張愛民，柳芳芳，楊 曉，李文剛，韓 萍，劉麗英，段學章

肝細胞癌患者外周血NK細胞頻率及受體表達

張愛民，柳芳芳，楊 曉，李文剛，韓 萍，劉麗英，段學章

目的 檢測肝細胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）患者外周血NK細胞頻率、功能及受體表達的變化，并分析其在HCC患者中表達特點。方法 用流式細胞術(shù)檢測36例HCC患者、34例乙型肝炎肝硬化（liver cirrhosis， LC）患者的外周血NK細胞頻率及其受體CD158a、CD158b、NKG2D 、NKP30、NKP44、NKP46的表達情況，用IL-12刺激外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMC）、流式細胞術(shù)檢測NK細胞分泌IFN-γ、TNF-α的能力，并用流式細胞毒性分析法檢測NK細胞對K562細胞的殺傷效率，對2組NK細胞頻率、受體及功能進行分析和比較。結(jié)果 2組患者NK細胞的頻率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。CD56dimNK細胞的活化性受體NKG2D、NKP30表達在HCC組高于LC組（P＜0.05）。在IL-12刺激下HCC組CD56brightNK細胞IFN-γ、TNF-α表達率、CD56dimNK細胞IFN-γ表達率均低于LC組（P＜0.05）。HCC組NK細胞對K562的殺傷比例高于LC組（P＜0.05）。結(jié)論 HCC組NK細胞分泌細胞因子能力低于LC組，但殺傷功能強于LC組，可能與其表面活化性受體高表達有關(guān)。

殺傷細胞；癌，肝細胞；流式細胞術(shù)； 細胞毒性， 免疫

NK細胞為固有免疫細胞，具有廣泛的免疫學功能，參與適應性免疫應答，是連接固有免疫與適應性免疫的橋梁［1］，是機體抗腫瘤免疫的第一道防線。NK細胞功能的發(fā)揮主要由其活化性受體和抑制性受體傳遞的信號共同決定，其對靶細胞的殺傷活性與其細胞表面受體密切相關(guān)。本研究通過檢測HBV相關(guān)性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）患者外周血NK細胞頻率、活化性及抑制性受體的表達情況及NK細胞的殺傷活性，探討HCC患者外周血NK細胞受體表達變化及對NK細胞殺傷功能的影響。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2013年6月—2014年12月我院收治的乙型肝炎肝硬化基礎上發(fā)生的原發(fā)性HCC患者36例（HCC組），乙型肝炎肝硬化患者34例（肝硬化組）。HCC組患者男30例，女6例，平均年齡（52.59±9.28）歲， Child-Pugh分級A級14例、B級22例，按巴塞羅那肝癌（Barcelona Clinic Liver Cancer， BCLC）分期8例為早期、12例為中期、16例為晚期；肝硬化組患者男28例，女6例，平均年齡（47.54±15.29）歲，Child-Pugh分級A級15例、B級19例。所有病例均已接受核苷（酸）類似物抗病毒治療，HBV DNA病毒載量皆低于500 IU/ml。2組患者男女比例、年齡、肝功能（Child-Pugh分級）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。肝癌診斷標準參照衛(wèi)生部《肝細胞癌診療規(guī)范》（2011年版）［2］，乙型肝炎肝硬化患者符合中華醫(yī)學會肝病學分會和感染病學分會于2010 年制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標準［3］，并排除其他肝炎病毒重疊感染、酒精性肝炎、藥物性肝炎和自身免疫性肝炎者，所有病例均不合并其他惡性腫瘤及免疫性疾病。本研究所有入選病例均征得研究對象本人同意并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑和儀器 CD3-perCP、HLA-DR-perCP、CDl23-PE、CD11c-APC、lin-1 FITC、CD56-APC、INF-γ-PE單抗、TNF-α-PE單抗和7-AAD均購自美國BD Pharmingen公司；MultiTEST IMK試劑盒和TruCOUNT絕對計數(shù)管購自美國BD公司；IL-12、蛋白轉(zhuǎn)運阻斷劑（Golgistop）、破膜劑（Cytofix/Cytoperm）、破膜洗液（Cytoperm/Cytowash）購自美國Sigma公司；CFSE購自美國Invitrogen公司；FACSCalibur流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 NK細胞頻率和數(shù)量檢測 入選者于清晨采集肝素鈉抗凝的空腹靜脈血20 ml。采用MultiTEST IMK試劑盒和TruCOUNT絕對計數(shù)管，使用FACSMULTISET軟件檢測并進行自動分析。

1.3.2 流式細胞術(shù)檢測NK細胞受體表達 常規(guī)方法分離3 ml外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMC），加入到含有 4 ml淋巴細胞分離液的10 ml離心管中，以2000 r/min的速度，離心20 min。小心吸出中間層的淋巴細胞，PBS緩沖液洗滌 2 次，2000 r/min，離心15 min，計數(shù)細胞并調(diào)整細胞密度為1×106/ml。將獲得的淋巴細胞立即進行熒光標記，檢測6個指標，每管加入6種不同熒光素標記的抗體: CD3-CD56+NKG2D+；CD3-CD56+NKP30+；CD3-CD56+NKP44+；CD3-CD56+NKP46+；CD3-CD56+CD158a+；CD3-CD56+CD158b+各10 μl，對照管中加入相應的同型對照，取待測樣品 100 μl分別加入各管，室溫下避光孵育30 min，加入溶血劑300 μl，室溫下避光孵育15 min，加入PBS緩沖液1 ml洗1次，1000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用PBS緩沖液重懸，上流式細胞儀檢測。

1.3.3 細胞刺激及流式染色分析 常規(guī)方法分離PBMC。按l×107/ml的濃度接種于96孔板，每孔200 μl。加入終濃度為5 ng/ml的IL-12。按終濃度1.7μg/ml的量加入蛋白轉(zhuǎn)運阻斷劑（Golgistop）。將細胞培養(yǎng)板置于37℃，5%的CO2孵箱中孵育6 h后收獲細胞進行流式染色。收獲細胞于流式管中，每管加入CD3-PerCP 3 μl、CD56-APC 1 μl，避光染色15 min，洗滌后棄上清，加入破膜劑300 μl，避光20 min，加破膜洗液洗滌細胞后棄上清，分別加入INF-γ-PE、TNF-α-PE單抗3 μl避光染色15 min，加破膜洗液洗滌后棄上清，多聚甲醛400 μl固定，24 h內(nèi)上機檢測。使用Cellquest軟件檢測，F(xiàn)lowJo軟件分析。

1.3.4 NK細胞殺傷K562細胞功能試驗 用流式細胞毒性分析法檢測，按說明書操作。用CFSE標記K562細胞作為靶細胞。將各組PBMC按照NK細胞的比例換算成NK細胞絕對數(shù)作為效應細胞數(shù)，以3×104/孔的濃度將K562細胞接種在96孔板中，按效/靶比（E/T）為3∶1、10∶1、30∶l的濃度梯度加入效應細胞，用培養(yǎng)基調(diào)整至200 μl/孔，將細胞培養(yǎng)板置于37 ℃，5%的CO2孵箱中孵育6 h后收獲細胞于流式管中，盡快加入7-AAD 3 μl，5 min后立即上機檢測。用CFSE圈出K562細胞，7-AAD陽性K562細胞為被NK細胞殺傷的靶細胞。

1.4 統(tǒng)計學處理 實驗結(jié)果采用STATA12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用sktest進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布資料2組間采用t檢驗，結(jié)果以±s表示，非正態(tài)分布資料2組間采用ranksum檢驗，結(jié)果以中位數(shù)M（Q1～Q3）表示，2組間等級相關(guān)采用spearman檢驗，定性資料采用χ2檢驗，顯著性檢驗標準為雙側(cè)P＜0.05。

2 結(jié) 果

2.1 NK細 胞頻 率、CD107a及 受 體 表 達 比較 2組患者外周血總NK細胞、CD56dimNK細胞、CD56brightNK細胞頻率差異無統(tǒng)計學意義。CD56dimNK細胞在活化性受體NKG2D、NKP30表達HCC組高于肝硬化組，差異有統(tǒng)計學意義。詳見表1和表2。

表1 CD56dimNK細胞頻率與CD107a及受體表達頻率［M（P25， P75） ，%］Table 1 Frequency of CD56dimNK cells， and expressing frequence of CD107a and its receptor

表2 CD56brightNK細胞頻率與CD107a及受體表達頻率［M（P25， P75） ，%］Table2 Frequency of CD56brightNK cells， and expressing frequency of CD107a and its receptor ［M（P25， P75） ，%］

2.2 NK細胞IFN-γ、TNF-α表達頻率比較 IL-12刺激后，CD56dimNK細胞、CD56brightNK細胞IFN-γ、 CD56brightNK細胞TNF-α表達頻率LC組高于HCC組，差異有統(tǒng)計學意義。詳見表3。

表3 NK細胞IFN-γ與TNF-α表達頻率比較［M（P25， P75） ，%］Table 3 Comparison of frequency of IFN -γ and TNF-α of CD56brightNK and CD56dimNK cells under IL-12 stimulus［M（P25， P75） ，%］

2.3 NK細胞對K562細胞的殺傷率比較 2組患者外周血NK細胞對K562細胞的殺傷作用由表4可見，隨著效靶比（E∶T）的升高，K562細胞被殺傷的比例逐漸增大。HCC組NK細胞對K562的殺傷比例高于肝硬化組（P＜0.05）。

表4 NK細胞對K562細胞的殺傷率比較［M（P25， P75） ，%］Table 4 Comparison of the killing rate of NK cells to K562 cells［M（P25， P75） ，%］

2.4 NK細胞受體表達率與NK細胞毒功能相關(guān)分析 CD56dimNK細胞NKG2D、NKP30表達率與NK細胞殺傷K562細胞率等級相關(guān)分析顯示，NKP30表達率與效靶比1∶10時NK細胞殺傷率等級相關(guān)（r=0.336，P=0.045），其余P值皆＞0.05。

2.5 不同分期HCC患者NK細胞頻率、受體表達率及功能比較 按BCLC分期標準分為早、中、晚期3組，分別進行比較，3組患者NK細胞頻率、受體表達率、IFN-γ、TNF-α表達頻率、K562細胞殺傷率差異皆無統(tǒng)計學意義（P值皆＞0.05）。

3 討 論

NK細胞是骨髓來源的淋巴細胞，可通過細胞毒效應和分泌細胞因子非特異殺傷腫瘤細胞和病毒感染細胞。根據(jù)NK細胞表面CD56密度的不同，可將其分CD56bright和 CD56dim2種亞型，人體內(nèi)90%以上的NK細胞為高表達CD16且具有強烈的細胞毒效應的CD56dim細胞，而可產(chǎn)生大量細胞因子的CD56bright細胞不到10%。NK細胞主要通過2種方式誘導靶細胞的凋亡：顆粒胞吐作用和死亡受體作用。NK細胞受體主要有活化性受體NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、KIR2DS等和CD158a、CD158b等抑制性受體。NK細胞受體變化與細胞毒作用及腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］。許多研究顯示HCC患者外周血及癌組織標本中活化性受體表達降低而抑制性受體表達增強［5-7］。本研究顯示HCC組外周血CD56dimNK細胞在活化性受體NKG2D、NKP30表達頻率高于肝硬化組，結(jié)果與上述研究報道不一致?？赡芘c本研究分別檢測了CD56dimNK細胞和CD56brightNK細胞的活化性受體表達有關(guān)，而既往研究一般檢測總的NK細胞活化性受體表達頻率，且大部分研究選擇對照組為健康志愿者，本研究選擇的對照組為較健康志愿者NK細胞受體表達減低的肝硬化患者［8］。另本研究入選的HCC病例中少部分患者既往已行肝動脈栓塞化療或放射治療，而肝動脈栓塞化療和放射治療皆能提高NK細胞活化性受體表達［9-10］。

本研究中使用IL-12作為刺激劑，其刺激NK細胞分泌IFN-γ、TNF-α可以反映NK細胞分泌細胞因子的功能。本研究結(jié)果表明，經(jīng)IL-12刺激后CD56brightNK細胞IFN-γ、TNF-α表達率，CD56dimNK細胞IFN-γ表達率HCC組均低于肝硬化組，故說明HCC組NK細胞分泌細胞因子功能受損，結(jié)果與相關(guān)研究一致［11］。IFN-γ對人NK細胞識別功能的負調(diào)節(jié)作用，可抑制NK細胞系活化受體NKG2D的表達，增強抑制性受體NKG2A/B和KIR2DLI的表達［12］。本研究結(jié)果顯示HCC組外周血CD56dimNK細胞在活化性受體NKG2D、NKP30表達高于肝硬化組，推測可能與HCC組IFN-γ表達率低于肝硬化組有關(guān)，HCC患者NK細胞分泌IFN-γ減少，對活化性受體NKG2D抑制作用減弱，NKG2D受體表達增強。

NK細胞功能主要包括3個方面: 通過釋放穿孔素、顆粒酶等殺傷效應分子發(fā)揮細胞毒作用；分泌 IFN-γ、TNF-α等細胞因子調(diào)節(jié)免疫反應；通過表達配體或受體介導細胞凋亡、傳遞胞間信號等。本研究結(jié)果顯示HCC患者外周血NK細胞分泌IFN-γ、TNF-α功能受損，脫顆粒表達CD107a較肝硬化患者無明顯差異，但其表面活化性受體NKG2D、NKP30表達增高，同時對K562細胞的殺傷功能增強。NK細胞主要通過釋放粒酶和穿孔素殺傷靶細胞，其對K562細胞的殺傷的比例可以很好的反映NK細胞的殺傷功能。NK細胞主要通過2種方式誘導靶細胞的凋亡，顆粒胞吐作用和死亡受體作用。NK細胞中CD56dim是主要的釋放穿孔素、發(fā)揮主要的殺傷功能的亞群。本研究同時顯示2組患者CD56dimNK細胞百分率及脫顆粒表達CD107a功能無明顯差異，但活化性受體NKG2D、NKP30表達HCC組高于肝硬化組，且CD56dimNK細胞活化性受體NKP30表達率與效靶比1∶10時NK細胞殺傷率等級相關(guān)，說明HCC組NK細胞殺傷K562細胞功能較強與CD56dimNK細胞表面活化性受體高表達有關(guān)。NK細胞受體的表達情況與NK細胞功能密切相關(guān)。實驗表明，在NK細胞發(fā)揮細胞毒作用時，NKG2D和NCR常常具有協(xié)同作用。細胞表面表達呈低密度NCR的NK細胞（NCRdull型）時，NKG2D可發(fā)揮抗腫瘤作用，NK細胞受體變化與細胞毒作用及腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［13］。

本研究結(jié)果顯示HCC患者外周血NK細胞活化性受體表達增高、殺傷功能增強，提示在NK細胞介導的抗HCC免疫中，NK細胞受體發(fā)揮了重要的作用。為進一步通過調(diào)節(jié)NK細胞表面受體表達途徑，選擇合適的聯(lián)合免疫治療方法提供理論依據(jù)。

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（2015-12-09 收稿 2016-03-15 修回）

（責任編委 王永怡 本文編輯 盧福昱）

Peripheral NK cell frequency function and receptor expression in patients with hepatocellular carcinoma

ZHANG Ai-min， LIU Fang-fang， YANG Xiao， LI Wen-gang， HAN Ping， LIU Li-ying， DUAN Xue-zhang*Tumor Radiation Therapy Center， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China * Corresponding author， E-mail: duanxuezhang2006@163.com

Objective To explore the changes of peripheral NK cell frequency， functions and the expression of the activating and inhibitory receptors on the surface of NK cells in patients with hepatocellular carcinoma （HCC）， and to analyze the features of these two-type receptors in HCC patients. Methods Flow cytometry was detected in 36 cases of HCC patients， 34 patients with hepatitis B liver cirrhosis （LC） patients with peripheral blood NK cell frequency and receptor 158a， cd158b， NKG2D and NKp30 and NKP44，NKp46 expression， with interleukin 12 （IL-12） stimulation of peripheral blood mononuclear cells （PBMC） and flow cytometry detection of NK cell secretion of IFN-and TNF-A， and with the flow type cell toxicity analysis method was used to detect NK cells on K562 cell killing efficiency， through the analysis and comparison of the two groups of NK cell frequency， receptors and function. Results There was no significant difference in the frequency of NK cells between the two groups （P＞0.05）. The expression of NKG2D and NKP30 in CD56dimNK cells was higher than that in LC group （P＜0.05）. The expression rate of IFN-， TNF- and IFN- in CD56brightNK cells stimulated by IL-12 was lower than that in LC group （P＜0.05）. The ratio of HCC cells to K562 was higher in group NK than in group LC （P ＜0.05）. Conclusions In group NK， the ability of secreting cytokines of HCC cells was lower than that of LC group， but the killer function was stronger than that of LC group， which might be related to the high expression of the surface active receptor.

killer cells； carcinoma， hepatocellular ； flow cytometry； cytotoxicity， immunologic

［中國圖書資料分類號］ R392.12；R512.6 A

1007-8134（2016）04-0213-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2016.04.005

首都特色課題（Z151100004015002）

100039 北京 ，解放軍第三〇二醫(yī)院腫瘤放射治療中心（張愛民、楊曉、李文剛、韓萍、劉麗英、段學章），肝衰竭診療研究中心（柳芳芳）

段學章，E-mail: duanxuezhang2006@163.com