾水代替ABTS工作液的吸光度為A2，以60%乙醇代替樣品溶液的吸光度為A0。按如下公式計算清除率：

1.2.4.2 對DPPH·清除活性測定 在乙醇提取物和丙酮提取物均為0.25、0.5、1、2、4 mg/mL，VC1、2、10、20、40、80 μg/mL，BHT 5、10、20、40、60、80 μg/mL時對DPPH·清除活性進(jìn)行測定。方法在文獻(xiàn)［16］的基礎(chǔ)上略作修改。配制0.15 mmol/L的DPPH儲備液，4℃避光儲存。現(xiàn)用時稀釋，使其在517 nm波長下吸光值為0.700±0.020即為DPPH工作液。

取DPPH工作液2 mL，加入樣品溶液2 mL，室溫下避光放置30 min，在517 nm波長下測A1，以無水乙醇代替DPPH工作液的吸光度為A2，以60%乙醇代替樣品溶液的吸光度為A0。按公式（3）計算清除率。

1.2.4.3 對·OH清除活性測定 由于測定·OH的反應(yīng)體系為水溶性體系，將脂溶性的BHT溶液加入反應(yīng)體系時生成不溶物，因此測定·OH清除活性中，沒有以BHT為對照。在乙醇提取物和丙酮提取物均為250、500、1000、2000、4000 μg/mL，VC為50、100、200、400、800 μg/mL時對·OH清除活性進(jìn)行測定。

采用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH［17］。羥基自由基氧化水楊酸產(chǎn)生的2，3-二羥基苯甲酸，其在510 nm有特征吸收，從而可以通過檢測反應(yīng)體系中2，3-二羥基苯甲酸的生成量，檢測殘留的羥自由基，進(jìn)而測定紅松松仁膜衣提取物對羥基自由基的清除作用。

取6 mmol/L的FeSO4·7H2O溶液1 mL，加入6 mmol/L 的H2O2溶液1 mL，立即混勻，加入1 mL樣品溶液混勻，靜置10 min。再加入6 mmol/L的水楊酸鈉溶液1 mL，37℃水浴30 min，然后4000 r/min離心10 min，取上清液在510 nm波長下測定吸光度A1，蒸餾水代替水楊酸鈉溶液的吸光度為A2，60%乙醇代替樣品溶液的吸光度為A0。按公式（3）計算清除率。

1.2.4.4 對鐵離子還原能力的測定 在兩種提取物及對照濃度均為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL對各自的鐵離子還原能力進(jìn)行測定。采用鐵氰化鉀還原法［18］，向試管中加入樣品溶液0.5 mL，再分別加入pH6.6的磷酸緩沖液2.5 mL、5%鐵氰化鉀2.5 mL，混勻后密封，50℃水浴20 min，然后冰浴急速冷卻，再加入10%的三氯乙酸2.5 mL，混勻并離心10 min（4000 r/min）。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水，再加入0.5 mL 0.1%的三氯化鐵顯色，靜置10 min，700 nm波長處測定其吸光值A(chǔ)1，以60%乙醇代替樣品溶液為A0，F(xiàn)e3+總還原力=A1-A0，A1-A0越大說明Fe3+總還原力越強。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Curve Expert 1.4軟件進(jìn)行曲線擬合，SPSS 14.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0046x+0.0177，R2=0.9958，表明沒食子酸在40～200 μg/mL質(zhì)量濃度的范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度間呈良好線性關(guān)系。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

由圖2可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.014x+0.0167，R2= 0.9985，表明蘆丁在20～70 μg/mL質(zhì)量濃度的范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度間呈良好線性關(guān)系。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Rutin standard curve

2.2 樣品純度的測定

采用分光光度法測定提取物的純度，乙醇提取物總多酚的純度為39.02%，總黃酮的純度為10.19%；丙酮提取物總多酚的純度為44.09%，總黃酮的純度為14.59%。表明丙酮提取物中的總多酚和總黃酮純度都高于乙醇提取物。

2.3 松仁膜衣提取物對ABTS+·的清除活性

ABTS法是評價天然產(chǎn)物的總抗氧化能力常用方法之一［19］。松仁膜衣提取物對ABTS+·清除能力測定結(jié)果見圖3。

圖3 松仁膜衣提取物、BHT和VC對ABTS+·的清除作用Fig.3 Sscavenging activity of pine nut coated-film extracts，VC，and BHT against ABTS radical

由圖3可知，松仁膜衣提取物對ABTS+·的清除作用隨濃度的增加而增強，呈現(xiàn)很好的劑量效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)曲線擬合方程并計算IC50值，結(jié)果見表1。

根據(jù)表1中擬合方程，求得乙醇提取物50%清除濃度IC50值為90.16 μg/mL，丙酮提取物的IC50值為66.70 μg/mL，陽性對照VC和BHT的IC50值分別為34.75 μg/mL和30.41 μg/mL，比較IC50值發(fā)現(xiàn)，清除作用最強的是BHT，其次是VC和丙酮提取物，最弱的是乙醇提取物。雖然松仁膜衣提取物對ABTS+·的清除作用不及VC和BHT，但仍然表現(xiàn)出對ABTS+自由基具有一定的清除作用，且丙酮提取物顯著強于乙醇提取物（p＜0.05）。

2.4 松仁膜衣提取物對DPPH·的清除活性

對DPPH·的清除能力被廣泛用于天然產(chǎn)物抗氧化活性評價中［20］。紅松仁膜衣提取物和VC對DPPH·的清除率測定結(jié)果見圖4和圖5。

表1 對ABTS+·的清除作用擬合方程及IC50值Table1 ABTS radical scavenging effect of fitting equation and IC50

表2 對DPPH自由基的清除作用擬合方程及IC50值Table2 DPPH radical scavenging effect of fitting equation and IC50

圖4 松仁膜衣提取物和BHT對DPPH的清除作用Fig.4 Scavenging activity of pine nut coated-film extracts and BHT against DPPH radical

圖5 VC對DPPH·的清除作用Fig.5 Scavenging activity of VCagainst DPPH radical

由圖4、圖5可知，松仁膜衣提取物對DPPH·的清除能力隨提取物質(zhì)量濃度的增加而增強，并且呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)曲線擬合方程并計算IC50值，結(jié)果見表2。

根據(jù)表2中擬合方程，求得乙醇提取物50%清除濃度IC50值為1237.55 μg/mL，丙酮提取物的IC50值為1016.02 μg/mL，陽性對照VC和BHT的IC50值分別為8.19 μg/mL和24139.4 μg/mL，比較IC50值發(fā)現(xiàn)，清除作用最強的是VC，其次是丙酮提取物和乙醇提取物，最弱的是BHT。由此可知，松仁膜衣提取物對DPPH·的清除能力不及VC，但極顯著高于BHT（p＜0.01）。表明松仁膜衣提取物對DPPH·具有顯著的清除作用，并且丙酮提取物對DPPH·的清除作用與乙醇提取物的清除作用相當(dāng)（p＞0.05）。

2.5 松仁膜衣提取物對·OH的清除活性

·OH是活性氧中化學(xué)性質(zhì)最活潑的自由基，它幾乎能與細(xì)胞中任何生物大分子發(fā)生反應(yīng)，且反應(yīng)速度極快，是對機體危害非常大的自由基［21］。松仁膜衣提取物對·OH的清除作用，結(jié)果見圖6。

圖6 松仁膜衣提取物和VC對羥自由基的清除作用Fig.6 Hydroxyl radical scavenging activity of pine nut coated-film extracts and VC

由圖6可知，隨提取物質(zhì)量濃度的增加，對·OH的清除能力逐漸增強，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)曲線擬合方程并計算IC50值，結(jié)果見表3。

表3 對羥自由基的清除作用擬合方程及IC50值Table3 Hydroxyl radical scavenging effect of fitting equation and IC50

根據(jù)表3中擬合方程，求得乙醇提取物50%清除濃度IC50值為1539.19 μg/mL，丙酮提取物的IC50值為1295.07 μg/mL，陽性對照VC的IC50值為400.73 μg/mL，比較IC50值發(fā)現(xiàn)，清除作用最強的是VC，其次是丙酮提取物，最弱的是乙醇提取物。松仁膜衣提取物對·OH的清除作用雖不及VC，但對·OH具有明顯的清除作用，并且丙酮提取物對·OH的清除作用顯著強于乙醇提取物（p＜0.05）。

2.6 松仁膜衣提取物對鐵離子的還原能力

還原力的測定實質(zhì)上是檢驗物質(zhì)是否為良好的電子供應(yīng)者的過程［22］。松仁膜衣提取物還原鐵離子能力，結(jié)果見圖7。

圖7 松仁膜衣提取物、VC和BHT還原鐵離子能力Fig.7 Reducing ability of pine nut coated-film extracts，VCand BHT against Fe3+

由圖7可知，松仁膜衣提取物對鐵離子的還原能力不及VC，且低濃度時松仁膜衣提取物還原鐵離子的能力也低于BHT，但濃度大于0.4 mg/mL時，松仁膜衣提取物還原鐵離子能力要高于BHT。結(jié)果表明，松仁膜衣提取物具有較好的鐵離子還原能力，丙酮提取物的還原鐵離子能力與乙醇提取物相當(dāng)。

3 結(jié)論

丙酮提取物中的總多酚和總黃酮純度均高于乙醇提取物。通過多個氧化反應(yīng)體系實驗，紅松松仁膜衣乙醇提取物和丙酮提取物均表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，其對ABTS+·、DPPH·、·OH的清除能力和對鐵離子的還原能力均隨質(zhì)量濃度的增加而增強，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，并且對DPPH·的清除作用和對鐵離子的還原能力均高于BHT；丙酮提取物對ABTS+·和·OH的清除能力顯著高于乙醇提取物，表明丙酮提取物的抗氧化能力強于乙醇提取物。紅松松仁膜衣提取物的抗氧化活性與總多酚和總黃酮的純度呈正相關(guān)，可以考慮選擇丙酮提取物進(jìn)行后續(xù)的生物活性的深入研究。

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Antioxidant activities in vitro of pine nut coated-film extracts from Pinus koraiensis

ZHANG Xiao-ru1，LI Xing2，WANG Bin2，WANG Zeng-kai1，XU Hong-yan1，*
（1.Agricultural College of Yanbian University，Yanji 133002，China；2.Yanji Shoei Foods Co.，Ltd.，Yanji 133000，China）

It was to find out the antioxidant activities of Pinus koraiensis pine nut coated-film from Changbai Mountain.60%ethanol and 50%acetone were used，and the extracts were obtained by vacuum freeze-drying.The purity of total polyphenol and total flavonoids of the extracts were measured by spectrophotometry.The free radical scavenging abilities and reducing iron power also were studied in this experiment.The results showed that polyphenol purity of pine nut coated-film ethanol extract was 39.02%，the flavonoid purity was 10.19%.The polyphenol purity of acetone extract was 44.09%，the flavonoid purity was 14.59%.The scavenging capacity of pine nut coated-film extract on ABTS+·，DPPH·and hydroxyl radical（·OH）was of dose-dependent relationship including the ability of reducing iron power.Its scavenging effects on DPPH·and the ability of reducing iron power were better than that of BHT.And scavenging effects of acetone extracts on DPPH·and ·OH were notable better than that of ethanol extracts.These results showed that the antioxidant capacity of acetone extracts was higher than that of ethanol extracts.At the same time，there was positive correlation between the antioxidant capacity of Korean pine nut coated-film extracts and the purity of total polyphenol and total flavonoids in experiment extent.

Pinus koraiensis；pine nut coateded-film；antioxidant activity

TS255.1

A

1002-0306（2016）06-0142-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.020

2015－06－12

張曉茹（1991-），女，大學(xué)本科，研究方向：天然活性物質(zhì)功能作用，E-mail：919958472@qq.com。

徐紅艷（1975-），女，博士，講師，研究方向：天然活性物質(zhì)分離與功能性食品，E-mail：xuhongyan@ybu.edu.cn。

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20150204063NY）；延邊大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新計劃項目（ydbksky2015244）。