鄭朋朋，李 珊，張 保，楊正濤，戚麗蓉，黃 超，敖新宇（西南林業(yè)大學生命科學學院，云南昆明650224）

苯酚硫酸法測定萌發(fā)菌HL-003多糖方法的研究

鄭朋朋，李 珊，張 保，楊正濤，戚麗蓉，黃 超，敖新宇*
（西南林業(yè)大學生命科學學院，云南昆明650224）

為確定苯酚硫酸法測定萌發(fā)菌HL-003多糖的最佳參數(shù)。選取苯酚濃度和濃硫酸量為自變量，檢測不同苯酚濃度和濃硫酸量下的最大吸收波長和吸光值，從而確定最佳的苯酚濃度和濃硫酸量，在此基礎上檢驗方法的顯色時間、精密度、線性范圍和回收率。結果表明：最佳苯酚濃度為5%，濃硫酸量為3.5 mL，最大吸收波長為488 nm，顯色時間15 min；葡萄糖濃度在0～200 mg/mL范圍內線性良好；在優(yōu)化方法下進行精密度實驗，葡萄糖、胞內多糖和發(fā)酵液多糖測定結果的相對標準偏差（RSD）分別為0.474%、1.015%和0.712%，測定結果穩(wěn)定可靠；本方法對葡萄糖和葡聚糖的回收率均在99.10%以上，回收率高，與真實值吻合；通過測定，萌發(fā)菌HL-003胞內和發(fā)酵液多糖的含量分別為2.028% 和2.998 g/L。

苯酚硫酸法，萌發(fā)菌HL-003，多糖

真菌多糖是指各種真菌的子實體和菌絲體等所產生的一類高分子化合物［1-3］。國內外已從高等擔子菌中篩選到幾百種具有生物活性的多糖物質，目前真菌多糖類保健品已有上百種之多［4-5］。真菌多糖可應用于人類的疾病治療和保健，具有調節(jié)機體免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗輻射、抗衰老、健胃保肝、降血糖、血脂、血壓等多種功能［6-8］。

萌發(fā)菌HL-003是天麻的萌發(fā)菌，為真菌界擔子菌門小菇屬（Mycena sp.），屬于高等擔子菌［9-11］。其中萌發(fā)菌胞內多糖具有鎮(zhèn)痛消炎、抗腫瘤、抗菌等生物活性［12-14］。

文獻報道中，多糖的測定方法主要分為苯酚硫酸法和蒽酮比色法［15-17］，本研究針對苯酚硫酸法進行研究。在不同文獻中所使用的方法原理均相同，但在苯酚濃度、濃硫酸量、測定波長和顯色時間上存在差異性，沒有一個確定的規(guī)范，不能很好地進行比較、檢驗和使用。本文針對以葡萄糖為標準品苯酚硫酸法測定多糖中的參數(shù)進行研究。選取苯酚濃度和濃硫酸量為自變量，檢測不同濃硫酸量和苯酚濃度下反應的最大吸收波長和吸光值，在此基礎上檢驗方法的顯色穩(wěn)定時間、精密度、線性范圍和回收率，從而確定苯酚硫酸法測定萌發(fā)菌HL-003多糖的最佳參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

萌發(fā)菌HL-003菌株 由西南林業(yè)大學生命科學學院生化教研組提供，對菌株進行活化擴繁和液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到萌發(fā)菌HL-003菌絲體與發(fā)酵液；葡聚糖G-10 Sigma公司；乙醇、濃硫酸、苯酚、葡萄糖 AR，國藥集團化學試劑有限公司。

DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱、HWS-12水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；M20粉碎機KIKA-WERKE公司；BS224S電子天平 SARTORIUS公司；5430R離心機 Eppendorf公司；TU-1901紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苯酚硫酸法方法的優(yōu)化 由于在測定過程中，樣品濃度和苯酚濃度是可變的，為了不重復討論變量對測定結果的影響，將樣品量和苯酚量固定在1.0 mL。在實驗中，選用蒸餾水和50 μg/mL葡萄糖溶液作為供試樣品，同時檢測不同情況下的最大吸收波長和吸光值。

1.2.1.1 苯酚濃度的確定 取50 μg/mL葡萄糖溶液1.0 mL到10支具塞試管中，分別加入1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的苯酚1.0 mL，再加入98%的濃硫酸4.0 mL，反應20 min后，在400～600 nm波長范圍內掃描最大吸收波長，并在最大吸收波長下測定吸光值。對照組用1.0 mL蒸餾水替代葡萄糖溶液，其他操作相同。

1.2.1.2 濃硫酸量的確定 取50 μg/mL葡萄糖溶液各1.0 mL到8支具塞試管中，加入5%苯酚1.0 mL，再分別加入2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 mL的濃硫酸，反應20 min后，在400～600 nm波長范圍內掃描最大吸收波長，并在最大吸收波長下測定吸光值。對照組用1.0 mL蒸餾水替代葡萄糖溶液，其他操作相同。

1.2.1.3 顯色時間的確定 取30 μg/mL葡萄糖溶液1.0 mL于試管中，再依次加入5.0%苯酚1.0 mL，濃硫酸3.5 mL，搖勻后，迅速倒入比色皿，在488 nm下進行時間掃描，掃描100 min。

1.2.1.4 精密度實驗 分別取萌發(fā)菌HL-003胞內、胞外多糖待測液和50 μg/mL的葡萄糖溶液1.0 mL于三只試管中，再分別依次加入5.0%苯酚1.0 mL，濃硫酸3.5 mL，搖勻后反應15 min，在488 nm下測定吸光值，每組6個重復。

1.2.1.5 線性范圍的確定 準確配制500 μg/mL的葡萄糖儲備液，將儲備液稀釋成0、50、100、150、200、250、300、350、400 μg/mL的葡萄糖標準溶液，取各濃度葡萄糖標準溶液1.0 mL，分別依次加入5.0%苯酚1.0 mL，濃硫酸3.5 mL，搖勻后反應15 min，在488 nm下測定吸光值，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪曲線。

在確定一定的線性范圍后，將500 μg/mL的葡萄糖儲備液稀釋5倍得到100 μg/mL的葡萄糖標準液，再精確配制0、10、20、30、40、50、60 μg/mL的標準葡萄糖溶液，取各濃度葡萄糖標準溶液1.0 mL，分別依次加入5.0%苯酚1.0 mL，濃硫酸3.5 mL，搖勻后反應15 min，在488 nm下測定吸光值，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線。

1.2.1.6 回收率實驗 配制20、40、60 μg/mL的標準葡聚糖溶液和10、30、50 μg/mL的葡萄糖溶液，取不同濃度的標準葡聚糖溶液和葡萄糖溶液各1.0 mL，分別依次加入5.0%苯酚1.0 mL，濃硫酸3.5 mL，搖勻后反應15 min，在488 nm下測定吸光值，每組6個重復。

1.2.2 萌發(fā)菌HL-003多糖的提取與測定

1.2.2.1 胞內多糖的提?。?8］準確稱取菌絲體1 g，置于50 mL的離心管中，加入42 mL蒸餾水，在功率為520 W下超聲處理19 min后，在72℃電熱恒溫水浴中浸提2.2 h；5000 r/min離心15 min，將上清液真空旋轉蒸發(fā)濃縮為5 mL后，加20 mL無水乙醇，4℃靜置沉淀15 h；6000 r/min離心10 min，收集多糖沉淀，將沉淀復溶于水中，定容到100 mL待測。

1.2.2.2 發(fā)酵液多糖的提取 接種萌發(fā)菌HL-003固體培養(yǎng)菌塊于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在室溫條件下，120 r/min搖床上培養(yǎng)18 d，用4層紗布過濾，得到發(fā)酵液。準確移取10 mL發(fā)酵液，置于50 mL的離心管中，加30 mL無水乙醇，4℃靜置沉淀15 h；6000 r/min離心10 min，收集多糖沉淀，將沉淀復溶于水中，定容到100 mL待測。

1.2.2.3 萌發(fā)菌 HL-003多糖的測定 胞內多糖待測液和發(fā)酵液多糖待測液稀釋10倍后，分別取1.0 mL，再依次加入5.0%苯酚1.0 mL，濃硫酸3.5 mL，搖勻后反應15 min，在488 nm下測定吸光值。根據標準曲線方程A=0.19839+0.01292C得到多糖含量計算公式，多糖含量的計算按照（1）和（2）進行。

式中：A為胞內多糖待測液稀釋溶液后吸光值；k為稀釋倍數(shù)，本文k為10。

式中：A為發(fā)酵液多糖待測液稀釋溶液后吸光值；k為稀釋倍數(shù)，本文k為10。

1.2.3 數(shù)據處理 運用Origin 7.5軟件對1.2.1和1.2.2中所測定的數(shù)據進行數(shù)據分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 苯酚濃度法方法優(yōu)化

2.1.1 苯酚濃度的確定 不同苯酚濃度對測定結果的影響如圖1所示，由圖1（A）可知：苯酚濃度小于5%時，隨苯酚濃度增加葡萄糖溶液的最大吸收波長逐漸增大，最大為489 nm；5%～9%濃度范圍內葡萄糖溶液的最大吸收波長維持在489 nm，大于9%時葡萄糖溶液的最大吸收波長開始增大。苯酚濃度為1%～3%時蒸餾水的最大吸收波長減小1 nm，3%～7%范圍內蒸餾水的最大吸收波長維持在490 nm，苯酚濃度繼續(xù)增加，蒸餾水的最大吸收波長又開始減小。

圖1 苯酚濃度對最大波長和吸光值的影響Fig.1 Effect of phenol concentration on the maximum wavelength and absorbance values

由圖1（B）可知：隨著苯酚濃度增大，葡糖糖溶液的吸光值不斷增加，苯酚濃度從1%～5%時，葡萄糖溶液的吸光值與苯酚濃度呈現(xiàn)正相關性，當苯酚濃度大于5%之后，葡萄糖溶液的吸光值不繼續(xù)增加，而是在一定范圍內波動；對于蒸餾水，整體來看，苯酚濃度的增大，吸光值有所增加，但是增加的輻度不明顯，整體趨勢和葡萄糖溶液的相似；綜合對圖1的結果分析，5%的苯酚是最佳的苯酚濃度。

2.1.2 濃硫酸量的確定 不同濃硫酸量對測定結果的影響如圖2所示。由圖2（A）可知，濃硫酸量從2～3.5 mL時，蒸餾水的最大吸收波長由481 nm增加到489 nm，3.5～4.5 mL時蒸餾水的最大吸收波長維持在489 nm，濃硫酸量大于4.5 mL時蒸餾水的最大吸收波長又開始增加；濃硫酸量從2～3 mL時葡萄糖溶液的最大吸收波長從483 nm增大到488 nm，3～4.5 nm時最大吸收波長為488 nm不變，當濃硫酸量大于4.5 mL時，葡萄糖溶液的最大吸收波長開始減小。

由圖2（B）可知，濃硫酸量增加，葡萄糖溶液和蒸餾水的吸光值及兩者的差值均是先增加，到達最大值后開始下降；濃硫酸量從2～3.5 mL時，葡萄糖溶液的吸光值不斷增大，3.5 mL時吸光值到達最大值，濃硫酸量繼續(xù)增加，葡萄糖溶液的吸光值開始緩慢減??；濃硫酸量從2～4.5 mL時，蒸餾水的吸光值不斷增大，吸光值對濃硫酸量呈現(xiàn)正相關性，當濃硫酸量大于5 mL時，蒸餾水的吸光值開始下降，從整體趨勢看，蒸餾水的吸光值變化也與葡萄糖溶液的相似。

圖2 濃硫酸量對最大波長和吸光值的影響Fig.2 Effect of volume of concentrated sulfuric acid on the maximum wavelength and absorbance values

通過對不同苯酚濃度和不同濃硫酸量對測定結果的分析可知，苯酚濃度5%，濃硫酸量為3.5 mL，葡萄糖溶液和蒸餾水的吸光值差值最大，在此條件下蒸餾水的最大吸收波長為489 nm。葡萄糖溶液的最大吸收波長為488 nm。因此最佳的苯酚濃度為5%，最佳濃硫酸量為3.5 mL，由于蒸餾水與葡萄糖溶液的最大吸收波長只相差1 nm，為統(tǒng)一操作，最佳波長選取葡萄糖溶液的最大吸收波長488 nm。

2.1.3 顯色時間 圖3為吸光值隨顯色時間的變化圖，由圖3可知，0～5 min時，吸光值急劇下降，5～10 min時，吸光值由緩慢下降到維持平衡，10～30 min范圍內，吸光值維持在一定值不變，當時間繼續(xù)延長，吸光值是一個非常緩慢的增大過程。所以10～30 min測定樣品吸光值最穩(wěn)定，考慮到加入濃硫酸需要一定的操作時間，以及確保在顯色30 min之前測定完樣品，確定15 min為最佳顯色時間。

圖3 顯色時間對吸光值的影響Fig.3 Effect of coloration time of absorbance

2.1.4 精密度實驗 精密度實驗結果如表1所示，葡萄糖、胞內多糖和發(fā)酵液多糖6次重復實驗結果的RSD值分別為0.474%、1.015%和0.712%，由此可見，優(yōu)化的苯酚硫酸法測定結果穩(wěn)定性好，精密度高，實驗數(shù)據可靠。

表1 精密度實驗結果Table1 Results of precision experiments

2.1.5 線性范圍 由朗伯比爾定律可知［19］，測定的吸光值隨溶液濃度增加而增大，吸光值和溶液濃度成正比關系，但朗伯比爾定律是在一定溶液濃度范圍內成立的，若超出一定濃度范圍，吸光值與溶液濃度將不再成正比例關系，測定結果將無法進行準確的計算，這個范圍即是線性范圍。

圖4 葡萄糖濃度對吸光值的影響Fig.4 Effect of glucose concentration on the absorbance value

為考察優(yōu)化后的苯酚硫酸法所適合的葡萄糖濃度的線性范圍，測定了從0～500 μg/mL的葡萄糖溶液的吸光值，以葡萄糖溶液濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪圖，結果如圖4所示。由圖4可知，葡萄糖溶液濃度在0～200 μg/mL范圍時，吸光值與濃度呈現(xiàn)正比例關系，濃度增加吸光值相應增大；當葡萄糖溶液濃度大于200 μg/mL時，溶液的吸光值偏離先前的直線，吸光值有一個急劇增大的過程，最終超出儀器的檢測范圍。所以優(yōu)化后的苯酚硫酸法適用的葡萄糖溶液的線性范圍為0～200 μg/mL，在此范圍內的R2=0.992。

圖5 葡萄糖標準曲線Fig.5 Standard curve of glucose

在上述的線性范圍內，降低葡萄糖溶液的濃度，制作葡萄糖的標準曲線，線性系數(shù)更大，將可以更加準確地計算實驗中的數(shù)據，葡萄糖的標準曲線如圖5所示。葡萄糖標準曲線方程為：A=0.19839+0.01292C，R2=0.999。

2.1.6 回收率實驗 回收率實驗結果如表2所示，由表可知：10.00、30.00、50.00 μg/mL的葡萄糖溶液測定結果的RSD值分別為1.3854%、0.7263%和0.5478%，回收率分別為99.10%、99.77%和100.14%；20.00、40.00、60.00 μg/mL的標準葡聚糖溶液測定結果的RSD值分別為2.9034%、1.5929%和1.4497%，回收率分別為99.40%、99.18%和99.15%?？梢姕y定結果相對標準偏差較小，實驗數(shù)據穩(wěn)定可靠；葡萄糖與葡聚糖的回收率均大于99.10%，說明測定結果回收率高，測定值能正確反應真實值。

表2 回收率實驗結果Table2 Results of recovery experiments

2.2 萌發(fā)菌HL-003胞內與發(fā)酵液多糖測定結果

運用1.2.2.3中式（1）和式（2）對表1中的胞內多糖和發(fā)酵液多糖的測定結果進行計算，計算結果見表3。由表3可知，萌發(fā)菌HL-003胞內和發(fā)酵液多糖的含量分別為2.028%和2.998 g/L。

表3 萌發(fā)菌HL-003胞內與發(fā)酵液多糖測定結果Table3 The measurement results of polysaccharide

3 結論

通過實驗優(yōu)化苯酚硫酸法，得到最佳苯酚濃度為5%，濃硫酸量為3.5 mL，最大吸收波長為488 nm，顯色時間15 min；葡萄糖濃度在0～200 mg/mL范圍內線性良好，在優(yōu)化方法下進行精密度實驗，葡萄糖、胞內多糖和發(fā)酵液多糖測定結果的相對標準偏差（RSD）分別為0.474%、1.015%和0.712%，測定結果穩(wěn)定可靠；本方法對葡萄糖和葡聚糖的回收率均在99.10%以上，回收率高，與真實值吻合；通過測定，萌發(fā)菌HL-003胞內和發(fā)酵液多糖的含量分別為2.028%和2.998 g/L。因此確定通過優(yōu)化的苯酚硫酸法具有實用價值，可以運用到萌發(fā)菌HL-003多糖的測定以及其他材料中多糖的測定。

［1］S P Wasser.Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2002，60：258-274.

［2］彭述輝，曾援.功能性多糖的研究進展［J］.安徽農業(yè)科學，2010，38（19）：10255-10258.

［3］Vincent ECOoi，F(xiàn)ang Liu.Immunomodulation and Anti-Cancer Activity of Polysaccharide-Protein Complexes［J］.Current Medicinal Chemistry，2000（7）：715-729.

［4］秦俊哲，陳明，陳合，等.食藥用真菌多糖的研究現(xiàn)狀與展望［J］.中國食用菌，2004，23（2）：6-8.

［5］Yuki Masuda，Koichi Ito，Morichika Konishi，et al.A polysaccharide extracted from Grifola frondosa enhances the anti-tumor activity of bone marrow-derived dendritic cell-based immunotherapy against murine colon cancer［J］.Cancer Immunol Immunother，2010，59：1531-1541.

［6］Jun-Jen Liu，Tien-Shang Huang，Ming-Ling Hsuc，et al.Antitumor effects of the partially purified polysaccharides from Antrodia camphorata and the mechanism of its action［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，2004，201：186-193.

［7］肖建輝，蔣儂輝，梁宗琦，等.食藥用真菌多糖研究進展［J］.生命的化學，2002，22（2）：148-150.

［8］王雪冰，趙天瑞，樊建.食用菌多糖提取技術研究概況［J］.中國食用菌，2010（2）：3-6.

［9］徐錦堂.中國天麻栽學［M］.北京：北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1993：1-9.

［10］徐錦堂，郭順星，范黎，等.天麻種子與小菇屬真菌共生萌發(fā)的研究［J］.菌物系統(tǒng)，2001，20（1）：137-141.

［11］郭順星，王秋穎.促進天麻種子萌發(fā)的石斛小菇優(yōu)良菌株特性及作用［J］.菌物系統(tǒng)，2001，20（3）：408-412.

［12］祁婧，張大為，陳娟，等.五種藥用石斛內生真菌抑制HIV-1整合酶活性研究［J］.中國醫(yī)藥生物技術，2013，8（1）：36-40.

［13］鄭朋朋，楊曉波，李珊，等.萌發(fā)菌HL-003胞內多糖的提取及抗氧化性研究［J］.中國釀造，2015，34（3）：71-75.

［14］王春蘭，陳曉梅，郭順星，等.石斛小菇的藥理活性研究［J］.微生物學通報，2001，28（2）：73-76.

［15］郭志燁，韓麗，楊明，等.中藥多糖定量測定方法的探討［J］.中成藥，2014，36（10）：2172-2176.

［16］李計萍.中藥新藥研究中多糖含量測定方法探討［J］.中國中藥雜志，2014，39（17）：3392-3394.

［17］陳龍浩，黃雪峰，陳穎珊，等.西番蓮果皮多糖2種測定方法的比較研究［J］.今日藥學，2013（9）：573-575.

［18］鄭朋朋，李珊，陳玉惠，等.響應面法優(yōu)化萌發(fā)菌HL-003胞內多糖提取工藝［J］.食品工業(yè)科技，2015，36（15）：219-223.

［19］武漢大學化學系.儀器分析［M］.北京：高等教育出版社，2001：113-115.

Study on phenol-sulfuric acid method for determination of polysaccharides from germination fungus HL-003

ZHENG Peng-peng，LI Shan，ZHANG Bao，YANG Zheng-tao，QI Li-rong，HUANG Chao，AO Xin-yu*
（Life Science College，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China）

In order to determine polysaccharides of germination fungus HL-003，parameters of the phenolsulfuric acid method were optimized.Phenol concentration and volume of concentrated sulfuric acid was the independent variable，the maximum absorption wavelength and absorbance were detected under different concentrations of phenol and concentrated sulfuric acid volume.Immediately，the color of time，precision，linearity and recovery were measured in order to determine the optimum parameters.The results showed that phenol concentration of 5%，concentrated sulfuric acid content of 3.5 mL，the maximum absorption wavelength of 488 nm，coloration time 15 min.The methods had a high precision and recovery results were reliable，and consistent with the true value.The concentration of glucose in the range of 0～200 mg/mL had a good linearity.Intracellular and fermentation of polysaccharide contents were 2.028%and 2.998 g/L，by detecting with optimized method.

phenol-sulfuric acid method；germination fungus HL-003；polysaccharides

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0074-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.006

2015－07－02

鄭朋朋（1990-），男，碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學，E-mail：1104663437@qq.com。

敖新宇（1978-），男，碩士，副教授，研究方向：生物化學與分子生物學，E-mail：54700875@qq.com。

云南省優(yōu)勢特色重點學科生物學一級學科建設項目（50097505）。