孫 迪，楊 建，劉祥忠，趙守光，宋 哲，胡克義，徐明華，蘇 潔，劉金玲，莊云龍

恩替卡韋治療慢性HBV感染者KIR基因多態(tài)性與療效的相關性研究

孫 迪，楊 建，劉祥忠，趙守光，宋 哲，胡克義，徐明華，蘇 潔，劉金玲，莊云龍

目的 探討慢性HBV感染者殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（killer immunoglobulin-like receptor， KIR）基因多態(tài)性及其與應用恩替卡韋療效差異相關性。方法 采用序列特異性引物聚合酶鏈反應（PCR-SSP）法，對60例應用恩替卡韋治療的慢性HBV感染者（試驗組）和60例健康對照者（對照組）的KIR基因進行基因分析，比較試驗組和對照組的差異。60例患者中18例為治療完全應答者 （完全應答組），42例為非完全應答者（非完全應答組），比較2組之間差異。結果 通過試驗組和對照組的16種KIR基因分析，框架基因KIR2DL4、3DL2、3DL3和3DP1存在于所有個體中，其基因頻率均為1.0。試驗組KIR 2DS2和KIR2DS3基因型頻率高于對照組（P值依次為0.038和0.035）；完全應答組KIR2DS1、KIR3DS1和KIR2DL5基因型頻率高于非完全應答組 （P值依次為0.010、0.029和0.018）。結論 KIR2DS2、KIR2DS3可能是HBV的易感基因型，KIR2DS1、KIR3DS1、KIR2DL5可能與恩替卡韋抗HBV治療有效應答有關。

殺傷細胞免疫球蛋白樣受體；基因型；完全應答；序列特異性引物聚合酶鏈反應；恩替卡韋；無應答；部分應答

殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（killer immunoglobulin-like receptor， KIR）屬于免疫球蛋白樣受體超家族的一組分子，其基因位于人染色體19q13.4，是繼人類白細胞抗原后發(fā)現的具有高度多態(tài)性的免疫調節(jié)基因家族，表達于NK細胞和部分T細胞表面。KIR基因多態(tài)性是其分子多態(tài)性的遺傳基礎， 因而 KIR 基因多態(tài)性有可能影響慢性HBV感染后的機體免疫反應及其臨床抗HBV療效［1］。

恩替卡韋是一種鳥嘌呤核苷類似物，其作用靶點為HBV的逆轉錄酶，可抑制HBV的逆轉錄酶。其強效降低HBV載量及低耐藥發(fā)生率的特點在慢性乙型肝炎（慢乙肝）的治療中得到廣泛的臨床應用。為了探討KIR基因多態(tài)性與慢性HBV感染者及其對恩替卡韋抗HBV治療應答差異的相關性，我們對60例接受恩替卡韋治療的HBeAg陽性慢乙肝患者（包括完全應答、部分應答及無應答者）及60例健康志愿者分別檢測 KIR 基因分型，分析基因多態(tài)性分布的差異。

1 對象與方法

1.1 對象 2012年10月—2013年6月于煙臺市傳染病醫(yī)院就診的初治HBeAg陽性慢乙肝患者，在患者知情同意應用恩替卡韋（商品名潤眾，江蘇正大天晴藥業(yè)）抗HBV治療基礎上，隨機選取60例患者（試驗組），男40例，女20例，年齡28～55歲，平均年齡40歲，均為山東籍漢族?？诜魈婵f0.5 mg/d用于抗HBV治療，療程為48周。48周后達到病毒學應答（病毒載量低于檢測下限），且HBeAg血清學轉換者為完全應答；達到病毒學應答，未出現HBeAg血清學轉換者為部分應答；未達到病毒學應答者為原發(fā)性無應答。HBeAg陽性慢乙肝診斷標準符合2015年中華醫(yī)學會肝病分會和感染病學分會制訂的病毒性肝炎診斷標準［2］， 并排除其他病毒（HIV、HCV、HEV及EBV）感染、自身免疫性疾病、藥物性肝炎以及核苷類抗病毒藥物應用史者。正常對照為隨機選擇同一時期本站無償獻血者（要求供血者符合獻血者健康標準）60例（對照組）， 男38例，女22例， 年齡19～55歲，平均年齡38歲，均為山東籍漢族。對照組和試驗組成員均無親緣關系。

1.2 檢測方法 所有試驗組及對照組均采集EDTA抗凝血5 ml和血清3 ml置-70 ℃冰箱保存，分別進行血清HBV感染指標和KIR基因型檢測。

1.3 試劑與儀器 定量分析試劑 ［美國雅培，HBsAg（稀釋），批號54642LF00］，HBsAb（美國雅培，批號50317LF00），HBeAg（美國雅培，批號51306LI00），HBeAb（美國雅培，批號52227LI00），HBcAb（美國雅培，批號45710LI00；生化分析儀（美國雅培，Abbott Ci16200）；HBV核酸定量分析試劑（深圳凱杰，批號20150501/2），HBV熒光定量核酸分析儀（A美國ABI，BI7500）。

血液基因組DNA提取試劑為EZBeadTMBlood DNA Extraction Kit （美國Texas BioGene，批號148023522），dNTP （美 國Promega，批號18125），Tag DNA聚合酶（美國Promega，批號CKA3701D），普通酶（美國Promega，批號00122458），瓊脂糖（美國Genetech，批號111860），PCR特異性引物和內參照引物（上海博尚生物技術有限公司合成）；EZBeadTMsystem-32DNA提取工作站（美國Texas BioGene），PCR擴增儀（美國ABI公司，GeneAmp PCR system 9700）；BYY-6B型電泳儀（北京六一儀器廠），GeneGenius型Syngene生物圖像分析儀（美國Syngene 公司）。

1.4 DNA提取 利用DNA提取工作站和試劑提取血液基因組DNA，按說明書操作。

1.5 KIR基因型檢測 采用PCR-SSP法對60例HBV患者和60例健康者的17個KIR基因進行分型。KIR基因PCR特異性引物序列（見表1）。PCR反應體系10 μ l：包括20 ng的受檢基因組DNA（1 μ l）、0.2 mmol/L的dNTP （0.4 μ l）、0.5 IU Taq DNA聚合酶（0.1 μ l）、0.4 μ mol/L的引物（除KIR2DS1的引物為0.8 μ mol/L外）（0.4 μ l）和1×PCR反應緩沖液（2 μ l，5X），用水補齊總體積。PCR反應的陽性內參照為生長因子基因（growth hormone gene， GH），上游引物5′TTCCCAACCATTCCCTTA 3′，下游引物5′CGGATTTCTGTTGTGTTTC3′，擴增片段大小為423 bp。PCR反應參數94℃，4 min；94 ℃，30 s，65 ℃，30 s，72℃，90 s，30個循環(huán)。72℃，10 min；4℃，保存。部分KIR基因PCR擴增的退火溫度略有變化：KIR2DS2 （63℃）、KIR2DS3 （63℃）、KIR2DS4 （61℃）和KIR2DS5（63℃）。PCR產物用1%～2%瓊脂糖凝膠電泳檢查，Syngene生物圖像分析儀進行結果分析。

表1 KIR 基因的序列特異性PCR引物Table 1 Sequence-specific PCR primers of KIR genes

1.6 KIR基因單體型分析 依據Hsu等［3］制定的KIR基因單體型分型綜合標準分型。①所有單體型均包含3DL3、2DL4和3DL2；②一個單體型中含有2DL2或2DL3，但非同時存在；③一個單體型中含有3DP1或3DP1v，但非同時存在；④單體型B攜帶一個或多個KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5和KIR3DS1，而單體型A不包含這些基因。單體型1包含：KIR3DL3、2DL3、2DP1、2DL1、3DP1、2DL4、3DL1、1D和3DL2；單體型2包含：KIR3DL3、2DL3、2DP1、2DL1、3DP1、2DL4、3DL1、2DS4和3DL2；單體型3包含：KIR3DL3、2DS2、2DL2、3DP1v、2DL4、3DL1、1D和3DL2；單體型4包含：KIR3DL3、2DS2、2DL2、3DP1v、2DL4、3DL1、2DS4和3DL2； 單體 型5包 含：KIR3DL3、2DL3、2DP1、2DL1、3DP1、2DL4、3DS1、2DL5、2DS5、2DS1和3DL2；單體型6包含：KIR3DL3、2DL3、2DP1、2DL1、3DP1、2DL4、3DS1、2DL5、2DS3、2DS1 和3DL2；單體型8包含：KIR3DL3、2DS2、2DL2、2DP1、2DL1、3DP1、2DL4、3DL1、2DL5、2DS3、1D和3DL2；單體型9包含：KIR3DL3、2DS2、2DL2、2DP1、2DL1、3DP1、2DL4、3DS1、2DL5、2DS3、2DS1和3DL2；單體型11包含：KIR3DL3、2DP1、2DL4、2DS1和3DL2；單體型13包含：KIR3DL3、2DS2、2DL2、3DP1v、2DL4、3DL1、2DL5、2DS5、2DS1和3DL2；單體型17包含：KIR3DL3、2DS2、2DL2、2DP1、2DL1、3DP1、2DL4、3DL1、2DL5、2DS5、2DS1和3DL2；單體型23包 含：KIR3DL3、2DP1、2DL1、3DP1、2DL4、3DL1、2DL5、2DS3、1D和3DL2?；蛐蜑?個單體型的組合，并以不同的字母表示。新發(fā)現的基因型暫以NF命名。

1.7 統(tǒng)計學處理 參照文獻方法［3］， KIR基因的基因型頻率（genotypic frequency， gf）通過直接計數測得百分率。用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行χ2相關分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。用比值比（OR）分析關聯強度，用Woolf公式計算OR （OR=ad/bc）及95%CI。

2 結 果

2.1 試驗組gf 試驗組KIR2DS2和KIR2DS3 gf均顯著高于對照組（P值依次為0.038和0.035），OR值依次為2.213和2.500，其余各激活型KIR基因的表型頻率在2組人群中差異無統(tǒng)計學意義，抑制型KIR基因的表型頻率在試驗組和對照組中相比差異無統(tǒng)計學意義（見表2）。

表2 試驗組和對照組KIR gf比較Table 2 Comparison of KIR gf between experimental group and control group

2.2 試驗組治療應答情況 60例患者接受恩替卡韋治療18周時，完全應答18例（30%）、部分應答36例（60%）、無應答6例（10%）。見表3。2.3 試驗組中完全應答組與非完全應答組中KIR gf比較 完全應答組KIR2DS1、KIR3DS1和KIR2DL5 gf高于非完全應答組 （P值均＜0.05），OR依次為4.462，3.523，3.929。見表4。

表3 試驗組治療應答情況Table 3 Treatment response of experimental group

表4 完全應答組與非完全應答組中KIR gf 比較Table 4 Comparison of the frequency of KIR genotypes between CRG and partial or null response group

2.4 試驗組中部分應答、無應答及完全應答患者KIR gf詳情 部分應答組、無應答組和完全應答組KIR gf詳情見表5，因無應答組樣本量少，未做進一步統(tǒng)計分析。

表5 部分應答組、無應答組和完全應答組中KIR gfTable 5 Comparison of the frequency of KIR genotypes among CRG， PRG and NRG

3 討 論

KIR基因多態(tài)性是其分子多態(tài)性的遺傳基礎，KIR基因的高度多態(tài)性構成了不同種族和個體間疾病易感性和免疫應答差異的遺傳學基礎。KIR基因的多態(tài)性決定著機體對病毒等生物致病因素的免疫能力，KIR在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用［4-8］，隨著近年來的研究，KIR基因在疾病中的作用愈發(fā)受到關注，在許多疾病病因學的研究中均發(fā)現不同疾病的易感性與不同的KIR基因相關［9-11］。

在我國慢性HBsAg攜帶者中至少有1/3～1/2或以上是母嬰傳播而造成，HBsAg攜帶者中母親傳播給嬰兒的概率平均為40%（25%～45%），明顯高于非洲和歐美地區(qū)，其可能與病毒復制狀態(tài)、母親血液中HBV DNA載量和遺傳因素有關［12］。機體感染HBV后，部分患者可發(fā)生免疫反應，自然清除HBV，部分患者轉為慢性HBV攜帶，在多種因素作用下可發(fā)展成慢乙肝，需要接受臨床治療。目前認為HBV感染的臨床結局與宿主遺傳因素、免疫狀態(tài)和病毒因素等多種因素有關，NK細胞及CD8+T細胞表面的KIR能夠特異性與靶細胞表面HLA-Ⅰ類分子結合形成受體配體復合物，調節(jié)NK及細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）毒活性［3， 13］，從而發(fā)揮抗病毒作用，而KIR分子具有的高度多態(tài)性，將影響到其與配體結合的特異性和穩(wěn)定性，是影響上述細胞功能狀態(tài)的重要原因之一［14-15］，因而 KIR基因多態(tài)性有可能影響HBV感染后的機體免疫反應及其臨床結局。近年來研究表明KIR與HBV感染、HCV感染及抗病毒治療效果有關［14， 16-17］。

本研究中顯示試驗組與對照組中框架基因2DL4、3DL2、3DL3和3DP1存在于所有個體中，其基因頻率均為1.0；通過比較KIR基因在試驗組與對照組中的頻率可以看出，KIR2DS2、KIR2DS3在試驗組中的分布頻率均高于對照組，與報導相一致［13， 18-20］，提示KIR2DS2、2DS3與HBV感染的易感性相關。激活型KIR基因與疾病的發(fā)生發(fā)展和治療的關系密切，提示這些基因可能通過轉導抑制或活化信號調節(jié)NK細胞介導的抗感染免疫，激活型KIR基因通過NK、T細胞傳遞更多的激活信號，激活型和抑制型基因平衡紊亂可能是HBV感染后發(fā)病的免疫因素，并可導致機體感染HBV后慢性化。

目前抗HBV藥物主要包括干擾素和核苷（酸）類似物2類，其中核苷類似物恩替卡韋，由于其強效、快速降低病毒量，并且具備耐藥基因屏障等特點，被我國慢乙肝治療指南及國外慢乙肝治療指南推薦為主要或一線藥物［21-24］，其在臨床上廣泛應用，可有效緩解病情進展，經過治療，部分患者可達完全應答，但仍有應答不佳患者（部分應答），甚至為無應答。慢乙肝患者臨床藥物療效，國內已有KIR基因多態(tài)性與干擾素的相關性報導［1］，但對于應用核苷類似物恩替卡韋抗病毒療效與KIR基因型的相關性尚未有報導。我們的研究提示慢性HBV感染者應用恩替卡韋抗病毒的療效可能與某些KIR基因型明顯相關，完全應答組KIR2DS1、KIR3DS1、KIR2DL5陽性率較非完全應答組增高，我們推測KIR2DS1、KIR3DS1、KIR2DL5可能與抗病毒治療有效應答有關，KIR2DS1、KIR3DS1、KIR2DL5可能促進HBV清除。不同KIR基因型，由于其KIR位點基因的組成不同，NK細胞受體對HBV病毒感染的影響可能涉及多個激活性和抑制性受體，使NK細胞和/或T細胞功能異常而導致機體發(fā)生不利的免疫反應，進而影響HBV特異性細胞毒性T淋巴細胞功能的有效發(fā)揮，繼而影響機體抗病毒感染、對病毒清除的敏感性， 從而造成慢性HBV感染者對恩替卡韋治療應答的差異，但KIR基因與恩替卡韋在抗病毒免疫反應的內在聯系尚不十分清楚。本次分析樣本量較少，尚未包括HBeAg陰性的慢乙肝患者，因此須要進一步擴大樣本量繼續(xù)研究，尤其是對部分應答、無應答者進行分組分析，以及探尋傳播途徑方式的影響等，以便為我們更深入地了解慢乙肝的發(fā)病機制，并對治療方案療效預測提供依據。

［1］ 李長纓，羅維礁，柳富會，等. KIR基因多態(tài)性與HBV感染及干擾素療效的相關性研究［J］. 預防醫(yī)學論壇，2011，8（17）:675-678.

［2］ 中華醫(yī)學會肝病學分會，中會醫(yī)學會感染病學分會. 慢性乙型肝炎防治指南 （2015年更新版）［J］. 傳染病信息，2015，28（6）:321-340.

［3］ Hsu KC， Liu XR， Selvakumar A， et al. Killer Ig-like receptor haplotype analysis by gene content: evidence for genomic diversity with a minimum of six basic framework haplotypes， each with multiple subsets［J］. J Immunol， 2002， 169（9）:5118-5129.

［4］ Yen JH， Lin CH， Tsai WC， et al. Killer cell immunoglobulin-like receptor gene's repertoire in rheumatoid arthritis［J］. Scand J Rheumatol， 2006， 35 （2）:124-127.

［5］ 張海清，趙家軍，趙躍然，等. 殺傷細胞免疫球蛋白樣受體基因多態(tài)性與 Graves病相關［J］. 中華內分泌代謝雜志，2006，22（2）:130-131.

［6］ Gardiner CM， Shilling HG， Shilling HG. Different NK cell surface phenotypes defined by the DX9 antibody are due to KIR3DL1 gene polymorphism ［J］. Immunol， 2001， 166（5）:992-3001.

［7］ 陳阿梅，郭曉明，閆文瑛，等. 白血病患者的殺傷細胞免疫球蛋白樣受體基因多態(tài)性研究［J］. 中國實驗血液學雜志，2007，15（1）:35-38.

［8］ 喬文本，劉麗，莊云龍，等. 山東地區(qū)漢族人群殺傷細胞免疫球蛋白樣受體和白細胞抗原C基因與梅毒的關系［J］. 國際免疫學雜志，2013，36（1）:64-69.

［9］ Eller MA， Koehler RN， Kijak GH， et al. Human immunodeficiency virus type 1 infection is associated with increased NK cell polyfunctionality and higher levels of KIR3DL1+ NK cells in ugandans carrying the HLA-B Bw4 motif［J］. J Virol， 2011，85（10）:4802-4811.

［10］ Salim P H， Jobim M， Jobim L F， et al. Autoimmune rheumatic diseases and their association with killer immunoglobulin- like receptor genes［J］. Rev Bras Reumatol， 2011， 51（4）:351-364.

［11］ Omar S Y， Marshall E， Middleton D， et al. Increased killer immunoglobulin- like receptor expression and functional defects in natural killer cells in lung cancer［J］. Immunology， 2011，133（1）:94-104.

［12］ 姚光弼. 臨床肝臟病學［M］.上海:上?？茖W技術出版社，2011:238.

［13］ Lu Z， Zhang B，Chen S， et a1. Association of KIR genotypes and haplotypes with susceptibility to chronic hepatitis B virus infection in Chinese Han population［J］. Cell Mol Immunol， 2008，5（6）:457-463.

［14］ 張園園，王青青，王建莉，等. NK受體KIR生物學功能的研究進展［J］. 免疫學雜志，2005，21（3）:262-264.

［15］ Willianms AP， Baterman AR， Khakoo SI. Hanging in the balance KIR and their role in disease［J］. Mol Interv， 2005， 5（4）:226-240.

［16］ Bonorino P， Leroy V， Dufeu-Duchesne T， et al. Features and distribution of CD8 T cells with human leukocyte antigen class I-specific receptor expression in chronic hepatitis C［J］. Hepatology， 2007， 46（5）:1375-1386.

［17］ Taniguchi M， Kawabata M. KIR3DL1/S1 genotypes and KIR2DS4 allelic variants in the AB KIR genotypes are associated with Plasmodium-positivein dividual sinmalariain fection［J］.Immunogenetics， 2009， 61（11-12）:717-730.

［18］ Zhi-ming L， Yu-lian J， Zhao-lei F， et al. Polymorphisms of killer cell immunoglobulin-like receptor gene: possible association with susceptibility to or clearance of hepatitis B virus infection in Chinese Han population［J］. Croat Med J， 2007， 48（6）:800-806.

［19］ Lu Z， Zhang B， Chen S， et a1. Association of KIR genotypes and haplotypes with susceptibility to chronic hepatitis B virus infection in Chinese Han population［J］. Cell Mol Immunol， 2008， 5:457-463.

［20］ Lu ZM， Jiao YL， Feng ZL， et a1. Polymorphisms of killer cell immunoglobulin-like receptor gene: possible association with susceptibility to or clearance of hepatitis B virus infection in Chinese Han population［J］. Croat Med J， 2007， 48:800-806.

［21］ Lok AS， McMahon BJ. Chronic hepatitis B: update 2009［J］. Hepatology， 2009， 50（3）:661-662.

［22］ 中華醫(yī)學會肝病學分會，中會醫(yī)學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南 （2015年更新版） ［J］.傳染病信息，2016，29（1）:1-33.

［23］ Liaw YF， Kao JH，Piratvisuth T， et al. Asian-Pacific consensus statement on the management of chronic hepatitis B:a 2012 update ［J］. Hepatol Int， 2012， 6（3）:531-561.

［24］ European Association for the Study of the Liver. EASL clinical practice guidelines:management of chronic hepatitis B virus infection［J］. J Hepatol， 2012， 57（1） :167-185.

（2016-03-29 收稿 2016-06-28 修回）

（責任編委 王永怡 本文編輯 盧福昱）

Association between KIR genes polymorphisms and the efficacy of entecavir treatment in patients with chronic hepatitis B

SUN Di， YANG Jian， LIU Xiang-zhong*， ZHAO Shou-guang， SONG Zhe， HU Ke-yi， XU Ming-hua， SU Jie， LIU Jin-ling， ZHUANG Yun-long Yantai Central Blood Station， Yantai 264003， China *Corresponding author， E-mail: xiangzhong8686@sina.com

Objective To explore whether KIR genotype polymorphisms is associated with HBV infection and the efficiency of chronic hepatitis B （CHB） patients treated with entecavir （ETV）. Methods Polymerase chain reaction with sequence -specific primers （PCR-SSP ） method was used to genotype KIR genes in 60 CHB patients and 60 healthy controls. Of the 60 patients， 18 were total responders to the treatment with ETV （complete response group， CRG） and 42 were null or partial responders （partial or null response group， PRG or NRG）. The distributions of KIR genotypes were analyzed between the experimental group and the control group. Results Analyzing 16 KIR genotypes between the experimental group and the control group， framework genes KIR2DL4，KIR3DL2， KIR3DL3 and KIR3DP1 were present in all individuals.The frequencies of them are both 1.0. The frequencies of KIR2DS2 and KIR2DS3 in the experimental group were significantly higher than those in the control group （P= 0.038 and P = 0.035， respectively）. The frequencies of KIR2DS1 ， KIR3DS1 and KIR2DL5 in CRG were significantly higher than those in PRG and NRG （P= 0.010 ， P = 0.029 and P = 0.018 respectively）. Conclusions KIR2DS2 and KIR2DS3 may be HBV susceptible genotypes. KIR2DS1， KIR3DS1 and KIR2DL5 may be of benefit to anti-HBV therapy with ETV.

KIR； genotype； complete response； PCR-SSP； ETV； null response ； partial response

［中國圖書資料分類號］ R512.62； R394.21 A

1007-8134（2016）04-0216-06

10.3969/j.issn.1007-8134.2016.04.006

煙臺市科學技術發(fā)展計劃（2013WS259）

264003，山東煙臺市中心血站（孫迪、楊建、趙守光、宋哲、胡克義、徐明華、蘇潔）；264001，山東煙臺市傳染病醫(yī)院（劉祥忠）；250014 濟南，山東省血液中心（劉金玲、莊云龍）

劉祥忠，E-mail: xiangzhong8686@sina.com