李忠財(cái)，　董會(huì)娜，　叢麗娜，　張大偉*

1. 大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院， 大連 116034；2. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所， 天津 300308

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雙組份轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)BrnFE的過(guò)表達(dá)和表面活性劑的添加對(duì)谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-異亮氨酸的影響

李忠財(cái)1,2，董會(huì)娜2，叢麗娜1*，張大偉2*

1. 大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院， 大連 116034；2. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所， 天津 300308

為了提高L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株CorynebacteriumglutamicumLD320的產(chǎn)酸水平，通過(guò)改善其分泌系統(tǒng)，在C.glutamicumLD320中分別過(guò)表達(dá)突變型和野生型的雙組份轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)BrnFE操縱子，構(gòu)建了重組菌LD320/pXMJ19-brnFE和LD320/pXMJ19-brnFE1。通過(guò)對(duì)兩株重組菌的L-異亮氨酸生產(chǎn)分析比較，發(fā)現(xiàn)突變型比野生型能更有效地提高L-異亮氨酸產(chǎn)量。同時(shí)對(duì)LD320/pXMJ19-brnFE1進(jìn)行表面活性劑添加實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Tween-80為最佳選擇，其最佳添加量為0.5 g/L，最佳添加時(shí)間為對(duì)數(shù)期的16 h。最后通過(guò)7 L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)，LD320/pXMJ19-brnFE1的L-異亮氨酸產(chǎn)量由18.53 g/L提高到25.45 g/L，比對(duì)照組提高了37%。

雙組份轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)BrnFE； 表面活性劑； 谷氨酸棒桿菌； L-異亮氨酸

L-異亮氨酸(L-isoleucine，ILE)又稱“異白氨酸”，是八種必需的氨基酸之一[1]，是人體激素、蛋白質(zhì)合成和能量生成的原料[2, 3]，被廣泛應(yīng)用在食品添加劑、藥物和動(dòng)物飼料等方面[4]。目前，谷氨酸棒桿菌及棒桿菌屬中的相關(guān)微生物已廣泛應(yīng)用于包括L-異亮氨酸在內(nèi)的多種氨基酸生產(chǎn)中[5-7]。在谷氨酸棒桿菌代謝合成L-異亮氨酸過(guò)程中，當(dāng)胞內(nèi)L-異亮氨酸積累到一定量時(shí)，就會(huì)反饋抑制其合成途徑的一些關(guān)鍵酶，從而抑制L-異亮氨酸的合成[8]。因此，對(duì)于谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-異亮氨酸的發(fā)酵來(lái)說(shuō)，如何提高細(xì)胞對(duì)L-異亮氨酸的外排，對(duì)進(jìn)一步提高L-異亮氨酸的產(chǎn)量具有重要的意義。

BrnFE是谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)中負(fù)責(zé)支鏈氨基酸L-異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)輸?shù)碾p組份轉(zhuǎn)運(yùn)載體[9]，由brnFE基因編碼。當(dāng)谷氨酸棒桿菌胞內(nèi)的支鏈氨基酸量積累到一定程度時(shí)，便會(huì)激活brnFE操縱子表達(dá)[10]，使L-異亮氨酸等氨基酸外排到胞外。通過(guò)過(guò)表達(dá)brnFE基因，可以減少L-異亮氨酸在谷氨酸棒桿菌胞內(nèi)的積累，削弱L-異亮氨酸在胞內(nèi)對(duì)合成途徑中關(guān)鍵酶的反饋抑制作用，從而增加其產(chǎn)量[11]。

同時(shí)利用表面活性劑也可以改善細(xì)胞膜通透性，在微生物發(fā)酵中經(jīng)常被用來(lái)提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量[12]。它可加快物質(zhì)傳遞運(yùn)輸，增加胞內(nèi)胞外的物質(zhì)平衡，從而提高了細(xì)菌對(duì)底物、產(chǎn)物的耐受度，解決發(fā)酵產(chǎn)物、副產(chǎn)物對(duì)微生物細(xì)胞生長(zhǎng)和酶活性的抑制[13-15]。

本文通過(guò)在L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株C.glutamciumLD320中過(guò)量表達(dá)突變型brnFE1基因，增強(qiáng)了胞內(nèi)L-異亮氨酸到胞外的外排，使其產(chǎn)量增加。同時(shí)選擇添加表面活性劑作進(jìn)一步細(xì)胞通透性的改善，并對(duì)其添加量和添加時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，最后在7 L發(fā)酵罐上進(jìn)行了放大實(shí)驗(yàn)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒

文中所用菌株與質(zhì)粒均列于表1中，所用引物均列于表2中。

表1　菌株與質(zhì)粒

表2　引物

1.1.2酶和試劑

試劑：限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司，DNA聚合酶PrimerSTAR Mix購(gòu)自Takara，2xTaq PCR MasterMix， DNA Marker (Marker III和1 kb Marker)和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302-02)購(gòu)于北京天根生化科技有限公司，質(zhì)粒小提試劑盒(D6943-02)和柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(D6492-02)購(gòu)自O(shè)MEGA，L-異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司提供，其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

儀器：HPX-9162MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Agilent Technologies 1 200高效液相色譜，Agilent Technologies；PTC-1148型PCR儀，美國(guó)BIO-RAD公司；V-1 600可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；SBA-40E生物傳感儀，山東省科學(xué)院生物研究所。

1.1.3培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂粉20，pH 7.0。121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖40.0，(NH4)2SO42.0，KH2PO4·3H2O 1.0，MgSO4·7H2O 0.6，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.01，初始pH 7.0。115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60.0，酵母粉3，(NH4)2SO410.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，MgSO4·7H2O 0.6，MnSO4·H2O 0.015，KH2PO4·3H2O 1.0，VB10.004，VH 0.000 5, 初始pH 7.0。115 ℃滅菌30 min。

可根據(jù)需要，在各培養(yǎng)基中分別添加相應(yīng)抗生素：氯霉素，20 μg/mL。

1.2實(shí)驗(yàn)方法及測(cè)定

1.2.1培養(yǎng)方法

(1) 斜面活化培養(yǎng)：從-80 ℃冰箱取出保藏菌種劃線于固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)12 h ～18 h。

(2) 種子培養(yǎng)：用接種環(huán)從新鮮活化斜面上挑取2環(huán)谷氨酸棒桿菌于種子基本培養(yǎng)基中(500 mL三角瓶，裝液量為25 mL，9層紗布封口)，30 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，OD600約為1.5～1.8。

(3) 搖瓶分批發(fā)酵培養(yǎng)：將種子培養(yǎng)液按10%的接種量接入發(fā)酵基本培養(yǎng)基中(500 mL三角瓶，裝液量為25 mL，9層紗布封口)，30 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)進(jìn)行L-異亮氨酸分批發(fā)酵，pH由CaCO3調(diào)節(jié)。

1.2.2pXMJ19-brnFE和pXMJ19-brnFE1表達(dá)載體的構(gòu)建

分別以C.glutamicumATCC13032和C.glutamicumLD320染色體DNA為模板，使用帶有BamHI酶切位點(diǎn)的brnFE-F和帶有EcoRI酶切位點(diǎn)的brnFE-R為引物PCR擴(kuò)增出L-異亮氨酸輸出蛋白基因brnFE和brnFE1。使用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI分別對(duì)PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒pXMJ19進(jìn)行雙酶切，連接產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入DH5α，在終濃度為20 μg/mL氯霉素的LB平板上37 ℃培養(yǎng),用引物YZ-F和YZ-R鑒定長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子，挑選陽(yáng)性克隆，測(cè)序。

1.2.3感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌采用電轉(zhuǎn)化法，C.glutamicumLD320 感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化方法參照余秉琦等[16]和van der Rest ME等[17]的方法。

1.2.4表面活性劑的添加對(duì)L-異亮氨酸發(fā)酵的影響

精確稱取各種表面活性劑，分別配置80 g/L的母液，按照實(shí)驗(yàn)的不同要求，在無(wú)菌條件下，吸取相應(yīng)的表面活性劑母液，添加到發(fā)酵液中。繼續(xù)培養(yǎng)直至培養(yǎng)結(jié)束。探討其對(duì)L-異亮氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響，并進(jìn)一步優(yōu)化其添加量和添加時(shí)間。

1.2.5菌體生長(zhǎng)測(cè)定

發(fā)酵液用蒸餾水稀釋適當(dāng)倍數(shù)，測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下的OD值，使其數(shù)值在0.2～0.8之間。菌體干重表示為OD×稀釋倍數(shù)×0.3 g (DCW)/L。

1.2.6殘?zhí)菨舛葴y(cè)定

采用SBA-40E生物傳感儀測(cè)定。取發(fā)酵液1 mL離心，取上清液10 μL，稀釋100倍后，取25 μL稀釋液進(jìn)樣直接讀數(shù)。

1.2.7氨基酸含量的測(cè)定[18, 19]

L-異亮氨酸含量采用高效液相分析系統(tǒng)測(cè)定，色譜分離條件：Agilent C18(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)，2，4-二硝基氟苯柱前衍生測(cè)定，乙腈與NaAc溶液進(jìn)行梯度洗脫，柱溫33 ℃，流動(dòng)相流量1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

2　結(jié)果與討論

2.1brnFE在C.glutamicumATCC13032和LD320中的序列比對(duì)

在谷氨酸棒桿菌中，雙組份轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)BrnFE由基因brnFE編碼，負(fù)責(zé)支鏈氨基酸L-異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)輸，brnFE基因來(lái)源于野生型菌株C.glutamicumATCC13032，brnFE1基因來(lái)源于L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株C.glutamicumLD320。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在brnF1基因上有一個(gè)突變位點(diǎn)(C419T)，導(dǎo)致了一個(gè)氨基酸(Thr140Ile)的改變，在brnE1基因上有一個(gè)突變位點(diǎn)(C110G)，導(dǎo)致一個(gè)氨基酸(Gln32Arg)的改變。由于LD320是L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株，因此brnFE1基因位點(diǎn)的突變可能會(huì)加大L-異亮氨酸的外排，進(jìn)而增加其產(chǎn)量。

2.2LD320/pXMJ19-brnFE和LD320/pXMJ19-brnFE1重組菌株的構(gòu)建

以L-異亮氨酸生產(chǎn)菌C.glutamicumLD320和C.glutamicumATCC13032基因組DNA為模板克隆brnFE和brnFE1基因片段，將純化后的PCR產(chǎn)物雙酶切后連接到表達(dá)載體pXMJ19上，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pXMJ19-brnFE和pXMJ19-brnFE1，如圖1所示。

圖1　重組質(zhì)粒pXMJ19-brnFE 和pXMJ19-brnFE1的構(gòu)建

將測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pXMJ19-brnFE、pXMJ19-brnFE1和對(duì)照質(zhì)粒pXMJ19分別電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化LD320感受態(tài)細(xì)胞，用含有氯霉素20 μg/mL的LB平板進(jìn)行篩選并用引物YZ-F和YZ-R鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，所得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為工程菌LD320/pXMJ19-brnFE和LD320/pXMJ19-brnFE1，保存菌株。

2.3不同菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-異亮氨酸的比較

將構(gòu)建好的LD320/pXMJ19，LD320/pXMJ19-brnFE和LD320/pXMJ19-brnFE1菌株分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，以LD320為對(duì)照。發(fā)酵65 h后，分別取樣比較發(fā)酵液中不同菌株發(fā)酵過(guò)程中L-異亮氨酸及副產(chǎn)物積累的差異情況，如圖2所示。

1.LD320； 2. LD320/pXMJ19； 3. LD320/pXMJ19-brnFE； 4. LD320/pXMJ19-brnFE1；

圖2不同菌株發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸產(chǎn)量

由圖可2知，出發(fā)菌株LD320可累積L-異亮氨酸3.66 g/L，亮氨酸0.35 g/L，纈氨酸0.56 g/L。

LD320/pXMJ19中的氨基酸產(chǎn)量有所下降，L-異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸的產(chǎn)量分別為3.47 g/L、0.31 g/L和0.50 g/L，分別較出發(fā)菌株下降5.2%、11.4%和9.7%，表明空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)入對(duì)于菌體合成氨基酸有一定的影響，這可能是由于菌體代謝負(fù)擔(dān)加重的原故。在LD320/pXMJ19-brnFE菌株中的氨基酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株LD320都只有少許增加，這與Yin等[11]的研究結(jié)果相一致。而LD320/pXMJ19-brnFE1菌中L-異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸的產(chǎn)量分別為4.44 g/L、0.41 g/L和0.68 g/L，分別較出發(fā)菌株提高21%、17.1%和21.8%。可以看出，與野生型brnFE基因相比，過(guò)量表達(dá)brnFE1基因可以有效增加L-異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸的外排量。說(shuō)明在突變型brnFE1基因上發(fā)生的兩個(gè)位點(diǎn)(C419T)和(C110G)突變有利于L-異亮氨酸等支鏈氨基酸的外排，減少了其在胞內(nèi)的積累，從而削弱了代謝途徑中的反饋抑制，使其產(chǎn)量增加。

2.4添加表面活性劑

2.4.1不同表面活性劑對(duì)L-異亮氨酸發(fā)酵的影響

為進(jìn)一步增加LD320/pXMJ19-brnFE1工程菌的細(xì)胞膜通透性，選擇添加陰離子表面活性劑SDS、陽(yáng)離子表面活性劑NP-10、非離子表面活性劑Tween-20、Tween-40、Tween-80和Triton X-100進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，采用相同初始濃度0.1 g/L，分別在LD320/pXMJ19-brnFE1發(fā)酵0 h添加，發(fā)酵65 h后，分別取樣測(cè)定發(fā)酵液中菌體生物量及L-異亮氨酸產(chǎn)量，考察不同表面活性劑對(duì)生物量和L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖3所示。

圖3　幾種表面活性劑對(duì)(a)菌體OD600及(b)L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響

由圖可知，Tween-80效果最好，對(duì)菌體生物量影響不大，同時(shí)能夠提高L-異亮氨酸的產(chǎn)量，而Tween-20、Tween-40和Triton X-100的添加對(duì)L-異亮氨酸產(chǎn)量和生物量都有少許的抑制作用，SDS和NP-10對(duì)L-異亮氨酸的產(chǎn)量有明顯的抑制作用。因此添加的表面活性劑選定為Tween-80，并對(duì)其添加量和添加時(shí)間作進(jìn)一步優(yōu)化。

2.4.2Tween-80最優(yōu)添加濃度的確定

將表面活性劑Tween-80設(shè)置不同的濃度梯度，在LD320/pXMJ19-brnFE1發(fā)酵0 h添加進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵65 h后，分別取樣測(cè)定發(fā)酵液中菌體生物量及L-異亮氨酸產(chǎn)量，考察其對(duì)菌體生物量和L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在發(fā)酵初始階段(0 h)，較低濃度表面活性劑Tween-80的添加，并不影響菌體生長(zhǎng)，且有助于L-異亮氨酸產(chǎn)量的提高。當(dāng)其濃度達(dá)到0.5 g/L時(shí)L-異亮氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大值，繼續(xù)增加Tween-80的濃度則對(duì)菌體的生長(zhǎng)及L-異亮氨酸的產(chǎn)量出現(xiàn)了明顯的抑制。當(dāng)發(fā)酵液中Tween-80濃度超過(guò)2.0 g/L時(shí)細(xì)胞干重下降近26%。因此選取0.5 g/L為最優(yōu)添加濃度。

圖4　不同濃度的Tween-80對(duì)(a)菌體OD600及(b)L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響

2.4.3Tween-80最優(yōu)添加時(shí)間的確定

因?yàn)楸砻婊钚詣┚哂懈淖兗?xì)胞膜通透性和殺菌作用，不同的加入時(shí)間會(huì)直接影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝[20]。因此通過(guò)改變Tween-80不同的添加時(shí)間，尋找最優(yōu)的添加時(shí)間對(duì)LD320/pXMJ19-brnFE1發(fā)酵產(chǎn)L-異亮氨酸產(chǎn)量有重要意義。選擇分別在對(duì)數(shù)期后的12 h、14 h、16 h和18 h加入終濃度為0.5 g/L的Tween-80進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵65 h后分別取樣測(cè)定L-異亮氨酸產(chǎn)量和生物量，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5(a)所示為搖瓶中LD320/pXMJ19-brnFE1的生長(zhǎng)曲線及Tween-80的添加時(shí)間。圖5(b)為不同時(shí)間點(diǎn)添加Tween-80后L-異亮氨酸產(chǎn)量、菌體生物量及單位細(xì)胞產(chǎn)酸量(ILE/DCW=異亮氨酸與菌體干重的比值)。從結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，在16 h添加Tween-80時(shí)，菌體量為10.31 g/L，L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到最高點(diǎn)4.71 g/L。LD320/pXMJ19-brnFE1單位細(xì)胞合成L-異亮氨酸的能力也達(dá)到最高0.46。與對(duì)照相比，添加Tween-80使得單位細(xì)胞合成L-異亮氨酸的能力得到提高。這可能由于在不影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)的條件下，添加Tween-80提高了細(xì)胞膜的通透性，加大了細(xì)胞分泌L-異亮氨酸的能力。

2.5發(fā)酵罐評(píng)價(jià)

根據(jù)搖瓶?jī)?yōu)化的結(jié)果，在7 L發(fā)酵罐上進(jìn)行了一次性添加Tween-80對(duì)LD320/pXMJ19-brnFE1產(chǎn)L-異亮氨酸發(fā)酵影響的放大實(shí)驗(yàn)。選擇添加時(shí)間為發(fā)酵對(duì)數(shù)期(16 h)，添加濃度為0.5 g/L，將未加表面活性劑Tween-80的LD320作為對(duì)照組。發(fā)酵結(jié)果如圖6。圖6(a)所示為L(zhǎng)D320對(duì)照組的菌體生物量、L-異亮氨酸產(chǎn)量和葡萄糖消耗的曲線，圖6(b)為L(zhǎng)D320/pXMJ19-brnFE1的菌體生物量、L-異亮氨酸產(chǎn)量和葡萄糖消耗的曲線。

從圖中可以看出，在發(fā)酵周期內(nèi)，葡萄糖消耗方面LD320/pXMJ19-brnFE1和對(duì)照組的情況幾乎一致。菌體生物量方面，由于LD320/pXMJ19-brnFE1菌內(nèi)攜帶的質(zhì)粒和表面活性劑Tween-80的添加使得其生物量始終低于對(duì)照組。L-異亮氨酸產(chǎn)量方面，LD320/pXMJ19-brnFE1的產(chǎn)量為25.45 g/L，與對(duì)照組的18.53 g/L相比，產(chǎn)量提高了37%左右。

圖5　不同時(shí)間添加表面活性劑對(duì)L-異亮氨酸分批發(fā)酵的影響(a)搖瓶分批發(fā)酵生長(zhǎng)曲線；(b)不同添加時(shí)間下的生物量、單細(xì)胞產(chǎn)酸、異亮氨酸產(chǎn)量

(a) LD320； (b) LD320/pXMJ19-brnFE1

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株C.glutamicumLD320中過(guò)表達(dá)突變型brnFE1基因和野生型brnFE基因的比較發(fā)現(xiàn)，突變型的brnFE1基因能有效加強(qiáng)L-異亮氨酸的外排能力，其搖瓶產(chǎn)量可達(dá)到4.44 g/L，較出發(fā)菌株提高了21%，而野生型brnFE基因只少量的提高了L-異亮氨酸產(chǎn)量，這表明發(fā)生在brnFE1基因上的兩個(gè)突變位點(diǎn)(C419T)和(C110G) 有利于L-異亮氨酸的外排。

為進(jìn)一步增加LD320/pXMJ19-brnFE1細(xì)胞膜的通透性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較Tween-20、Tween-40、Tween-80、Triton X-100、SDS和NP-10六種表面活性劑發(fā)現(xiàn)，Tween-80能夠在不影響菌體生長(zhǎng)的情況下增加細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)L-異亮氨酸分泌到胞外。對(duì)其添加量及添加時(shí)間優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，在LD320/pXMJ19-brnFE1對(duì)數(shù)期16 h加入終濃度0.5 g/L的Tween-80能有效增加L-異亮氨酸的產(chǎn)量。

最后結(jié)合brnFE1基因過(guò)表達(dá)和添加表面活性劑Tween-80優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在7 L發(fā)酵罐上進(jìn)行了放大實(shí)驗(yàn)，在發(fā)酵65 h后，LD320/pXMJ19-brnFE1的L-異亮氨酸產(chǎn)量由18.53 g/L到25.45 g/L，相比對(duì)照組提高了37%。本研究對(duì)于進(jìn)一步提高谷氨酸棒桿菌的L-異亮氨酸生產(chǎn)能力具有一定指導(dǎo)意義。

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Effects of overexpressing two-component export system BrnFE and adding surfactants on L-isoleucine production byCorynebacteriumglutamicum

LI Zhong-cai1,2, DONG Hui-na2, CONG Li-na1, ZHANG Da-wei2

1. School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China; 2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

In order to increase L-isoleucine productivity inCorynebacteriumglutamicumLD320, the L-isoleucine secretion system was improved. Both the mutatedbrnFEoperon and the wild typebrnFEoperon were cloned into the shutter expression vector pXMJ19 individually, and the resultant plasmids pXMJ19-brnFEand pXMJ19-brnFE1 were transformed into LD320. Then the L-isoleucine production by these two strains was compared and analyzed. More L-isoleucine was produced by LD320/pXMJ19-brnFEthan that by LD320/pXMJ19-brnFE1. In addition, the effects of several surfactants on growth and L-isoleucine production by LD320/pXMJ19-brnFE1 were investigated. The shaking flask results revealed that Tween-80 played a key role in cell growth and L-isoleucine production. The suitable concentration of Tween-80 was 0.5 g/L and the optimal adding time was 16 h. Furthermore, the effects of Tween-80 on cell growth and L-isoleucine production by LD320/pXMJ19-brnFE1 was also investigated in a 7 L fermentor. The concentration of L-isoleucine increased from 18.53 g/L to 25.45 g/L, which was 37% higher than that of the control strain.

BrnFE; surfactants;Corynebacteriumglutamicum; L-isoleucine

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.001

國(guó)家自然基金(31370089)，天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(14ZCZDSY00065)，天津市自然科學(xué)基金(16JCYBJC23500，15JCQNJC09500)。

李忠財(cái)(1989～)，男，碩士研究生。E-mail:li_zhc@tib.cas.cn。

叢麗娜(1962～)，女，教授。E-mail:linacong@163.com；張大偉(1978～)，男，研究員。E-mail:zhang_dw@tib.cas.cn。