張琳，　何德根，　陳慧

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臨床論著

兒童反復(fù)呼吸道感染外周血Th17細(xì)胞、唾液中分泌型免疫球蛋白A/白蛋白比值變化及其意義

張琳，何德根，陳慧

目的探討兒童反復(fù)呼吸道感染(RRTIs)外周血Th17細(xì)胞、唾液中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)與血清白蛋白(ALB)比值變化及其意義。方法2014年10月至2015年7月廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山市中醫(yī)院兒科收治RTTIs患兒100例，其中急性期和緩解期各50例。同期選取門診體檢的健康兒童50例為正常對(duì)照組。流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17細(xì)胞表達(dá)率，酶標(biāo)儀檢測(cè)唾液中sIgA，免疫比濁法檢測(cè)ALB。結(jié)果RRTIs患兒急性期組、緩解期組外周血Th17細(xì)胞數(shù)較正常對(duì)照組患兒增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RRTIs患兒急性期組外周血Th17細(xì)胞數(shù)高于緩解期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。外周血中Th17陽性細(xì)胞數(shù)與呼吸道感染嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(P<0.05)。正常對(duì)照組唾液中sIgA與血清白蛋白比值顯著高于RRTIs患兒急性期組、緩解期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RRTIs患兒急性期組與緩解期組唾液中sIgA與血清白蛋白比值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論RRTIs患兒外周血Th17細(xì)胞表達(dá)增加，且與其病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。RRTIs患兒存在黏膜免疫功能低下，增強(qiáng)呼吸道免疫功能能從根本上減少RRTIs的發(fā)作。

反復(fù)呼吸道感染；Th17細(xì)胞；唾液分泌型IgA；免疫；兒童

兒童反復(fù)呼吸道感染(recurrent respiration tract infections，RRTIs)是兒科門診常見的疾病，也是一種非常復(fù)雜的疾病。RRTIs病程中與氣道高反應(yīng)性、黏膜免疫功能紊亂、免疫功能低下密切相關(guān)[1]。分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，sIgA)/白蛋白(albumin，ALB)能直接反映患兒呼吸道的黏膜免疫功能，外周血Th17細(xì)胞與病毒、細(xì)菌等感染密切相關(guān)[2-4]。本研究探討RRTIs患兒唾液中sIgA/ALB、外周血Th17在病程急性期、緩解期與健康兒童的差異，探討其與RRTIs患兒病程及病情輕重的關(guān)系，研究RRTIs的免疫學(xué)改變。

1　資料與方法

1.1臨床資料2014年10月至2015年7月廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山市中醫(yī)院兒科收治RTTIs患兒100例，其中急性期和緩解期各50例。RRTIs急性期組中男23例，女27例；年齡3～8歲，平均(5.4±2.4)歲。緩解期組中男28例，女22例；年齡3～8歲，平均(6.5±2.0)歲。同期選取門診體檢的健康兒童50例為正常對(duì)照組，其中男24例，女26例；年齡3～8歲，平均(5.9±2.2)歲。3組受試對(duì)象在年齡、性別方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《反復(fù)呼吸道感染的臨床概念與處理原則》[5]進(jìn)行診斷，RRTIs 1年以內(nèi)上、下呼吸道感染頻數(shù)超出正常范圍。

1.3納入標(biāo)準(zhǔn)(1)符合RRTIs的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡3～8歲；(3)患兒家屬知情同意。

1.4排除標(biāo)準(zhǔn)(1)RRTIs急性期患兒患病超過3 d，標(biāo)本收集前2周使用免疫抑制劑、免疫增強(qiáng)劑者；(2)RRTIs緩解期患兒近期有急性上呼吸道感染史，標(biāo)本收集前2周使用免疫增強(qiáng)劑者；(3)正常對(duì)照組患兒有心肺及過敏性疾病、急性呼吸道感染等，標(biāo)本收集前2周使用免疫抑制劑、免疫增強(qiáng)劑及激素類藥物者。

1.5檢測(cè)方法

1.5.1sIgA/ALB檢測(cè)取所有研究對(duì)象上午10時(shí)唾液，具體方法如下：飲入漱口水或瓶裝飲用水，用力漱口后，用一次性空針注射器抽取自然分泌唾液5～10 mL，將唾液置于試管內(nèi)離心(2 000 r/min，離心15 min，離心半徑8 cm)，取上清液于EP管內(nèi)，將EP管保存于-20 ℃冰箱內(nèi)待用。嚴(yán)格按購買試劑盒操作步驟說明進(jìn)行檢測(cè)。儀器：80-2型離心機(jī)(上海醫(yī)療器械有限公司)；Bio-Tek E13412E型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(USA)；MDF-U5411型-20 ℃低溫冰箱(SONY公司)；酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(北京北方偉業(yè)生物技術(shù)有限公司)。抽取清晨空腹血2 mL，檢測(cè)ALB，計(jì)算sIgA/ALB。

1.5.2Th17細(xì)胞檢測(cè)新鮮的2 mL靜脈血用等量的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)稀釋，采用Ficoll密度梯度離心法(使用人淋巴細(xì)胞分離液由天津市灝洋生物制品有限責(zé)任公司提供)，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×109/L，取2 mL細(xì)胞懸液，種植至24孔板(美國(guó)Costar公司)，加入0.05 mg/L佛波酯0.1 μg，1 mmol/L離子霉素2 μmol，1.4 mg/L莫能星2.8 μg。充分混勻后置于37 ℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，2 500 r/min，離心10 min，離心半徑25 cm)，棄上清，PBS洗滌2次后，加入20 μL PE標(biāo)記的鼠抗人CD4抗體(CD4抗體由美國(guó)Biolegend公司提供)。室溫避光孵育30 min。PBS洗滌2次，固定液室溫避光固定20 min后，3 000 r/min離心5 min，離心半徑17.4 cm)，棄上清，PBS洗滌2次，加入破膜劑(室溫避光孵育20 min后，3 000 r/min離心5 min，離心半徑17 cm)，棄上清，PBS洗滌2次后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2　結(jié)果

3組兒童外周血Th17細(xì)胞表達(dá)率、唾液中sIgA與血清白蛋白比值的檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1　3組兒童外周血Th17細(xì)胞表達(dá)率、唾液中sIgA與血清白蛋白比值的檢測(cè)結(jié)果±s)

表1結(jié)果表明，RRTIs患兒急性期組、緩解期組外周血Th17細(xì)胞數(shù)較正常對(duì)照組患兒增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RRTIs患兒急性期組外周血Th17細(xì)胞數(shù)高于緩解期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。外周血中Th17陽性細(xì)胞數(shù)與呼吸道感染嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r=0.838，P<0.05)，呼吸道感染越嚴(yán)重，外周血中Th17細(xì)胞表達(dá)越高。正常對(duì)照組唾液中sIgA與血清白蛋白比值顯著高于RRTIs患兒急性期組、緩解期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RRTIs患兒急性期組與緩解期組唾液中sIgA與血清白蛋白比值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3　討論

RRTIs是一種小兒常見病，發(fā)病率高達(dá)20.3%[6]。RRTIs常見的原因有先天解剖因素、免疫缺陷、支原體感染、營(yíng)養(yǎng)不良、微量元素缺乏等，其中RRTIs與兒童免疫功能低下密切相關(guān)已獲共識(shí)[7]。研究表明，作為機(jī)體內(nèi)因條件的免疫功能持續(xù)異常是RRTIs反復(fù)發(fā)生的主要病因[8]。黏膜是人體第一道免疫屏障，sIgA是在人體外分泌液中發(fā)現(xiàn)的一種IgA抗體，是人類黏膜免疫的主要抗體[9]。支氣管黏膜是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其中最主要的是sIgA。sIgA多聚體的交叉連接效應(yīng)可阻止微生物與上皮細(xì)胞受體之間的相互作用，從而封閉了其黏附到黏膜上皮細(xì)胞，進(jìn)而入侵機(jī)體的致病途徑[9]；而在選擇性sIgA缺乏者，機(jī)體循環(huán)免疫復(fù)合物水平比正常人顯著增高，易患消化道和呼吸道感染等的發(fā)生率也顯著增高[10]。唾液中的sIgA可直接反映黏膜免疫功能狀態(tài)，但受血液IgA漏出的影響，不宜作為直接的檢測(cè)指標(biāo)。由于尚無確切研究證明血液中的IgA與氣管黏膜的sIgA有必然相關(guān)性，若單純檢測(cè)血液中的免疫球蛋白來評(píng)估黏膜免疫功能不具有充分的科學(xué)依據(jù)且暫無確切試驗(yàn)。ALB是維持血漿膠體滲透壓的主要功能蛋白(大約構(gòu)成80%的膠體滲透壓)，ALB的濃度反映黏膜滲透性，因此，以唾液中sIgA與血液ALB濃度的比值作為檢測(cè)指標(biāo)，可以減少血液IgA漏出帶來的檢測(cè)誤差，得到相對(duì)準(zhǔn)確的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，RRTIs患兒急性期、緩解唾液sIgA/ALB較正常兒童顯著減少，反復(fù)的呼吸道感染導(dǎo)致sIgA合成障礙和免疫受損，向黏膜表面轉(zhuǎn)運(yùn)又受影響，這既是反復(fù)感染的結(jié)果，也是容易再次感染的原因。本研究中RRTIs患兒急性期、緩解期唾液sIgA/ALB并無明顯變化，表明在患兒RRTIs期間，黏膜免疫功能持續(xù)低下，病情暫時(shí)緩解時(shí)，黏膜免疫功能并未改善。

Th17細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞亞群[11]，其主要產(chǎn)生IL-17A、IL-17F等細(xì)胞因子[12]，故在宿主防御及炎癥性疾病中起重要的作用。但在其對(duì)抗機(jī)體內(nèi)多種細(xì)菌、真菌、病毒感染的同時(shí)，也可能通過炎癥反應(yīng)而引起病理性損傷[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，RRTIs患兒Th17細(xì)胞表達(dá)率均高于健康對(duì)照組，且急性期增高更明顯(P<0.05)。進(jìn)行直線相關(guān)分析后發(fā)現(xiàn)，外周血中Th17細(xì)胞表達(dá)與呼吸道感染嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(P<0.05)，呼吸道感染越嚴(yán)重，外周血中Th17細(xì)胞表達(dá)越高。說明RRTIs過程中，Th17細(xì)胞發(fā)揮了一定的抗感染效應(yīng)，同時(shí)又可導(dǎo)致免疫損傷，引起呼吸道感染的反復(fù)發(fā)生。綜上，RRTIs患兒體內(nèi)存在Th17高表達(dá)，同時(shí)存在氣道黏膜免疫下降，如能增強(qiáng)患兒的氣道黏膜免疫功能，同時(shí)避免疾病過程中引起的進(jìn)一步免疫損傷，就可縮短病程，改善預(yù)后。

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(本文編輯：劉穎)

Changes of Th17 cells in peripheral blood and the ratio of sIgA/ALB in saliva in children with recurrent respiratory tract infection and their significance

ZHANGLin，HEDegen，CHENHui.

DepartmentofPediatrics,ZhongshanHospitalofTraditionalChineseMedicine，Zhongshan528400，China.

ObjectiveTo observe and explore the significance and changes of Th17 cells in peripheral blood and ratio of sIgA/ALB in human saliva.MethodsA total of 100 RRTIs children were divided into two groups: acute group(n=50) and remission group(n=50).Another 50 normal healthy children were included as the control group. The expression rate of Th17 cells was detected by flow cytometry, the expression rate of sIgA in saliva was detected by enzymatic-reader,and the ALB was detected by immune turbidity method.ResultsThe circulating frequencies of Th17 cells in acute and remission group were higher than those in healthy control group(P<0.05), while those in acute group were higher than those in remission group(P<0.05).There were significantly difference in these groups(P<0.05). The circulating frequencies of Th17 cells were positively correlated with the severity of recurrent respiratory tract infection(P<0.05). The ratio of sIgA and serum albumin in saliva in healthy control group was significantly higher than that of acute group and remission group in RRTIs children(P<0.05),but that was no significant difference between acute and remission group(P>0.05).ConclusionThe circulating frequencies of Th17 cells in RRTIs children are increased, and are positively correlated with the severity of the RRTIs. The function of mucosal immune function in RRTIs children is low, so enhancing the immune function of the respiratory tract can fundamentally reduce the attack of RRTIs.

Recurrent respiratory tract infections(RRTIs);Th17 cells;SIgA in saliva;Immune;Child

中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015B1207)

528400 廣東 中山，廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山市中醫(yī)院兒科

張琳(1978-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師。研究方向:小兒腎病的中西醫(yī)診斷與治療

陳慧，E-mail：530656552@qq.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2016.04.005

R725.6

A

1674-3865(2016)04-0387-03

2015-10-19)