范三紅，杜靜婷，王相帥（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

響應(yīng)面法優(yōu)化油松花粉蛋白酶解工藝

范三紅，杜靜婷，王相帥
（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

以油松花粉蛋白為原料，蛋白水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)油松花粉蛋白酶解工藝進(jìn)行研究。首次優(yōu)選出堿性蛋白酶為最佳水解酶，然后在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)挑選出對(duì)油松花粉水解工藝有顯著影響的三個(gè)因素：加酶量、pH和底物濃度。采用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)曲面分析法得到油松花粉蛋白水解的最優(yōu)工藝條件為：加酶量0.04 g/g樣品，pH11.1，底物濃度0.09 g/mL，酶解時(shí)間5 h，酶解溫度50℃，油松花粉蛋白的水解度為79.07%。本文的研究為油松花粉多肽及其功能性食品的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

油松花粉，蛋白，蛋白酶水解，響應(yīng)面

油松又名松黃，泛指馬尾松、油松、赤松、黑松和云南松等松屬植物的雄性配子體，是我國(guó)傳統(tǒng)食藥兼用的花粉品種［1］。松花粉作為生命的遺傳物質(zhì)，含有豐富的蛋白質(zhì)、微量元素、必需脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)成分及黃酮，多糖等生物活性物質(zhì)［2-3］，而且配比合理，有“微型營(yíng)養(yǎng)庫”之稱［4］，花粉內(nèi)部的蛋白質(zhì)含量為7%～35%，氨基酸占總量的20%左右［5］?，F(xiàn)代藥理藥效研究表明油松花粉及其提取物具有抗衰老、抗疲勞、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)整機(jī)體代謝、增強(qiáng)非特異性免疫功能、清除羥自由基等功效［6-7］，其保健和治療作用已得到國(guó)內(nèi)外廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用［8］。

通過對(duì)油松花粉蛋白的水解處理，可將蛋白酶解為多肽，有利于更好的開發(fā)油松花粉蛋白，有效提高油松花粉蛋白的利用率［9］。研究證明，將大分子的蛋白酶解成多肽以后，更有利于人體的吸收，使得油松花粉蛋白的功能特性得到充分體現(xiàn)，同時(shí)不破壞花粉原有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［10］。尹樹花，郭麗梅采用正交法優(yōu)化了堿性蛋白酶水解油松花粉蛋白質(zhì)工藝［11］，并對(duì)兩種堿性蛋白酶的水解效果進(jìn)行了對(duì)比［12］。李升軍等［13］把制備的油松花粉小肽加入化妝品中，初次研究了油松花粉在化妝品方面的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)利用PB因素篩選實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定出了油松花粉的最佳酶解工藝條件，不僅準(zhǔn)確度高，也為日后研究油松花粉多肽和開發(fā)油松花粉蛋白的功能性食品奠定了理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

油松花粉蛋白實(shí)驗(yàn)室自制，純度85.66%；酸性蛋白酶5萬U/g、堿性蛋白酶20萬U/g、木瓜蛋白酶50萬U/g北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉分析純，天津化學(xué)試劑三廠；茚三酮分析純，上海三愛思試劑有限公司。

HRHS24型電熱恒溫水浴鍋青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司；TG16A-WS型高速離心機(jī)武漢愛斯佩科學(xué)儀器有限公司；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱天津市泰斯特儀器有限公司；JP-040ST型超聲波清洗機(jī)深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；868型酸度計(jì)美國(guó)奧利龍公司；JA1203N型電子天平上海精密科學(xué)儀器有限公司；SP-2000UV型紫外可見分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1酶解工藝流程選擇一定的底物濃度→水浴→調(diào)節(jié)pH→加酶→水浴鍋水浴→煮沸滅酶→離心取上清液→測(cè)量水解度［14］。

1.2.2水解酶的篩選選取酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶及其復(fù)合酶分別對(duì)油松花粉蛋白進(jìn)行水解。計(jì)算蛋白水解度，并篩選出水解油松花粉蛋白的最佳水解酶。

1.2.3油松花粉蛋白水解度的單因素實(shí)驗(yàn)采用控制變量法，分別研究加酶量、pH、底物濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度五個(gè)因素對(duì)油松花粉蛋白水解度的影響［15］。

1.2.3.1加酶量在pH為11，底物濃度為0.06 g/mL樣品，酶解時(shí)間為3 h，酶解溫度為45℃，加酶量分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/g樣品的條件下對(duì)油松花粉蛋白進(jìn)行酶解。

1.2.3.2pH在加酶量為0.03 g/g樣品，底物濃度為0.06 g/mL樣品，酶解時(shí)間為3 h，酶解溫度為45℃，pH分別為9、10、11、12、13的條件下對(duì)油松花粉蛋白進(jìn)行酶解。

1.2.3.3底物濃度在加酶量為0.03 g/g樣品，pH為11，酶解時(shí)間為3 h，酶解溫度為45℃，底物濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/mL的條件下對(duì)油松花粉蛋白進(jìn)行酶解。

1.2.3.4酶解時(shí)間在加酶量為0.03 g/g樣品，pH為11，底物濃度為0.06 g/mL樣品，酶解溫度為45℃，酶解時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h的條件下對(duì)油松花粉蛋白進(jìn)行酶解。

1.2.3.5酶解溫度在加酶量為0.03 g/g樣品，pH為11，底物濃度為0.06 g/mL樣品，酶解時(shí)間為3 h，酶解溫度分別為35、40、45、50、55℃的條件下對(duì)油松花粉蛋白進(jìn)行酶解。

1.2.4Plackett-Burman篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素基礎(chǔ)上，對(duì)加酶量、pH、底物濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度五個(gè)因素進(jìn)行顯著性篩選實(shí)驗(yàn)，選擇對(duì)油松花粉蛋白水解度有顯著影響的因子，進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

1.2.5響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)和Plackett-Burman篩選實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)所確定的因子進(jìn)行Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)，確定出油松花粉水解的最優(yōu)條件。

表1　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 1　Range of different factors investigated with Plackett-Burman

表2　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 2　Factors and levels of Box-Behnken design

1.3水解度的測(cè)定和計(jì)算方法

采用茚三酮比色法測(cè)定水解度［16］，首先將煮沸滅酶的油松花粉蛋白水解液離心取其上清液4 mL，再加蒸餾水4 mL，取稀釋后的油松花粉蛋白水解液2 mL，加pH為8的緩沖溶液1.0 mL，茚三酮溶液1.0 mL，沸水浴加熱10～15 min，冷卻，在570 nm處測(cè)其吸光度值（蒸餾水做空白對(duì)照）。另取同樣條件的原油松花粉蛋白溶液，在570 nm處測(cè)其吸光度值，按照如下公式計(jì)算油松花粉蛋白水解度。

式中：A表示在標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出的蛋白質(zhì)的質(zhì)量（μg）；w表示樣品質(zhì)量（g）；V1表示水解液的總體積（mL）；V2表示顯色時(shí)所稀釋液的體積（mL）。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Minitab 15.0，Design Expert 8.0.6，Excel軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2　結(jié)果與分析

2.1水解酶的篩選

由圖1可以看到不同種類的酶和復(fù)合酶以及復(fù)合酶的比例對(duì)油松花粉蛋白水解度的影響趨勢(shì)，油松花粉蛋白水解的結(jié)果由圖1所示。單獨(dú)選取堿性蛋白酶時(shí)，水解度最大。選取酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶以及這三種酶復(fù)合水解時(shí)，油松花粉蛋白的水解度均有不同程度的降低。這可能是因?yàn)槊傅膶Ｒ恍?，?shí)驗(yàn)中蛋白來源是由堿提酸沉法所提取，堿溶性蛋白居多，因而選擇堿性蛋白酶時(shí)，油松花粉蛋白水解度最大［17］。

2.2油松花粉水解度的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1加酶量對(duì)油松花粉水解度的影響由圖2可以看出加酶量對(duì)油松花粉蛋白水解度的影響趨勢(shì)隨著加酶量的提高而逐漸增大，但在加酶量大于0.04 g/g樣品后，水解度的增大趨勢(shì)明顯減小。這可能是因?yàn)榧用噶吭?.04 g/g樣品之后，蛋白的水解程度達(dá)到最大，酶解反應(yīng)已經(jīng)充分，再增加酶也無法促進(jìn)水解反應(yīng)?？紤]到節(jié)約材料，所以選擇最佳加酶量為0.04 g/g樣品。

圖1　不同種類的酶及其復(fù)合酶的不同比例對(duì)油松花粉蛋白水解度的影響Fig.1　Effect of different proportions of enzymes and different types of compound enzyme on the degree of hydrolysis of pine pollen

圖2　加酶量對(duì)水解度的影響Fig.2　Effect of total enzyme dose on hydrolysis degree

2.2.2pH對(duì)油松花粉蛋白水解度的影響由圖3可以看到pH對(duì)油松花粉蛋白水解度的影響趨勢(shì)，隨著pH的提高，水解度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)pH 為11時(shí)，水解度達(dá)到最大。這可能是因?yàn)殡S著pH增大，逐漸接近堿性蛋白酶的最適pH，當(dāng)pH繼續(xù)增大，堿性太強(qiáng)，有可能酶的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，酶活性降低，使得水解度下降。

圖3　pH對(duì)水解度的影響Fig.3　Effect of pH on hydrolysis degree

2.2.3底物濃度對(duì)油松花粉蛋白水解度的影響由圖4可以看到底物濃度對(duì)油松花粉蛋白水解度的影響趨勢(shì)，隨著底物濃度的提高，水解度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在底物濃度為0.08 g/mL時(shí)，水解度達(dá)到最大。這可能是因?yàn)樵诘孜餄舛冗^低時(shí)，油松花粉蛋白與水解酶的接觸不是很充分，而隨著底物濃度增大，水解反應(yīng)逐漸充分。在底物濃度過大時(shí)，溶液濃度較高，阻礙了與酶的接觸，使油松花粉蛋白水解度下降。

圖4　底物濃度對(duì)水解度的影響Fig.4　Effect of substrate concentration on hydrolysis degree

2.2.4酶解時(shí)間對(duì)油松花粉蛋白水解度的影響由圖5可以看到酶解時(shí)間對(duì)油松花粉蛋白水解度的影響趨勢(shì)，在酶解的初期，隨著酶解時(shí)間的增加，油松花粉蛋白水解度也增大，但是在4 h之后，水解度趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的增加，水解反應(yīng)不斷的進(jìn)行使得水解度也不斷增大，在4 h之后，蛋白的酶解反應(yīng)基本已經(jīng)充分，水解度不會(huì)有明顯的增大。

圖5　酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.5　Effect of time on hydrolysis degree

2.2.5酶解溫度對(duì)油松花粉蛋白水解度的影響由圖6可以看到酶解溫度對(duì)油松花粉蛋白水解度的影響趨勢(shì)，隨著酶解溫度的上升，水解度先增大后減小，在溫度為50℃時(shí)達(dá)到最大。這可能是因?yàn)殡S著酶解溫度的上升，水解酶的活性也在增大，促進(jìn)了水解反應(yīng)的進(jìn)行。溫度高于50℃時(shí)，酶的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酶活性下降，水解反應(yīng)得到抑制。

2.3Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)顯著影響因子的確定

圖6　酶解溫度對(duì)水解度的影響Fig.6　Effect of temperature on hydrolysis

表3　Plackett-Burman Design實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3　Response values of Plackett-Burman Design

2.3.1PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理及響應(yīng)值在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)加酶量、pH、底物濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度這五個(gè)因素進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，以油松花粉蛋白水解度為響應(yīng)值，以此篩選出具有顯著性影響的因素。Plackett-Burman Design實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。2.3.2顯著影響因素的確定利用Minitab 15.0軟件油松花粉因素篩選實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，得到PB實(shí)驗(yàn)的回歸模型方差分析和回歸方程顯著性檢驗(yàn)表。

表4　回歸模型方差分析表Table 4　Regression analysis of variance table

由表4可知，主效應(yīng)的p＜0.001，決定系數(shù)R2= 0.9651，說明實(shí)驗(yàn)所得的擬合回歸方程達(dá)到顯著水平；校正決定系數(shù)R2adj=0.9361，表明本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)變異可以用此回歸方程來解釋，因此可以較好地確定關(guān)鍵影響因素。

由表5回歸方程顯著性檢驗(yàn)表可知，因素A、B、C 的p值小于0.01，說明這三個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)具有極顯著的影響。因此，在油松花粉水解度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，對(duì)A、B、C即加酶量、pH、底物濃度進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。D、E分別選擇酶解時(shí)間5 h，酶解溫度50℃作為最優(yōu)工藝條件。

表5　回歸方程顯著性檢驗(yàn)表Table 5　Regression equations significant test table

表6　Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6　Box-Behnken Design and response values

2.4響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)最佳工藝條件的確定

2.4.1Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果以油松花粉蛋白水解度為響應(yīng)，利用Minitab 15.0軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表6。

對(duì)表6中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到油松花粉蛋白水解度對(duì)溫度、加酶量、時(shí)間的三元二次回歸方程為：

Y=4.0800A+0.9752B+3.5900C-7.5308A2-9.6358B2-4.2808C2+2.4550AB-0.8900AC+0.0150BC+78.5376

表7　回歸方程方差分析Table 7　Analysis of variances for the fitted regression model

從回歸系數(shù)方差分析（表7）可以看出，本實(shí)驗(yàn)所選的三元二次回歸模型具有較好的顯著性（p＜0.01），各因素對(duì)油松花粉蛋白的線性關(guān)系也呈現(xiàn)極顯著性（p＜0.01），平方項(xiàng)對(duì)該模型具有極顯著性（p＜0.01），交互作用不具有顯著性（p＞0.05）。決定系數(shù)R2=0.9778，校正決定系數(shù)R2adj=0.9380，說明該模型能解釋93.8%響應(yīng)值的變化，從失擬項(xiàng)在p=0.14＞0.05（不顯著），說明可以利用該回歸方程確定油松花粉蛋白的最佳水解度［17-19］。

表8　回歸系數(shù)顯著性分析Table 8　Significance test for each regression coefficient of the fitted regression model

從回歸系數(shù)顯著性分析（表8）可以看出，A、C、A2、B2、C2這幾個(gè)因素對(duì)油松花粉蛋白水解度的影響是極顯著的（p＜0.01），說明在該實(shí)驗(yàn)中，加酶量、底物濃度對(duì)油松花粉蛋白水解度有極顯著影響，而從A2、B2、C2影響極顯著也可以看出，它們對(duì)油松花粉蛋白水解度的影響是非線性的［20-21］。

2.4.2響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化根據(jù)以上的分析利用Design Expert 8.0.6分別作出該響應(yīng)面分析的曲面圖形。圖7～圖9可以直觀的分析出加酶量、pH、底物濃度對(duì)油松花粉蛋白水解度的影響。

加酶量和pH的交互作用對(duì)油松花粉水解度的影響由圖7所示，加酶量在0.04～0.05 g/g樣品之間，pH 在10.5～11.5時(shí)，油松花粉蛋白水解度存在最大值。加酶量和底物濃度的交互作用對(duì)油松花粉水解度的影響由圖8所示，加酶量在0.04～0.05 g/g樣品之間，底物濃度在0.08～0.10 g/mL時(shí)，油松花粉蛋白水解度存在最大值。pH和底物濃度的交互作用對(duì)油松花粉水解度的影響由圖9所示，pH在10.8～11.2之間，底物濃度在0.08～0.10 g/mL時(shí)，油松花粉蛋白水解度存在最大值。

圖7　加酶量和pH交互影響水解度的響應(yīng)面圖Fig.7　Response surface for the effects of total enzyme dose and pH on hydrolysis degree

圖8　加酶量和底物濃度交互影響水解度的響應(yīng)面圖Fig.8　Response surface for the effects of total enzyme dose andsubstrate concentration on hydrolysis degree

圖9　pH和底物濃度交互影響水解度的響應(yīng)面圖Fig.9　Response surface for the effects of pH and substrateconcentration on hydrolysis degree

利用Minitab 15.0，對(duì)油松花粉蛋白水解度工藝條件經(jīng)行優(yōu)化預(yù)測(cè)，得出理論最佳工藝條件為：加酶量為0.043 g/g樣品，pH為11.091，底物濃度為0.089 g/mL，酶解時(shí)間5 h，酶解溫度50℃，油松花粉蛋白水解度最大為80.029%。

2.4.3油松花粉蛋白水解工藝條件的驗(yàn)證與確定為了進(jìn)一步驗(yàn)證響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)論的準(zhǔn)確性，同時(shí)考慮到實(shí)驗(yàn)操作的可行性及方便性，對(duì)預(yù)測(cè)的最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行修正：加酶量為0.04 g/g樣品，pH為11.1，底物濃度為0.09 g/mL，酶解時(shí)間5 h，酶解溫度50℃。按照此優(yōu)化條件對(duì)油松花粉蛋白進(jìn)行水解，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并取平均值作為最后實(shí)驗(yàn)結(jié)果。據(jù)此得到油松花粉蛋白水解度為79.13%、78.99%、79.08%，平均蛋白水解度為79.07%，與預(yù)測(cè)值80.29%相差不大，說明本模型能較好的預(yù)測(cè)油松花粉蛋白水解度的實(shí)際效果，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

3　結(jié)論

油松花粉蛋白的酶解工藝中，篩選出堿性蛋白酶為水解油松花粉蛋白質(zhì)的最佳選擇，加酶量、pH、底物濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度5個(gè)單因素中，加酶量、pH和底物濃度達(dá)到了極顯著水平。對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化分析，得出最佳水解工藝為加酶量0.04 g/g樣品，pH11.1，底物濃度0.09 g/mL，酶解時(shí)間5 h，酶解溫度50℃，在此條件下油松花粉水解度可達(dá)到79.07%。通過對(duì)油松花粉蛋白酶解工藝的優(yōu)化能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)提取的關(guān)鍵共性技術(shù)有理論與實(shí)際應(yīng)用方面的指導(dǎo)意義，為促進(jìn)油松花粉資源高值化利用和精深加工提供一定的技術(shù)支撐。

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Optimization of hydrolysis of Chinese pine pollen protein by response surface methodology

FAN San-hong，DU Jing-ting，WANG Xiang-shuai
（College of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

With protein of Chinese pine pollen as the raw material protein hydrolysis degree as an evaluation index，this paper aimed to study the process conditions of pine pollen proteolysis.The alkaline protease was choosen as the bast hydrolase.On the basis of single factor experiment，the Plackett-Burman screening test was adopted to determine three factors（which signifcantly affect）significantly affecting hydrolysis of Chinese pine pollen as：total enzyme dose，pH and substrate concentration.Then，the hydrolysis process conditions of pine pollen protein was optimized by Box-Behnken center combination experiment and response surface methodology.Results showed that the optimum conditions for hydrolysis were as follows：enzyme concentration 0.04 g/g，pH11.1，substrate concentration 0.09 g/mL，enzymatic time 5 h，enzymatic temperature 50℃.Under the optimal conditions，the hydrolysis degree of Chinese pine pollen protein could reach 79.07%.This study provided a theoretical basis for the development of Chinese pine pollen peptides and functional foods.

pine pollen；protein；protease hydrolysis；response surface

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0236-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.039

2015－06－10

范三紅（1963-），男，副教授，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：fsh729@sxu.edu.cn。

山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012011031-4）；山西省高等學(xué)校高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目（20111003）。