王建國，閆冰雨，雷楗勇，吳　越，郭　蕾，邢　珂，*（.中山大學生命科學學院有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東廣州5075；.廣州世優(yōu)生物科技有限公司，廣東廣州500）

合成二肽ACE抑制活性及抗高血壓初步研究

王建國1，閆冰雨1，雷楗勇2，吳越1，郭蕾1，邢珂1，*
（1.中山大學生命科學學院有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東廣州510275；2.廣州世優(yōu)生物科技有限公司，廣東廣州510220）

目的：對合成二肽的ACE抑制活性進行系統(tǒng)地篩選，尋找具有高ACE抑制活性的二肽并研究其在動物體內(nèi)的降血壓作用。方法：利用可見光分光光度法對35種合成二肽的ACE抑制活性進行測定，并對具有高ACE抑制活性的二肽進一步測定其IC50值。選取ACE抑制效果最佳的二肽進行原發(fā)性高血壓大鼠（SHR）降血壓實驗。實驗采用灌胃方法分別以1、10、25、50、100 mg/kg的劑量溶于1 mL生理鹽水進行給藥，分別于給藥后2 h和4 h測量大鼠血壓變化。結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)大部分二肽都具有一定程度的ACE抑制活性，其中以氨基酸序列為半胱氨酸-丙氨酸（Cys-Ala，CA）和半胱氨酸-組氨酸（Cys-His，CH）的二肽ACE抑制活性最高，其ACE抑制率分別達到84.38%和70.79%。經(jīng)測定CA和CH的IC50值分別為23.22 μmol/L 和61.17 μmol/L。SHR大鼠降血壓實驗表明CA在體內(nèi)的降壓效果顯著。給藥后4 h CA降壓效果優(yōu)于給藥后2 h，給藥后2 h CA降壓效果與給藥劑量呈較好的正相關(guān)性（R2＞0.8）。結(jié)論：體外ACE抑制率測定及SHR大鼠降血壓實驗發(fā)現(xiàn)合成二肽CA具有較高的ACE抑制活性和較好的體內(nèi)降血壓效果，提示CA可以作為降血壓保健食品的添加成分，值得進一步研究。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，二肽，高血壓

高血壓是全球最常見的慢性病，是導致心血管病和腎臟病等發(fā)生以及死亡的最主要危害因素［1］。人體的血壓調(diào)節(jié)主要是受到血管緊張素系統(tǒng)（reninangiotensin system，RAS）和激肽系統(tǒng)（kallikrein kinin system，KKS）的控制，而血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）在這兩個系統(tǒng)中起著關(guān)鍵的作用［2］。在RAS系統(tǒng)中，ACE能夠使沒有生理活性的血管緊張素Ⅰ（AngiotensinⅠ，AngⅠ）轉(zhuǎn)化為具有升壓活性的血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）。在KKS系統(tǒng)中，ACE可將血管舒緩激肽降解為失活片段，導致血管收縮，引起血壓升高［3］。目前高血壓的藥物治療主要是對ACE進行抑制，阿利吉侖、卡托普利、依那普利、阿拉普利和賴諾普利都是廣泛應用的抗高血壓藥物。然而，這些藥物會引發(fā)諸如咳嗽、過敏、味覺紊亂和皮疹等副作用［4］，因此，尋找安全可靠、毒副作用小的ACE抑制劑成為抗高血壓藥物研究的熱點。

近年來，相關(guān)研究表明一些從動物［5-7］、植物［8］以及乳制品［9］中分離得到的天然生物活性肽具有抑制ACE活性、降低血壓的作用［10-11］。相比傳統(tǒng)降壓藥物，這些天然活性肽具有特異性高、毒副作用小、療效好、可用藥劑量更大等優(yōu)點［12-14］。其中二肽和三肽可以在小肽轉(zhuǎn)運蛋白的幫助下被腸粘膜完整的吸收，因此，這些二肽和三肽對ACE的抑制作用以及降壓效果也較為明顯［15-16］。目前，尚未有報道對二肽的氨基酸構(gòu)成以及其ACE抑制活性進行系統(tǒng)的分析研究，本研究旨在系統(tǒng)地對所有種類二肽的ACE抑制活性進行篩選，尋找ACE抑制活性較高的二肽并通過動物實驗明確其在體內(nèi)的降血壓效果，為合成高血壓治療藥物提供參考。由于實驗經(jīng)費和時間限制，本文僅包含了第一批35種合成二肽的實驗結(jié)果。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

35種合成二肽（名稱詳見表1）吉爾生化有限公司（人工合成），純度＞95%；卡托普利（Captoril） 西格瑪奧德里奇公司，純度≥98%；呋喃丙烯酰三肽（FAPhe-Gly-Gly，F(xiàn)APGG） 西格瑪奧德里奇公司，純度≥98%；ACE西格瑪奧德里奇公司；原發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneously Hypertensive Rats，SHR） 雄性，31周齡，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2012-0001，飼養(yǎng)一周適應環(huán)境后按每5只一組進行分組；生理鹽水山東華魯制藥有限公司。

VICTOR X多標記酶標儀酶標儀鉑金埃爾默公司；移液器法國吉爾森公司；BP-98A智能無創(chuàng)血壓儀北京軟隆生物技術(shù)有限公司；注射器上海雙鴿實業(yè)有限公司；灌胃針上海玻利鴿工貿(mào)有限公司；無特定病原體（Specific pathogen-free，SPF）級動物實驗室中山大學北校區(qū)動物實驗大樓。

1.2實驗方法

1.2.1ACE抑制率的測定本實驗將二肽樣本用超純水溶解后配制20 mg/mL原液，然后稀釋成20 μg/mL濃度的樣品作為實驗組，以0.002 μg/mL的Captoril溶液為陽性對照，以生理鹽水為陰性對照。實驗于37℃下，以340 nm為主波長檢測ACE底物FAPGG的吸光度，以405 nm為參比波長消除噪音影響，檢測以3 min為間隔連續(xù)檢測1 h。根據(jù)公式：抑制率（%）=×100，計算樣品的抑制率。其中E為樣品孔的ACE酶活（U/L），計算公式為E=×115；Ss為樣品孔ACE動力學曲線直線段的斜率，Sp為未加抑制劑孔的ACE動力學曲線直線段的斜率，Sb為空白孔ACE動力學曲線直線段的斜率。

1.2.2IC50測定實驗將二肽（CA、CH）原液稀釋成200 μg/mL濃度的樣品作為試樣，以20 μg/L濃度的Captoril樣品作為陽性對照，對各樣品按3濃度倍梯度進行稀釋，后按1.2.1所述方法測定樣品的ACE抑制率，進而計算IC50值。

1.2.3大鼠降壓實驗按照如下劑量：Captoril （100 mg/kg）、生理鹽水、CA（100、50、25、10、1 mg/kg）將相應藥品溶于生理鹽水中利用灌胃方式進行給藥。利用無創(chuàng)血壓儀分別測量大鼠灌胃前、灌胃后2 h、灌胃后4 h后的舒張壓（Diastolic Blood Pressure，DBP）、收縮壓（Systolic Blood Pressure，SBP）和平均動脈壓（Mean Blood Pressure，MBP），取其平均值作為相應的血壓值。

1.2.4統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用R（3.2.1版本）進行平均值、標準差的計算以及兩樣本均值單尾t檢驗，數(shù)值均以均值±標準誤表示。采用R（3.2.1版本）ggplot2包及plot函數(shù)作圖。

2　結(jié)果與討論

2.135種二肽的ACE抑制率

本研究用可見光分光光度法連續(xù)監(jiān)測35種二肽在1 h內(nèi)對ACE的抑制活性，結(jié)果見表1，發(fā)現(xiàn)除氨基酸序列為異亮氨酸-亮氨酸（Ile-Leu，IL）、異亮氨酸-纈氨酸（Ile-Val，IV）和賴氨酸-天冬氨酸（Lys-Asp，KD）的三種二肽外，其余32種二肽都對ACE有不同程度的抑制作用。32種二肽的平均ACE抑制率為12.05%，大部分二肽的ACE抑制率在0%～20%之間，其抑制效果相對較弱，而CA和CH的ACE的抑制效果則較為明顯，其抑制率分別達到84.38%和70.79%（圖1），極顯著高于其他二肽（p＜0.01）。相關(guān)研究曾發(fā)現(xiàn)從雞蛋清中分離到的序列為亮氨酸-色氨酸（Leu-Trp，LW）的二肽具有ACE抑制活性和抗高血壓作用，其ACE抑制IC50值為6.8 μmol/L［17］。本實驗測得LW的ACE抑制活性為14.77%，再次證實二肽LW具有ACE抑制作用。然而還未有相關(guān)研究對CA和CH的ACE抑制活性及抗高血壓作用進行探討，本研究發(fā)現(xiàn)CA和CH具有強于LW的抑制作用。

圖1　二肽CA和CH的ACE抑制活性Fig.1　ACE inhibitory activities of CA and CH

表1　35種二肽的ACE的抑制率Table 1　ACE inhibitor activities of 35 dipeptides

如圖1所示1 h連續(xù)檢測發(fā)現(xiàn)CA和CH對ACE的活性有持續(xù)穩(wěn)定的抑制作用，其抑制效果與0.002 μg/mL 的Captoril的作用效果相近。

2.2CA和CH的IC50測定

研究對二肽CA和CH的ACE抑制活性進行更加精確的測定，濃度梯度實驗結(jié)果顯示CA的IC50值為23.22 μmol/L，CH的IC50值為61.17 μmol/L，陽性對照Catopril的IC50值為3.07×10-4μmol/L。

2.3CA體內(nèi)降血壓實驗

相關(guān)研究表明部分ACE抑制劑的ACE抑制活性與實際降血壓作用之間存在差別［18］，因此，體外檢測所得到的具有高ACE抑制率的二肽是否能在生物體內(nèi)擁有好的降血壓效果還需要進一步的動物實驗來驗證。在本研究中選用CA進行SHR大鼠降血壓實驗。用CA、生理鹽水和Captoril對SHR大鼠進行灌胃，并分別于給藥后2、4 h監(jiān)測大鼠的血壓變化，結(jié)果見圖2、圖3。

如圖2所示當CA劑量為1 mg/kg時，給藥2 h后SHR大鼠血壓無明顯改變；當CA劑量達到10 mg/kg時，SHR大鼠血壓開始呈下降趨勢，其中SBP下降（16.1±4.73）mmHg（p=0.09），下降較為明顯。隨著CA劑量不斷提高，給藥2 h后SHR大鼠血壓下降幅度進一步增大，當CA劑量達到100 mg/kg時，SBP下降（49.26±10.42）mmHg，DBP下降（45.58±9.27）mmHg，MBP下降（47.01±9.64）mmHg，各指標均極顯著低于給藥前（p＜0.01），降壓效果與同等濃度的Catopril無顯著差異（p＞0.47）。

圖2　CA灌胃后2 h SHR大鼠血壓改變情況Fig.2　Antihypertensive effects of CA 2 h after oral administration to SHR

圖3　CA灌胃后4 h SHR大鼠血壓改變情況Fig.3　Antihypertensive effects of CA 4 h after oral administration to SHR

在給藥后4 h繼續(xù)檢測SHR大鼠血壓變化。發(fā)現(xiàn)當CA劑量為10 mg/kg時，給藥后4 h降壓作用基本消失（圖3）。而當CA劑量達到25 mg/kg時，其降壓效果則要優(yōu)于給藥后2 h。以SBP為例，用25 mg/kg的CA灌胃SHR大鼠后4 h的SBP比給藥前下降（50.86± 3.16）mmHg（p＜0.01），比給藥后2 h下降（27.67± 11.02）mmHg（p=0.08）；當CA濃度達到50 mg/kg和100 mg/kg時，給藥后4 h各血壓指標也較給藥后2 h低。DBP和MBP的變化與SBP一致。陽性對照Catopril 的DBP、MBP、SBP給藥后4 h比給藥后2 h分別下降（32.4±14.79）mmHg（p=0.14）、（34.5±14.83）mmHg （p=0.13）、（38.7±15.47）mmHg（p=0.12）。

由圖2和圖3可以看出，SBP、DBP、MBP下降幅度隨著CA劑量的增加整體呈上升趨勢。但灌胃后2 h以上各指標下降值與CA劑量呈很好的正相關(guān)，而在灌胃后4 h以上各指標變化值與CA劑量呈非線性關(guān)系。利用Pearson相關(guān)系數(shù)分析CA劑量與血壓指標灌胃前后的改變量之間的相關(guān)性，得到CA對應的各項指標的相關(guān)系數(shù)。如表2所示，CA灌胃后2 h的各項血壓指標的平均改變量與劑量的相關(guān)系數(shù)R2＞0.8（p＜0.05），說明CA急性藥效與劑量呈一定程度的正相關(guān)性，CA急性藥效的研究適宜在灌胃后2 h進行采樣。圖4反映了SHR大鼠給藥后2 h，SBP下降幅度隨CA劑量增加呈線性增長。以上結(jié)果同時顯示當CA劑量達到25 mg/kg后，給藥后4 h SHR大鼠血壓下降幅度不再隨劑量增加發(fā)生明顯改變，SBP下降水平維持在50 mmHg左右。

表2　CA劑量與灌胃前后血壓變化的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 2　Pearson correlation coefficient of changes of blood pressure and dose of CA

圖4　灌胃后2 h SHR大鼠SBP與CA劑量的關(guān)系Fig.4　The relationship of SBP at 2 h after oral administration and dosage of CA

針對生物活性肽降血壓效果的研究曾顯示，不同長度的短肽在SHR大鼠體內(nèi)的有效作用時間不同。二肽和三肽（如：IW、VW、LW、IY及LKP）因為較容易被腸粘膜完整的吸收，其達到最大藥效的時間一般在給藥后2 h左右，當時間超過2 h后其降壓效果就逐步降低［16-17，19］。而相對長一些的LKPNM、LVGRPRHQG和Captoril的最大藥效時間則是在給藥后4～8 h不等［17，19］。在本研究中發(fā)現(xiàn)，CA在給藥4 h后的降壓效果優(yōu)于給藥后2 h。分析其原因可能與CA在體內(nèi)吸收相較其他二肽更慢，或作用半衰期更長有關(guān)。

此外，從植物、動物或奶制品中分離得到的具有高ACE抑制活性的生物肽C端多為色氨酸（W）、苯丙氨酸（F）、酪氨酸（Y）和脯氨酸（P），而N端多為脂肪類支鏈氨基酸如纈氨酸（V）和異亮氨酸（I）［20-22］。氨基酸的構(gòu)成與短肽和ACE的親和能力緊密相關(guān)。而在本研究中，對35種二肽進行了系統(tǒng)的篩選，發(fā)現(xiàn)僅有的兩個N端為半胱氨酸的二肽CA和CH的ACE抑制活性明顯高于其他二肽。提示N端為半胱氨酸同樣有利于二肽和ACE結(jié)合，從而提高短肽的ACE抑制活性。這一發(fā)現(xiàn)為進一步的生物活性肽的降壓研究提供了新的線索。

3　結(jié)論

應用可見光分光光度法對35種合成二肽的ACE活性進行測定發(fā)現(xiàn)N端為半胱氨酸（Cys）的二肽CA 和CH具有較高的ACE抑制活性，SHR大鼠降血壓實驗進一步證明CA的體內(nèi)降壓效果明顯。由于二肽為生物體內(nèi)固有的分子，毒副作用相對較小且具有口服降壓的可能，因此，二肽分子CA和CH作為降血壓藥物或抗高血壓保健食品添加成分有一定的開發(fā)前景。此外，實驗結(jié)果同時提示研究二肽的ACE抑制活性具有重要科學和應用價值，實驗計劃進一步完成其余300余種二肽的ACE抑制活性研究。

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A preliminary study of inhibitory activities on angiotensin I-converting enzyme and antihypertensive effects of synthetic dipeptide

WANG Jian-guo1，YAN Bing-yu1，LEI Jian-yong2，WU Yue1，GUO Lei1，XING Ke1，*
（1.State Key Laboratory of Biocontrol，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China；2.Withyou Biotech Co.，Ltd.，Guangzhou 510220，China）

Objective：The purpose of this work was to study the inhibitory activities on angiotensin I-converting enzyme（ACE）and the antihypertensive effects of synthetic dipeptides.Methods：The inhibitory activities on ACE of 35 synthetic dipeptides were screened by using ultraviolet and visible spectrophotometry.The IC50of dipeptides with high inhibitory activity was also measured.The antihypertensive effects of dipeptides were subsequently studied in spontaneously hypertensive rats（SHR）at 2 h and 4 h after oral administration diluted in 1 mL normal saline according to the dosages of 1，10，25，50，100 mg/kg，respectively.Results：With the exception of a few dipeptides，most of dipeptides showed ACE inhibitory activities.Among them，Cys-Ala（CA）and Cys-His（CH）were dipeptides with the highest ACE inhibitory activities，of which the ACE inhibition rates were 84.38%and 70.79% respectively.The dose response data showed the IC50values of CA and CH were 23.22 μmol/L and 61.17 μmol/L respectively.The antihypertensive effects of CA in spontaneously hypertensive rats（SHR）were further studied.The data showed obvious antihypertensive effect of CA in SHR.The results also revealed that the antihypertensive effects after 2 h of administration was positively correlated with doses of oral administration（R2＞0.8），and the overall antihypertensive effects after 4 h of administration were higher than that after 2 h of administration.Conclusion：Based on the results of determination on in vitro ACE inhibitory activities and in vivo experiments，CA was the dipeptide with high ACE inhibition rate and strong antihypertensive effect，which suggested CA could be used as functional food ingredients with potential therapeutic benefit in the prevention and treatment of hypertension.

angiotensin I-converting enzyme（ACE）；dipeptide；hypertension

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0160-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.023

2015－07－02

王建國（1992-），男，博士研究生，研究方向：生物信息學，E-mail：wangjg22@mail2.sysu.edu.cn。

邢珂（1977-），男，博士，研究員，研究方向：生物信息學和進化生物學，E-mail：xingk@mail.sysu.edu.cn。

廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項科技攻關(guān)與研發(fā)項目（A201301C09）；廣東省科技計劃項目（2012A080202006）。