楊立芳，劉洪存，羅 佳，鄧 嫻，姜明國，耿麗媛（.廣西民族大學(xué)，化學(xué)化工學(xué)院，廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西高校食品安全與藥物分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530006；.廣西民族大學(xué)，海洋與生物技術(shù)學(xué)院，廣西六堡茶加工工程技術(shù)研究中心，廣西南寧530006）

金花茶茶花HPLC指紋圖譜的研究

楊立芳1，劉洪存1，羅 佳1，鄧 嫻1，姜明國2，*，耿麗媛2
（1.廣西民族大學(xué)，化學(xué)化工學(xué)院，廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西高校食品安全與藥物分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530006；2.廣西民族大學(xué)，海洋與生物技術(shù)學(xué)院，廣西六堡茶加工工程技術(shù)研究中心，廣西南寧530006）

目的：以10批次的金花茶茶花為研究對象，建立金花茶茶花高效液相指紋圖譜。方法：微波法提取金花茶茶花中的有效成分，采用高效液相色譜法建立金花茶茶花的指紋圖譜。結(jié)果：建立了金花茶茶花HPLC特征指紋圖譜共有模式，標(biāo)定了34個(gè)共有峰，10批次金花茶茶花指紋圖譜經(jīng)國家藥典委員會規(guī)定的相似度計(jì)算軟件（2004A）計(jì)算，共有峰保留時(shí)間的相對偏差較小，相似度良好。結(jié)論：建立金花茶茶花高液相指紋圖譜，建立共有模式，可作為科學(xué)評價(jià)金花茶茶花質(zhì)量的檢測方法。

金花茶茶花，高效液相色譜，黃酮類，指紋圖譜

金花茶（Camellia chrysantha（Hu）Tuyam）為山茶科、山茶屬、金花茶組、金花茶系植物［1］，主要分布在廣西防城港境內(nèi)熱帶雨林溝谷地帶［2-3］，是一種珍貴的藥用植物，2010年被批準(zhǔn)為新資源食品［4］。金花茶富含多種對人體有益的營養(yǎng)成分，是自然界中營養(yǎng)價(jià)值極高的植物之一，在當(dāng)?shù)乇挥米鱾鹘y(tǒng)民間中草藥［5］，對于治療咽喉炎、痢疾、高血壓、月經(jīng)不調(diào)等疾病有較好的效果［6］。近來研究證明，金花茶主要含有黃酮類［7］、多酚類［5］、三萜類［8］、多糖類及皂甙類化合物，具有抗腫瘤［9］、抗氧化［10］的作用。目前，對金花茶的研究主要包括對基因、遺傳的研究，多糖的理化性質(zhì)研究，多酚、黃酮等物質(zhì)理化性質(zhì)的研究，而且主要是對金花茶茶葉的研究，而對金花茶茶花的研究相對較少。金花茶茶花雖然具有很好的生物活性，但由于資源稀缺，價(jià)格昂貴等原因，以次充好，以假亂真的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。

指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到茶葉品種鑒別和質(zhì)量控制等方面，普洱曬青毛茶、苦丁茶、云南普洱茶、廣東單樅茶等均有指紋圖譜的相關(guān)研究。指紋圖譜技術(shù)是分析天然產(chǎn)物和產(chǎn)品的有效手段［11］，是指經(jīng)過光譜或色譜測定得到的組分群體的特征圖譜或圖像，可以經(jīng)濟(jì)、可靠、便捷的表征產(chǎn)品特性［12］，反應(yīng)產(chǎn)品的全貌，實(shí)現(xiàn)對內(nèi)在質(zhì)量的綜合評價(jià)和整體物質(zhì)的全面控制［13］。

本文擬對金花茶茶花進(jìn)行HPLC指紋圖譜的研究，為科學(xué)評價(jià)和有效控制金花茶的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10批金花茶樣品（S1～S10） 分別購買來自不同批次的金花茶茶花樣品；樣品 經(jīng)廣西梧州茶廠郭維深高級工程師鑒定為金花茶；冰醋酸 分析純，AR，西隴化工股份有限公司；甲醇 色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈 色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；其余試劑 均為分析純；水 超純水；蘆?。ê?1.7%，CAS號：153-18-4）對照品 購自中國藥品生物制品檢定所。

LC-15C高效液相色譜儀、Uvmini-1240紫外可見分光光度儀 日本島津；XH-100A微波催化合成/萃取儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試品溶液的制備 取粉碎后（過60目篩）的金花茶茶花樣品4.0 g，置于圓底燒瓶中，依次用30 mL，20 mL超純水進(jìn)行微波提取，微波功率為400 W，提取溫度為100℃，提取時(shí)間為30 min［14］，合并上清液，定容到50 mL，搖勻，得到金花茶茶花水提取物，作為供試品溶液。

1.2.2 對照品溶液的制備 精確稱量5.0 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加1 mL甲醇混合制成5.0 mg/mL的蘆丁對照品溶液，標(biāo)記為樣品S，實(shí)驗(yàn)備用。

1.2.3 色譜條件 取1.2.1中供試品溶液20 μL用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相：乙腈（A）-0.5%冰醋酸水溶液（B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：35℃。

表1 金花茶茶花HPLC梯度洗脫程序Table1 Gradient elution mode for flower of Camellia chrysantha（Hu）Tuyam

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2004A）分析和繪制金花茶花茶的HPLC指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱取1號金花茶茶花樣品（S1）4.0 g，按照1.2.1中的方法制備供試品，用1.2.3中的方法進(jìn)行檢測，重復(fù)進(jìn)樣5次，考察儀器的精密度。結(jié)果表明，各主要色譜峰的相對保留時(shí)間的RSD在0.02%～2.26%范圍內(nèi)，相對峰面積RSD值在2.26%～9.12%之間，表明儀器的精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取S1號金花茶茶花樣品4.0 g，按照1.2.1中的方法制備供試品，分別在0、2、4、6、12 h進(jìn)樣，用1.2.3中的方法進(jìn)行檢測，考察樣品的穩(wěn)定性。通過計(jì)算各主要色譜峰的相對保留時(shí)間的RSD在0.09%～1.04%范圍內(nèi)，相對峰面積RSD值在1.70%～8.38%之間，供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取S1號金花茶茶花樣品4.0 g，共5份，分別按照1.2.1中的方法制備供試品，用1.2.3中的方法進(jìn)行檢測，計(jì)算每個(gè)樣品共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，并計(jì)算RSD，考察實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。結(jié)果表明主要色譜峰的相對保留時(shí)間的RSD在0.014%～1.39%范圍內(nèi)，相對峰面積RSD值在0.92%～9.50%之間，符合指紋圖譜的要求。

2.2 金花茶茶花指紋圖譜的建立

2.2.1 指紋圖譜的采集 精確稱量S1～S10各個(gè)批次的金花茶茶花4.0 g，分別按照1.2.1中的方法制備供試品，采用1.2.3中的方法進(jìn)行檢測，得到各批次金花茶茶花的HPLC指紋圖譜（S1-S10）及10批樣品的對照圖譜（R）。

圖1 10批次金花茶茶花指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of flower of Camellia chrysantha（Hu）Tuyam

2.2.2 共有指紋峰的確定 運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2004A）進(jìn)行指紋圖譜數(shù)據(jù)分析，綜合10批次樣品的指紋圖譜，10批次圖譜都匹配的色譜峰標(biāo)定為共有指紋圖譜峰。共確定34個(gè)色譜峰為共有峰，如圖2所示，計(jì)算出相對保留時(shí)間和相對峰面積，見表2。

圖2 金花茶茶花指紋圖譜共有峰Fig.2 Common peaks in the HPLC fingerprint of flower of Camellia chrysantha（Hu）Tuyam

表2 金花茶茶花HPLC指紋圖譜相對保留時(shí)間和相對峰面積分析Table2 Relative retention time and Relative peak area of main peaks in the HPLC fingerprint of flower of Camellia chrysantha（Hu）Tuyam

2.2.3 參照峰的確定 按照色譜條件進(jìn)樣得到的金花茶茶花指紋圖譜，色譜峰多且峰型復(fù)雜，采用外標(biāo)法，蘆丁在色譜條件下測定的色譜圖保留時(shí)間與19號峰保留時(shí)間基本相同，故確定19號峰即為蘆丁，且該峰與相鄰色譜峰分離良好，峰面積適宜，易于識別，具備評價(jià)色譜指紋圖譜的特征，因此，在指紋圖譜上選擇19號色譜峰作為參照峰（S）。

2.2.4 共有指紋峰的分析 應(yīng)用評價(jià)系統(tǒng)對共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。由表中結(jié)果可以看出，十批金花茶的相對保留時(shí)間之間的RSD值比較小，說明各批次金花茶的化學(xué)成分基本相同，但是相對峰面積的RSD值比較大，這表明生長時(shí)間不同、生長地理環(huán)境等外界因素不同的情況下，各個(gè)批次金花茶之間化學(xué)成分含量有一定的差異。

圖3 蘆丁的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC figure of Rutin

表3 金花茶茶花HPLC指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果Table3 Results of similarity analysis in fingerprint for ten batches of flower of Camellia chrysantha（Hu）Tuyam

2.2.5 相似度分析 利用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A版”，采用多點(diǎn)校正后進(jìn)行自動匹配，對10批樣品的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，分析結(jié)果見表3。

3 結(jié)論

中國為世界上最早將茶作為飲料的國家［15］，茶在國民生活中占據(jù)著重要的位置。金花茶作為自然界中唯一綻放金黃色花朵的茶花被國家列為一級保護(hù)植物，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值，是極稀缺的養(yǎng)生極品［5］。因此，制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)極其重要。本研究擬運(yùn)用HPLC技術(shù)構(gòu)建金花茶花茶HPLC指紋圖譜，以期更全面地反映我國金花茶花茶中水提物成分的化學(xué)特征，并為其鑒別和質(zhì)量的客觀評價(jià)提供思路。

本文對金花茶茶花進(jìn)行研究，確定了實(shí)驗(yàn)的色譜條件，建立了金花茶茶花的指紋圖譜，共確定了34個(gè)共有峰。實(shí)驗(yàn)方法經(jīng)過方法學(xué)考察，符合建立指紋圖譜的各項(xiàng)要求，可作為金花茶茶花質(zhì)量控制與科學(xué)評價(jià)的有效方法。

［1］顏棟美，李仁菊.XDA-200對金花茶多酚的純化研究［J］.食品工業(yè)科技，2008，29（1）：137-139.

［2］趙彥華，田呈瑞，徐長波，等.金花茶飲料工藝的研究［J］.食品科學(xué)，2005，26（9）：323-326.

［3］Wei X，Jiang YS，Jiang S Y，et al.Photosynthetic characteristics of an endangered species Camellia nitidissima and its widespread congener Camellia sinensis［J］.Photosynthetica，2008，46（2）：312-314.

［4］林華娟，田曉春，秦小明，等.金花茶多糖單一成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征解析［J］.食品科學(xué)，2013，34（3）：141-146.

［5］林華娟，秦小明，曾秋文，等.金花茶茶花的化學(xué)成分及生理活性成分分析［J］.食品科技，2010，35（10）：88-91.

［6］黃變才.廣西民族醫(yī)藥簡編［M］.廣西：廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生局藥品檢驗(yàn)所，1980：82.

［7］Zhou XingWen，F(xiàn)an ZhengQi，Chen Yue，et al.Functional analyses of a flavonol synthase-like gene from Camellia nitidissima reveal its roles in flavonoid metabolism during floral pigmentation ［J］.Journal of Biosciences，2013，38（3）：593-604.

［8］Sokol'skii I N，Ban'kovskii A I，Zinkevich E P.Triterpene Glycosides from Camellia oleifera and Camellia sasanqua［J］.Khimiya Prirodnykh Soedinenii，1975，1：102-103.

［9］曾秋文，林華娟，秦小明，等.金花茶皂甙的分離純化研究［J］.食品科技，2010，35（10）：233-237.

［10］秦小明，林華娟，寧恩創(chuàng)，等.金花茶葉水提物的抗氧化活性研究［J］.食品科技，2008，2：189-191.

［11］袁潔，尹京苑，高海燕.指紋圖譜在白酒中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2008，29（11）：680-684

［12］蔣劍波，周志剛，彭利軍.湘西原香醋紫外光譜指紋圖譜特性分析［J］.食品科學(xué)，2012，33（06）：162-165.

［13］肖維強(qiáng)，戴宏芬，黃炳雄，等.石硤龍眼HPLC指紋圖譜的研究［J］.食品科學(xué)，2009，30（4）：154-157

［14］秦小明，寧恩創(chuàng)，楊宏，等.金華茶葉藥用保健成分提取新工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2005，26（10）：122-124

［15］TapanKMondal，AmitaBhattacharya，LaxmikumaranMalathi，et al.Recent advances of tea（Camellia sinensis）biotechnology ［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2004，76：195-254.

Development of an HPLC fingerprint for flower of Camellia Chrysantha（Hu）Tuyam

YANG Li-fang1，LIU Hong-cun1，LUO Jia1，DENG Xian1，JIANG Ming-guo2，*，GENG Li-yuan2
（1.School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Utilization of Microbial and Botanical Resources，Key Laboratory of Guangxi Colleges and Universities for Food Safety and Pharmaceutical Analytical Chemistry，Guangxi University for Nationalities，Nanning 530006，China；2.School of Marine Sciences and Biotechnology，Guangxi Liupo Tea Engineering and Technology Centers，Guangxi University for Nationalities，Nanning 530006，China）

Objective：To establish HPLC fingerprints for quality control of the flower of Camellia Chrysantha（Hu）Tuyam.collected from different locations.Methods：The effective compounds were extracted by microwave method and detected by HPLC.Results：34 HPLC peaks was marked as the common peak of ten batches samples by the traditional medicine fingerprint similarity calculation software.Conclusion：The established chromatographic fingerprint was proved to be a scientific quality evaluation method for flower of Camellia Chrysantha（Hu）Tuyam.

Camellia chrysantha（Hu）Tuyam；HPLC；flavonoids，fingerprint

TS207.3

A

1002-0306（2016）06-0086-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.008

2015－07－24

楊立芳（1969-），女，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)成分及活性研究，E-mail：yanglf1990@163.com。

姜明國（1973-），男，博士，教授，研究方向：生物技術(shù)與生物活性評價(jià)，E-mail：mzxyjiang@163.com。

廣西高?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（YB2014101）。