陳柏雄，黃佳俊，林俊芳，*，郭麗瓊，*，陳俊飛，劉英麗（.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品生物技術(shù)研究所，廣東廣州50640；.齊魯工業(yè)大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東濟南505；.北京工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京00048）

重組枯草芽孢桿菌素subtilosin A基因的合成及其在畢赤酵母中的表達(dá)

陳柏雄1，黃佳俊1，林俊芳1，*，郭麗瓊1，*，陳俊飛2，劉英麗3
（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品生物技術(shù)研究所，廣東廣州510640；2.齊魯工業(yè)大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東濟南250353；3.北京工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京100048）

人工改造并合成subtilosin A的結(jié)構(gòu)基因（rsbo A），并在畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。結(jié)果表明：經(jīng)陽性大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落PCR和測序鑒定，表明重組質(zhì)粒pPIC9K-sbo構(gòu)建正確；經(jīng)陽性酵母轉(zhuǎn)化子的菌落PCR產(chǎn)物電泳檢測，可見清晰目的基因條帶，證明重組酵母GS115-pPIC9K-sbo構(gòu)建正確；經(jīng)枯草芽孢桿菌素蛋白電泳檢測，可見明顯蛋白條帶，表明重組rsbo A基因在畢赤酵母GS115中獲得了分泌表達(dá)。在抑菌效果檢測中，重組酵母工程菌的發(fā)酵液對銅綠假單胞菌具有一定的抑菌活性。本研究開創(chuàng)了有望替代抗生素的小分子肽細(xì)菌素異源表達(dá)新思路，為枯草芽孢桿菌素subtilosin A的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

subtilosinA，基因重組，畢赤酵母，抗菌活性

細(xì)菌素是由微生物合成的具有抑制特定微生物生長的一種多肽，由于其抑菌的特異性，有望成為替代抗生素成為新一代的治療細(xì)菌感染的藥物。枯草芽孢桿菌素subtilosin A是一種環(huán)狀細(xì)菌素，蛋白分子內(nèi)含有三個特殊的硫醚鍵［1］，最早是從枯草芽孢桿菌168中分離得到［2］，其蛋白合成與后期加工通過八個基因的基因簇sbo-alb進(jìn)行調(diào)控［3］，其中sbo基因作為結(jié)構(gòu)基因，編碼多肽前體［4］，前體肽的成熟要經(jīng)過幾個獨特的化學(xué)修飾過程。

subtilosin A作為Ⅰ類細(xì)菌素，具有分子量小，擁有特殊蛋白結(jié)構(gòu)，具有很寬的抗菌譜，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、好氧菌與厭氧菌都有抑制作用［5］。近幾年，對疾病相關(guān)病原體的研究也表明了subtilosin A對單純胞疹病毒Type 1［6］、與陰道疾病相關(guān)的病原體［7］具有抑制作用，有望成為代替抗生素作為新型治療藥物。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）因具有對外源基因翻譯后加工，如糖基化、蛋白磷酸化等特點，同時也具有培養(yǎng)容易、生長快、表達(dá)高等優(yōu)點，現(xiàn)已作為一種外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于基因工程研究中［8］。

目前，國內(nèi)外對subtilosin A基因改造已進(jìn)行廣泛的研究。孫會剛等利用強啟動子P45分別與subtilosin A合成基因簇中sbo-albA、albB-albC連接轉(zhuǎn)化回枯草芽孢桿菌168中以提高subtilosin A的產(chǎn)量［9］。Quanli Liu等通過構(gòu)建purL基因缺失的解淀粉芽孢桿菌以提高subtilosin A的產(chǎn)量［10］。目前國內(nèi)外對其研究中，只是在其原始報道的來源菌株芽孢桿菌中進(jìn)行改造，但是其產(chǎn)量低而無法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的問題始終未能得到解決。由于利用非芽孢桿菌菌株進(jìn)行表達(dá)以提高其產(chǎn)量的研究目前未見報道，本研究試圖將subtilosin A的前體編碼基因sbo按照畢赤酵母的密碼子偏好性進(jìn)行改造，讓其于畢赤酵母中表達(dá)，利用酵母菌的蛋白翻譯后加工的能力，大量獲得有活性的枯草芽孢桿菌素subtilosin A。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大腸桿菌（Escherichia coli DH5α）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）本實驗室保存；畢赤酵母菌（Pichia pastoris GS115）及表達(dá)載體pPIC9K Invitrogen公司；質(zhì)粒小提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒北京天根生化科技有限公司；Taq聚合酶、T4連接酶、DNA marker 3、DNA Marker 1廣州東盛生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶NotⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ、Premixed Protein Marker（Low）TaKaRa公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

電子分析天平ALC-2104瑞士METTLER TOLEDO公司；核酸凝膠電泳儀DYY-6C北京六一儀器廠；小型垂直蛋白電泳儀美國Bio-Rad公司；干式恒溫器MK-20杭州奧盛儀器有限公司；微量臺式冷凍離心機FRESC21美國Thermo Fisher公司。

1.2實驗方法

1.2.1培養(yǎng)基的配制LB培養(yǎng)基：Trypton 10 g/L，Yeast extraction 5 g/L，NaCl 10 g/L。

MD培養(yǎng)基：1.34%YNB，4×10-5%Biotin，2% Dextrose。

BMGY培養(yǎng)基：100 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH6.0），1.34%YNB，4×10-5%Biotin，1%Glycerol，1%Yeast Extract，2%Peptone。

BMMY培養(yǎng)基：將BMGY培養(yǎng)基中的1%Glycerol換成0.5%（v/v）甲醇。

1.2.2基因的設(shè)計及合成根據(jù)GenBank中登錄的枯草芽孢桿菌素subtilosin A的前體sbo成熟肽段的氨基酸序列（DQ452520.1），參照Codon Usage Database中的畢赤酵母偏愛密碼子表，利用DNASTAR軟件設(shè)計枯草芽孢桿菌素subtilosin A前體SBO核酸序列，并在兩端分別引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點，得基因全長146 bp，由上海捷瑞生物工程有限公司合成?；蛎Q為rsbo A。

1.3PCR引物

根據(jù)合成的重組sbo基因和pPIC9K的MCS上下游核酸序列設(shè)計引物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。重組sbo基因（擬擴增片段大小為146 bp）引物為：上游引物sbo-up：5’-GAA TTC ATG AAG AAG GCT GTT ATT G-3’（25 nt）和下游引物sbo-dn：5’-GCG GCC GCT TAA CCC CAC AAA CCA A-3’（25 nt）。pPIC9K的通用引物（擬擴增的片段大小為318 bp）：上游引物α-factor：5’-TAC TAT TGC CAG CAT TGC TGC-3’（21 nt）和下游引物3’AOX1：5’-GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC-3’（21 nt）。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃1 min，51℃1 min，72℃25 s，共29個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.4重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將連有rsbo基因的pGH載體及畢赤酵母pPIC9K載體分別經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切（50 μL體系中按酶活力單位比經(jīng)37℃酶切20 h），切膠回收目的基因rsbo片段及載體片段，按摩爾比5∶1經(jīng)DNA T4連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，經(jīng)篩選獲得重組菌。重組菌經(jīng)過培養(yǎng)提取重組質(zhì)粒并經(jīng)過PCR鑒定以及測序鑒定，獲得正確的重組質(zhì)粒，命名為pPIC9K-sbo。

1.5酵母轉(zhuǎn)化

將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-sbo和空載體pPIC9K分別電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母GS115，涂布于MD平板，30℃孵育2～3 d，于MD平板上挑陽性菌株單克隆于10 μL無菌ddH2O中，取其2 μL為模板，用引物α-Factor 和3′AOX1進(jìn)行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.6目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將陽性轉(zhuǎn)化子接種于25 mL BMGY培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)24 h，6000 r/min離心5 min，收集菌體，經(jīng)100 mL BMMY培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)入1 L的三角瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔24 h加入甲醇使其終濃度為1%進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每隔0、6、12、24、36、48、60、84 h取4 mL發(fā)酵液測量菌體OD600，1 mL發(fā)酵液離心收集上清進(jìn)行Tricine-SDS PAGE分析和細(xì)菌素抗菌活性的測定。

1.7Tricine-SDS PAGE分析

參照Sch?gger H的方法［11］。

1.8細(xì)菌素抗菌活性的測定

以銅綠假單胞菌作為指示菌初步測試發(fā)酵上清抗菌活性。挑銅綠假單胞菌單菌落于15 mL LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12 h獲得菌液。上述發(fā)酵60 h的發(fā)酵液離心后取上清，用0.22 μm濾膜過濾菌體獲得粗提的發(fā)酵液。取稀釋100倍的銅綠假單胞菌菌液100 μL，與粗提發(fā)酵液100 μL混合均勻后涂LB板；以稀釋100倍的銅綠假單胞菌菌液100 μL，與野生型酵母粗提發(fā)酵液混合涂板作為對照組。37℃培養(yǎng)18 h后觀察平板上菌落生長狀況，通過菌體生長速率比對情況作為初步的抑菌能力檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1含重組subtilosin A基因sbo的酵母重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

2.1.1目的基因rsboA的合成重組目的基因由上海捷瑞生物工程有限公司協(xié)助合成并連接至pGH質(zhì)粒上（圖1）。

圖1　pGH-sbo載體圖Fig.1　Vector of pGH-sbo

2.1.2重組質(zhì)粒pPIC9K-sbo的PCR鑒定分別進(jìn)行雙酶切的pGH-sbo質(zhì)粒與pPIC9K質(zhì)粒經(jīng)純化后過夜

圖2　pPIC9K-sbo菌落PCR檢測陽性克隆Fig.2　Colony PCR identification of positive clones of pPIC9K-sbo

圖3　合成基因與測序結(jié)果比對Fig.3　Sequence alignment of SBO and pPIC9K-sbo

連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Escherichia coli DH5α，通過含有100 μg/mL Amp的LB平板隨機篩選陽性克隆，用引物sbo-up和sbo-dn進(jìn)行菌落PCR，進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，獲得與目的基因146 bp大小一致的單一目的條帶（圖2）。結(jié)果表明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化DH5α，將含有重組質(zhì)粒菌體進(jìn)行測序，測序結(jié)果與合成基因相似度達(dá)100%（圖3）完全相同，因此判斷重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.1.3重組質(zhì)粒pPIC9K-sbo的PCR鑒定用試劑盒提取質(zhì)粒，將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-sbo電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母GS115，涂布于MD平板，隨機挑陽性克隆，用引物α-factor和3’AOX1進(jìn)行菌落PCR（圖4），進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，獲得與pPIC9K載體α因子上下游基因加上目的基因大小總和為318 bp大小一致的單一目的條帶，結(jié)果表明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化為GS115。

圖4　GS115-pPIC9K-sbo菌落PCR檢測陽性克隆Fig.4　Colony PCR identification of positive clones of GS115-pPIC9K-sbo

2.2含重組subtilosin A基因sbo的酵母表達(dá)與活性初測

2.2.1重組subtilosin A基因sbo表達(dá)產(chǎn)物的Tricine-SDS PAGE分析經(jīng)驗證的重組菌體GS115-pPIC9K-sbo劃平板分離，挑單菌落于25 mL BMGY中30℃振蕩搖菌過夜，離心收集菌體轉(zhuǎn)移至100 mL BMMY中進(jìn)行發(fā)酵，每24 h添加100%甲醇至發(fā)酵液中終濃度為0.5%，發(fā)酵60 h后取發(fā)酵液高速離心取上清液進(jìn)行Tricine-SDS PAGE分析，subtilosin A蛋白分子量大小為4.3251 ku，結(jié)果（圖5）顯示subtilosin A通過pPIC9K在畢赤酵母GS115中表達(dá)成功。

2.2.2重組subtilosin A基因sbo表達(dá)產(chǎn)物的活性測定

取上述發(fā)酵60 h發(fā)酵液離心后上清液，用0.22 μm濾膜過濾菌體獲得粗提的發(fā)酵液。以銅綠假單胞菌為指示菌株進(jìn)行初步的抑菌活力測試，結(jié)果見圖6，圖a為菌液與重組酵母發(fā)酵液混合涂板，圖b以野生酵母發(fā)酵液混合涂板當(dāng)對照。由于銅綠假單胞菌菌體在生長過程中會分泌綠膿菌素［12］，而使培養(yǎng)基帶淺綠色。如圖顯示，對比圖b平板，其菌體生長達(dá)到一定濃度而使培養(yǎng)基帶有淺綠色，而圖a平板上明顯顏色較淺，說明混有重組基因表達(dá)產(chǎn)物的菌體，在生長時受到了抑制，證明發(fā)酵產(chǎn)物具有一定的抑菌活力。

圖5　GS115-pPIC9K-sbo發(fā)酵液Tricine-SDS PAGE分析Fig.5　Fermentation broth of GS115-pPIC9K-sbo analyzed by Tricine-SDS PAGE

圖6　GS115-pPIC9K-sbo發(fā)酵液抑菌活力測試Fig.6　Anti-bacteria tested by fermentation broth of GS115-pPIC9K-sbo

3　結(jié)論

本實驗利用畢赤酵母作為真核生物具有成熟的蛋白加工能力，且畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有培養(yǎng)易、生長快、表達(dá)高等優(yōu)點，創(chuàng)新性地嘗試將枯草芽孢桿菌素subtilosin A在畢赤酵母GS115中進(jìn)行表達(dá)。首先合成并改造subtilosin A的結(jié)構(gòu)基因sbo，連接入pPIC9K穿梭載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中大量克隆，再通過電激轉(zhuǎn)化入畢赤酵母，通過Tricine-SDS PAGE分析顯示，subtilosin A已成功于畢赤酵母GS115中表達(dá)，進(jìn)一步以銅綠假單胞菌作為指示菌，初步證明了表達(dá)產(chǎn)物具有一定的抑菌活力。然而，本研究的結(jié)果顯示芽孢桿菌素的表達(dá)量依舊偏低，原因可能是芽孢桿菌素屬于小分子多肽，在酵母宿主中難以分離且易被酵母胞內(nèi)酶所降解，導(dǎo)致抑菌活力不穩(wěn)定，這些問題都有待進(jìn)一步研究。

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Synthesis of recombinant gene for Bacillus subtilis bacteriocin subtilosin A and its expression in Pichia pastoris

CHEN Bai-xiong1，HUANG Jia-jun1，LIN Jun-fang1，*，GUO Li-qiong1，*，CHEN Jun-fei2，LIU Ying-li3
（1.Department of Bioengineering，College of Food Science，South China Agricultural University，Institute of Food Biotechnology，South China Agricultural University，Guangzhou 510640，China；2.The School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Qi-Lu University of Technology，Ji’nan 250353，China；3.Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

In this study，the recombinant gene for subtilosin A（rsbo A）was synthesis for the sake of the expression for this bacteriocin in host cell P.pastoris.Both the results of colony PCR of positive Escherichia coli recombinants and DNA sequencing indicated that recombinant plasmid pPIC9K-sbo was constructed successfully.In addition，the results of colony PCR of positive P.pastoris recombinants indicated that recombinant Pichia GS115-pPIC9K-sbo was constructed successfully.Protein electrophoresis analysis of positive P.pastoris recombinants displayed that the recombinant gene rsbo A was secretory expressed in P.pastoris GS115. Analysis of antimicrobial activity showed that the fermentation broth of this recombinant yeast possess antibacterial activities against P.aeruginosa.The result of this work built a new strategy of bacteriocins，a small molecule peptide，in heterologous expression.The study laid a foundation for industrialized production of Bacillus subtilis antibiotic peptide subtilosin A.

subtilosin A；genetic recombinant；Pichia pastoris；antibacterial activity

TS201.3

A

1002-0306（2016）04-0228-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.037

2015－06－01

陳柏雄（1992-），男，碩士研究生，研究方向：微生物基因組學(xué)與基因工程，E-mail：bxiong63976@163.com。

林俊芳（1962-），男，研究員，研究方向：天然產(chǎn)物生物工程研究與產(chǎn)品開發(fā)，E-mail：linjf@scau.edu.cn。郭麗瓊（1963-），女，教授，研究方向：食品微生物和菌類食品研究與開發(fā)，E-mail：guolq@scau.edu.cn。

廣東省科技計劃項目（2015A020209121）；廣州市科技計劃項目（2015Y1-00173）；北京市教委一般項目（SQKM201610011004）。