陳前鋒，鄧小艷，?；埒P（西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶400715）

HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地黨參中黨參炔苷和丁香苷的含量

陳前鋒，鄧小艷，?；埒P*
（西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶400715）

建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地黨參中黨參炔苷和丁香苷含量的方法。采用Thermo scientific C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈和水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)266 nm，柱溫為25℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黨參炔苷與丁香苷色譜峰分離良好。二者分別在10～200 μg/mL與0.5～10 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。平均加樣回收率分別為100.65%與98.78%。黨參炔苷和丁香苷在10個(gè)不同產(chǎn)地的黨參中含量分別介于0.1963～1.4532 mg/g與0.0051～0.0951 mg/g。該方法操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果穩(wěn)定可靠，適用于黨參2種主要成分的定量分析。

黨參，高效液相色譜法，黨參炔苷，丁香苷，含量測(cè)定

常用中藥黨參為桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.、素花黨參Codonopsis pilosula Nannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen或川黨參Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根，味甘性平，具有補(bǔ)中益氣，健脾益肺，除煩渴之功能，可用于治療脾肺虛弱，氣短心悸，食少便溏，內(nèi)熱消渴等癥［1］。黨參同時(shí)因其補(bǔ)氣健脾之功效，常被用于燉雞、燉瘦肉等。黨參中主要含有多糖、聚炔類(lèi)、酚酸、木脂素等多種類(lèi)型的化學(xué)成分［2］。黨參至今尚無(wú)統(tǒng)一的質(zhì)量控制方法，我國(guó)2010年版藥典僅收載了黨參炔苷為對(duì)照的薄層定性鑒別方法，并沒(méi)有相應(yīng)的定量檢測(cè)方法。目前關(guān)于黨參成分含量測(cè)定的文獻(xiàn)多集中在黨參炔苷、多糖、蒼術(shù)內(nèi)酯III、黨參內(nèi)酯等成分［3-6］。之前在對(duì)黨參化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)黨參炔苷和丁香苷為不同產(chǎn)地和品種黨參的共有活性成分。黨參炔苷對(duì)乙醇造成的胃黏膜損傷有很好的保護(hù)作用，與黨參補(bǔ)中益氣的傳統(tǒng)功效相符，為黨參胃粘膜保護(hù)作用的活性成分［7-8］。丁香苷具有抗疲勞、抗腦缺血、增強(qiáng)適應(yīng)性等藥理作用［9-11］。為了確保黨參合理有效的使用，使黨參的質(zhì)量評(píng)價(jià)有具體的定量指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)擬采用高效液相色譜法對(duì)3種不同基源和不同產(chǎn)地的黨參中黨參炔苷和丁香苷的含量進(jìn)行研究，為黨參的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黨參 從黨參主產(chǎn)地收集黨參藥材10批，樣品經(jīng)重慶市中藥研究院彭銳研究員、西南大學(xué)藥學(xué)院?；埒P副教授鑒定，采集產(chǎn)地見(jiàn)表1，所有樣品均經(jīng)純凈、干燥處理；黨參炔苷、丁香苷對(duì)照品 購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)分別為120802、120904，純度≥98%；色譜甲醇 重慶科試化學(xué)有限公司，色譜純；甲醇 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純；乙腈 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純；水 超純水；微孔濾膜 天津津騰公司。

分析型高效液相色譜儀 Hitachi公司：LC-2130泵，L-2450二極管陣列檢測(cè)器；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-III型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；FA2004B電子天平 上海精天電子儀器有限公司；AB135-S分析天平 METTLER TOLEDO；小型超純水儀 VEOLIA WATER；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

表1 不同產(chǎn)地黨參藥材的收集Table1 Codonopsis Radix collected from different areas

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 Thermo scientific C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相組成為A（乙腈）-B（水），梯度洗脫程序：0～10 min，5%A；10～20 min，5%～15%A；20～30 min，15%～25%A；30～50 min，25% ～75%A。柱溫為25℃室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取黨參炔苷對(duì)照品10.0 mg和丁香苷對(duì)照品10.0 mg分別于10 mL和100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1.0 mg/mL的黨參炔苷標(biāo)準(zhǔn)貯備液和濃度為0.1 mg/mL的丁香苷標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密移取黨參炔苷標(biāo)準(zhǔn)液1.0 mL、丁香苷標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL于5 mL的容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.3 樣品溶液的制備 分別取各批黨參藥材粉末（過(guò)80目篩）1.0 g，精密稱(chēng)定，置100 mL圓底燒瓶中，精密加入50 mL甲醇，浸泡15 min后超聲處理30 min，過(guò)濾，濾液減壓回收溶劑至近干，然后加入少量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取其濾液，4℃保存待測(cè)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 取混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行稀釋?zhuān)瑢⑵渑渲瞥牲h參炔苷濃度分別為200、100、50、20、10 μg/mL和丁香苷濃度分別為10、5、2.5、1、0.5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密吸取10 μL進(jìn)樣，以峰面積（Y）對(duì)樣品濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得到2種對(duì)照品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)與線性范圍。

1.2.5 方法學(xué)考察 精密度實(shí)驗(yàn)：精密吸取1.2.2項(xiàng)下方法制備的混合標(biāo)準(zhǔn)液10 μL，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：中國(guó)藥典95版有關(guān)于巫山廟黨的記載：“黨參味甘平、功能是補(bǔ)中氣不足，潤(rùn)肺之和，尤以巫山廟黨最佳”。C2為廟黨，在黨參樣品中具有一定的代表性。取C2號(hào)樣品共6份，按1.2.3項(xiàng)下方法平行制備樣品溶液，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取C2號(hào)樣品溶液，分別在0、3、6、9、18、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。

回收率實(shí)驗(yàn)：精密稱(chēng)取已知含量的C2號(hào)樣品約0.5 g，共6份，精密加入黨參炔苷和丁香苷的對(duì)照品溶液，混勻，按1.2.3項(xiàng)下方法平行制備樣品溶液，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算回收率。

1.2.6 樣品含量的測(cè)定 取各地黨參樣品按1.2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。

1.2.7 系統(tǒng)聚類(lèi)分析 以所測(cè)10個(gè)不同產(chǎn)地樣品中黨參炔苷與丁香苷的含量數(shù)值為變量，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析（離差平方和法，Ward's Method），利用歐氏距離（Euclidean Distance）作為樣品的測(cè)度，縱坐標(biāo)為樣品編號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

以乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，可快速有效分離黨參炔苷和丁香苷，結(jié)果見(jiàn)色譜圖，圖1（a，b）分別為混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖和樣品色譜圖。結(jié)果證明，在該色譜條件下，目標(biāo)成分與其他雜峰分離良好。

2.2 線性關(guān)系考察結(jié)果

丁香苷與黨參炔苷含量測(cè)定的回歸方程、相關(guān)系數(shù)與線性范圍見(jiàn)表2。結(jié)果表明，在給定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。丁香苷和黨參炔苷峰面積的RSD分別為1.12%、0.93%，表明該方法具有良好的精密度。

圖1 對(duì)照品與C8號(hào)黨參樣品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and No.C8 sample

表2 丁香苷和黨參炔苷的線性關(guān)系和線性范圍（n=6）Table2 The calibration curves and linear ranges of syringin and lobetyolin（n=6）

2.3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。丁香苷和黨參炔苷峰面積的RSD分別為1.83%、1.44%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。丁香苷和黨參炔苷峰面積的RSD分別為1.05%、1.27%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 回收率計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表6和表7。結(jié)果顯示，丁香苷與黨參炔苷的平均回收率分別為98.78%與100.65%，RSD分別為1.47%與2.78%，表明丁香苷與黨參炔苷的加樣回收率良好。

表6 丁香苷加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table6 Results of the recovery test of syringin

表7 黨參炔苷加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table7 Results of the recovery test of lobetyolin

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果

以外標(biāo)法計(jì)算10個(gè)不同產(chǎn)地樣品中丁香苷與黨參炔苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表8。測(cè)定結(jié)果表明，10批采自不同地區(qū)的黨參中黨參炔苷和丁香苷的含量有較大差異，其中C8云南昭通的黨參中黨參炔苷和丁香苷含量均為最高，分別為1.4532、0.0951 mg/g；C7貴州威寧的黨參中黨參炔苷含量最低，為0.1963 mg/g，山西長(zhǎng)治的黨參中丁香苷含量最低，為0.0051 mg/g。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 Results of precision

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table4 Results of repeatability

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)Table5 Results of stability

表8 樣品含量測(cè)定結(jié)果Table8 Results of content determination of various samples

2.5 系統(tǒng)聚類(lèi)分析

10個(gè)不同產(chǎn)地樣品的系統(tǒng)聚類(lèi)分析結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)聚類(lèi)重新標(biāo)定距離為25時(shí)，10批樣品聚為兩大類(lèi)，樣品C4、C8聚為第一類(lèi)，其余樣品聚為第二類(lèi)。當(dāng)聚類(lèi)重新標(biāo)定距離為5時(shí)，樣品C2、C3、C9、C10聚為第二小類(lèi)，其余樣品聚為第三小類(lèi)。結(jié)合含量測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第一類(lèi)樣品C4、C8是黨參炔苷含量最高的2份樣品，1份為四川涼山樣品，1份為云南昭通樣品。第二類(lèi)樣品C2、C3、C9、C10為黨參炔苷含量的較高組，第三類(lèi)樣品C1、C5、C6、C7則是黨參炔苷含量最低的4份樣品。由黨參炔苷含量的降序排列折線圖（圖3）可知，黨參炔苷含量由高向低排列時(shí)，樣品順序與聚類(lèi)分析結(jié)果一致，因此黨參炔苷的含量對(duì)黨參質(zhì)量具有顯著影響。由圖3可知，丁香苷含量與黨參炔苷含量具有較好的相關(guān)性，因此黨參炔苷和丁香苷含量均較高時(shí)，才能保證黨參質(zhì)量。因此，在對(duì)黨參藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，綜合考察黨參炔苷和丁香苷的含量，可以更全面地控制黨參質(zhì)量。

圖2 黨參炔苷和丁香苷含量測(cè)定結(jié)果聚類(lèi)樹(shù)狀圖Fig.2 Cluster analysis dendrogram based on the content of lobetyolin and syringin

圖3 樣品黨參炔苷含量降序排列折線圖Fig.3 Line chart based on the lobetyolin content in various samples in descending order

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定黨參中黨參炔苷和丁香苷含量的HPLC方法，該方法具有分離效果好、靈敏度高、精密度高、回收率好的特點(diǎn)，并采用系統(tǒng)聚類(lèi)法加以驗(yàn)證，證明該法可作為黨參藥材質(zhì)量控制的方法之一，為多指標(biāo)控制黨參藥材的質(zhì)量提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Determination of lobetyolin and syringin in Codonopsis Radix from different places by HPLC

CHEN Qian-feng，DENG Xiao-yan，ZHU Hui-feng*
（School of Pharmaceutical Sciences，Southwest University，Chongqing 400715，China）

To establish a HPLC method for simultaneous determination of lobetyolin and syringin in Codonopsis Radix from different places.The HPLC system consisting of Thermo scientific C18Column（4.6 mm×250 mm，5 μm）and a gradient elution system of acetonitrile-water as the mobile phase was adopted.The flow rate was set at 1.0 mL/min，the detection wavelength was 266 nm，and the column temperature was 25℃.The results indicated that the chromatographic peaks of lobetyolin and syringin could be separated well.The linear ranges for lobetyolin and syringin were 10～200 μg/mL and 0.5～10 μg/mL，respectively.The average recoveries were 100.65%and 98.78%，respectively.The lobetyolin content and syringin content in Codonopsis Radix from ten places was ranged from 0.1963～1.4532 mg/g and 0.0051～0.0951 mg/g，respectively.The simple，quick，reproducible and reliable method could be used for determination of two main components in Codonopsis Radix.

Codonopsis Radix；HPLC；lobetyolin；syringin；content assay

TS207.3

A

1002-0306（2016）06-0064-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.004

2015－07－21

陳前鋒（1980-），男，博士，講師，研究方向：天然藥物化學(xué)，E-mail：cqf2011@swu.edu.cn。

?；埒P（1971-），女，博士，副教授，研究方向：中藥治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)與藥理機(jī)制，E-mail：zhfbsci@126.com。

校地合作項(xiàng)目（104290-41003012）；2013年重慶高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃資助項(xiàng)目；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（XDJK2013A025）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（XDJK2013C145）；西南大學(xué)博士基金項(xiàng)目（SWU111076）；西南大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心資助的創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。