曾　浩，薛亞平，鄭裕國(guó)

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，浙江 杭州 310014)

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氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋的研究進(jìn)展

曾浩，薛亞平，鄭裕國(guó)

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，浙江 杭州 310014)

手性化合物是醫(yī)藥、農(nóng)藥和精細(xì)化學(xué)品的重要中間體，去消旋外消旋化合物是生產(chǎn)光學(xué)純手性化合物的一個(gè)重要策略。氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋是目前制備手性化合物的重要方法，不僅簡(jiǎn)化了催化系統(tǒng)、提高了原子利用率和催化效率，而且經(jīng)濟(jì)環(huán)保。綜述了氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋2-羥酸、氨基酸和醇的研究進(jìn)展。

去消旋；氧化-還原生物催化偶聯(lián)；2-羥酸；氨基酸；醇

手性化合物被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥和精細(xì)化學(xué)品等領(lǐng)域，用高效經(jīng)濟(jì)的方法合成光學(xué)純的手性化合物是化學(xué)、醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的重要目標(biāo)[1-2]。多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)是在催化反應(yīng)過程中將多個(gè)酶組合在一起完成多步連續(xù)的催化反應(yīng)，主要有4種形式：線性級(jí)聯(lián)、正交級(jí)聯(lián)、平行級(jí)聯(lián)和循環(huán)級(jí)聯(lián)[3]，如圖1所示。

圖1　4種多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)示意圖

多酶級(jí)聯(lián)中的氧化-還原生物催化偶聯(lián)被廣泛應(yīng)用于去消旋反應(yīng)。氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋法首先通過具有選擇性的氧化酶氧化外消旋化合物中的一種構(gòu)型，得到潛手性的酮或者亞胺，然后利用具有立體選擇性的還原酶，將相應(yīng)潛手性的酮或者亞胺還原為另一種構(gòu)型，如圖2所示。

圖2氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋外消旋化合物

Fig.2Deracemization of racemic compounds by biocatalytic redox cascade

與化學(xué)拆分、酶法拆分以及不對(duì)稱合成相比，氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋提高了原子利用率及催化效率，簡(jiǎn)化了催化系統(tǒng)，是目前制備手性化合物的重要方法[4-8]。作者在此對(duì)氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋2-羥酸、氨基酸和醇的研究情況進(jìn)行總結(jié)歸納，擬為其深入研究提供幫助。

1　氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋2-羥酸

2-羥酸類化合物的羧基側(cè)C-1位同時(shí)具有羥基和羧基2個(gè)官能團(tuán)，因此性質(zhì)十分活潑[9]。光學(xué)純的2-羥酸是制藥和精細(xì)化工的重要中間體[10]，如，(R)-扁桃酸是頭孢菌素及青霉素的合成砌塊[11]、(R)-鄰氯扁桃酸是合成氯吡格雷的重要中間體[12]、(R)-3-苯基乳酸被廣泛用于合成恩格列酮[13]。研究表明，單一構(gòu)型2-羥酸合成的藥物與外消旋2-羥酸合成的藥物相比，藥效提高，藥物的副作用降低，因此，很多藥物的合成都采用單一構(gòu)型的2-羥酸。2-羥酸對(duì)映體是重要的手性拆分劑和手性催化劑，可用于多種不對(duì)稱合成反應(yīng)中[14]。因此，具有光學(xué)活性的2-羥酸具有廣闊的市場(chǎng)前景，已成為研究熱點(diǎn)。

氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋2-羥酸是通過具有選擇性的2-羥酸脫氫酶氧化外消旋2-羥酸中的一種構(gòu)型，得到潛手性的酮酸，再利用具有立體選擇性的羰基還原酶，把相應(yīng)潛手性的酮酸還原為另一種構(gòu)型。該方法的理論原子利用率為100%，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多具有立體選擇性的2-羥酸脫氫酶和羰基還原酶，應(yīng)用價(jià)值高。表1列舉了氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋2-羥酸的研究情況。

表1氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋2-羥酸

Tab.1　Deracemization of 2-hydroxy acids by biocatalytic redox cascade

氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋2-羥酸的關(guān)鍵是篩選到具有立體選擇性的2-羥酸脫氫酶和羰基還原酶。1992年，日本學(xué)者Tsuchiya等[15]首先篩選到具有(S)-扁桃酸脫氫酶的產(chǎn)堿桿菌(A.bronchisepticusKU1201)和具有立體選擇性羰基還原酶的糞鏈球菌(S.faecalisIFO12964)，并使用這2個(gè)菌建立氧化還原體系實(shí)現(xiàn)了外消旋扁桃酸轉(zhuǎn)化為(R)-扁桃酸。(S)-扁桃酸被醇脫氫酶氧化為苯乙酮酸后，不分離反應(yīng)體系，直接加入糞鏈球菌的靜息細(xì)胞提取物及NADH不對(duì)稱還原苯乙酮酸，(R)-扁桃酸的收率可達(dá)到80%，ee值大于99%。但是，該反應(yīng)需要直接加入輔酶，成本較高。隨后，Takahashi等[16]篩選到綠膿假單胞菌(P.polycolorIFO 3918)和微球菌(M.freudenreichiiFERM-P 13221)，建立了氧化還原體系，采用一鍋法去消旋外消旋扁桃酸，在反應(yīng)體系中添加輔助底物葡萄糖解決了輔酶再生，反應(yīng)24 h后，45 g·L-1底物中(S)-扁桃酸被完全氧化，收率超過70%，ee值大于99%，反應(yīng)成本大幅降低。

基因工程菌相比野生菌，具有培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)快、培養(yǎng)周期短、抗污染能力強(qiáng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，構(gòu)建2-羥酸脫氫酶和羰基還原酶的工程菌去消旋2-羥酸具有很大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。王海勇等[17]構(gòu)建了三酶表達(dá)系統(tǒng)去消旋鄰氯扁桃酸，從熒光假單胞菌獲取(S)-扁桃酸脫氫酶(SMDH)基因，構(gòu)建含SMDH的工程菌Ⅰ；從枯草芽孢桿菌獲取葡萄糖脫氫酶(GDH)基因，從釀酒酵母獲取羰基還原酶(CR)基因，構(gòu)建表達(dá)GDH和CR的工程菌Ⅱ；將工程菌Ⅰ、Ⅱ混合培養(yǎng)，去消旋鄰氯扁桃酸獲得(R)-鄰氯扁桃酸，反應(yīng)6～10 h的收率達(dá)85%，ee值為95%。該體系通過構(gòu)建GDH解決了輔酶循環(huán)，且不需額外添加輔酶。

研究發(fā)現(xiàn)，利用醇脫氫酶和羰基還原酶也可以實(shí)現(xiàn)氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋2-羥酸，底物的最高收率達(dá)到100%，ee值最高達(dá)到94%[18]。氧化反應(yīng)中采用立體選擇性的乙醇酸氧化酶(GOX)作為氧化酶，將(S)-2-羥酸氧化成2-酮酸；還原反應(yīng)中采用D-乳酸脫氫酶(LDH)作為還原酶，將2-酮酸不對(duì)稱還原為光學(xué)純的(R)-2-羥酸。另外，研究者還發(fā)現(xiàn)不同立體選擇性、輔酶依賴性的2-羥基異己酸脫氫酶也能夠去消旋2-羥酸，可以通過控制氧氣含量及NAD(P)+/NAD(P)H比值來調(diào)節(jié)催化反應(yīng)的進(jìn)行，避免2-酮酸積累，獲取手性2-羥酸[19]。

有些2-羥酸脫氫酶和羰基還原酶構(gòu)成的氧化-還原生物催化偶聯(lián)體系具有較廣的底物譜。Xue等[20]篩選到含F(xiàn)MN依耐型的對(duì)映體選擇性2-羥酸脫氫酶的銅綠假單胞菌(P.aeruginosaCCTCC M 2011394)和含羰基還原酶的釀酒酵母(S.cerevisiaeZJB-5074)，使用這2個(gè)菌建立氧化還原體系去消旋19種2-羥酸，反應(yīng)過程中不需添加輔酶，反應(yīng)21～33 h的ee值均大于99.9%，(R)-2-羥酸的收率為55.91%～98.67%，大多數(shù)達(dá)到90%以上。

2　氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋氨基酸

氨基酸不僅在生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，而且還是許多藥物及食品添加劑的重要中間體。氨基酸大多有L和D兩種構(gòu)型，不同構(gòu)型的氨基酸的化學(xué)性質(zhì)有一定差異。如，有些L-氨基酸能夠被人體吸收利用，但是攝入過量的D-氨基酸則有可能中毒[21]。天然氨基酸是L構(gòu)型的，是人體吸收利用的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；某些D-氨基酸在藥物合成中起著重要作用[22]。光學(xué)純的氨基酸在制藥和食品行業(yè)的作用越來越重要。

利用氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋氨基酸能夠經(jīng)濟(jì)高效地制備手性氨基酸，主要有2種方法：一種是先采用氧化酶將外消旋氨基酸中的一種構(gòu)型氧化為酮，再通過具有立體選擇性的氨基轉(zhuǎn)移酶得到光學(xué)純的氨基酸；另一種是先通過具有對(duì)映體選擇性的氧化酶氧化外消旋氨基酸中的一種對(duì)映體，得到相應(yīng)潛手性的亞胺，再用還原酶將相應(yīng)潛手性的亞胺還原成另一種構(gòu)型得到光學(xué)純的手性氨基酸[23]。表2列舉了氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋氨基酸的研究情況。

表2氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋氨基酸

Tab.2　Deracemization of amino acids by biocatalytic redox cascade

某些微生物能夠利用自身的代謝系統(tǒng)將D-氨基酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-氨基酸。熒光假單胞菌(P.fluorescens)和假單胞菌(P.miyamizu)最先被篩選到，它們都能將外消旋的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-苯丙氨酸，反應(yīng)是分兩步進(jìn)行的，首先D-苯丙氨酸被D-氨基酸氧化酶氧化為潛手性的酮，然后潛手性的酮通過轉(zhuǎn)氨作用或者還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-苯丙氨酸[24]。隨后又發(fā)現(xiàn)，根瘤菌(SinorhizobiummelilotiATCC 51124)能夠去消旋苯甘氨酸、4-氯苯丙氨酸和苯丙氨酸。反應(yīng)機(jī)制研究表明，去消旋是先通過兩步酶促反應(yīng)(D-立體選擇性的氧化脫氨基反應(yīng)和L-立體選擇性的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng))，再使用細(xì)胞提取物建立反應(yīng)體系去消旋外消旋氨基酸[25]。另外，通過克隆根瘤菌中的L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶，與大腸桿菌自身的D-氨基酸脫氫酶偶聯(lián)建立氧化還原去消旋氨基酸系統(tǒng)，可去消旋4-氯苯丙氨酸獲得L-4-氯苯丙氨酸[31]。Caligiuri等[26]采用類似方法，通過來自紅酵母(Rhodotorulagracilis)中的D-氨基酸氧化酶和大腸桿菌中的L-天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶去消旋2-萘基-丙氨酸。

研究發(fā)現(xiàn)，珊瑚色諾卡氏菌(N.corallineCCMCC 4.1037)全細(xì)胞能夠催化外消旋的4-氟苯甘氨酸去消旋制備(S)-4-氟苯甘氨酸。代謝途徑研究表明，去消旋作用是通過(R)-4-氟苯甘氨酸被(R)-立體選擇性的氧化脫氨基反應(yīng)和對(duì)應(yīng)的羰基被(S)-立體選擇性還原的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的[27]。錢紹松等[28]報(bào)道了去消旋茶氨酸的方法，首先，外消旋的茶氨酸經(jīng)乙?；玫絅-乙酰-(D,L)-茶氨酸，再通過米曲霉氨基?；覆鸱諲-乙酰-(D,L)-茶氨酸制備L-茶氨酸，收率達(dá)到85%。

通過引入輔酶，可以解決氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋氨基酸中的輔酶再生問題。Nakajima等[29]構(gòu)建了四酶(D-氨基酸氧化酶、過氧化氫酶、L-亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶)氧化還原體系，去消旋蛋氨酸制備L-蛋氨酸，L-蛋氨酸收率大于95%，ee值大于99%。反應(yīng)分兩步完成：第一步，外消旋蛋氨酸中的D-蛋氨酸在氧氣參與下被D-氨基酸氧化酶氧化為酮酸，副產(chǎn)物雙氧水被過氧化氫酶轉(zhuǎn)化為水和氧氣；第二步，酮酸被L-亮氨酸脫氫酶不對(duì)稱還原為L(zhǎng)-蛋氨酸，反應(yīng)需要輔因子NADH，通過甲酸脫氫酶把甲酸氧化為二氧化碳實(shí)現(xiàn)輔因子NADH的再生。使用該體系去消旋丙氨酸和亮氨酸可達(dá)到同樣的效果。

另外，從外消旋的扁桃酸出發(fā)也可以制備L-苯甘氨酸。通過建立一個(gè)包含扁桃酸消旋酶、D-扁桃酸脫氫酶(D-MDH)和L-氨基酸脫氫酶(L-AADH)的三酶氧化還原體系去消旋外消旋扁桃酸制備L-苯甘氨酸，收率大于94%，ee值大于97%[30]。扁桃酸消旋酶、D-扁桃酸脫氫酶負(fù)責(zé)把外消旋扁桃酸轉(zhuǎn)化為酮酸，酮酸再被L-氨基酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-苯甘氨酸。

3　氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋醇

具有光學(xué)活性的醇是一類重要的手性化合物，是許多藥物和精細(xì)化學(xué)品的重要手性合成砌塊。生物法獲取手性醇，主要通過前體酮的不對(duì)稱還原和去消旋外消旋醇實(shí)現(xiàn)。前體酮的不對(duì)稱還原是在輔因子NADH或者NADPH的參與下，利用具有立體選擇性的醇脫氫酶將潛手性的前體酮還原成光學(xué)純的醇，理論轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，但前體酮不易獲取且價(jià)格昂貴[32]。因此，通過氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋外消旋醇更經(jīng)濟(jì)高效。

催化外消旋醇轉(zhuǎn)化為單一構(gòu)型的手性醇，可以通過級(jí)聯(lián)2個(gè)具有立體選擇性的氧化還原酶實(shí)現(xiàn)。首先外消旋醇中的一種構(gòu)型被具有選擇性的氧化酶氧化為潛手性的酮，然后潛手性酮被立體選擇性的還原酶還原為另一種構(gòu)型，理論轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%。

研究發(fā)現(xiàn)，有些醇脫氫酶的催化反應(yīng)是可逆反應(yīng)，可以使用2種對(duì)映體選擇性不同的醇脫氫酶去消旋醇以制備光學(xué)純的醇。Voss等[33]發(fā)現(xiàn)，可以用糞產(chǎn)堿桿菌(A.faecalisDSM 13975)選擇性氧化外消旋醇中的R構(gòu)型得到潛手性的酮，再通過赤紅球菌(R.ruberDSM 44541)中的醇脫氫酶以及葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)去消旋外消旋的醇，制備光學(xué)純的S構(gòu)型的醇。對(duì)于1a～1j 10種底物，收率均大于99%，ee值為10%～99%。反應(yīng)如圖3所示。

Voss等還利用相似的反應(yīng)體系，通過篩選到的R.erythropolisDSM 43066對(duì)映體選擇性氧化外消旋醇中的S構(gòu)型，再用Lactobacilluskefir中的醇脫氫酶不對(duì)稱還原潛手性的酮，制備R構(gòu)型的醇。去消旋1a～1i 9種底物，收率最高為99%，ee值最高為80%，催化效率較低。

Voss等[34]又用乙醇脫氫酶(ADH)實(shí)現(xiàn)仲醇的去消旋，提高了ee值。ADH具有2種立體選擇性，并且具有不同的底物特異性。在氧化反應(yīng)中，利用(S)-ADH選擇性地將(S)-醇氧化為酮，通過加入輔因子NADPH，將氧氣還原為雙氧水，實(shí)現(xiàn)輔酶氧化型輔因子NADP+的循環(huán)再生；在還原反應(yīng)中，利用(R)-ADH將相應(yīng)的酮不對(duì)稱還原成(R)-醇，通過加入甲酸氧化酶，將甲酸氧化為二氧化碳，實(shí)現(xiàn)輔因子NADH的循環(huán)。整個(gè)反應(yīng)體系同步進(jìn)行，4個(gè)酶在一鍋法中共同作用，實(shí)現(xiàn)外消旋的醇去消旋轉(zhuǎn)化為光學(xué)純的(R)-醇，10種底物反應(yīng)6～24 h后的轉(zhuǎn)化率和ee值都大于99%。改變反應(yīng)順序也能夠得到(S)-醇，轉(zhuǎn)化率和ee值也大于99%。

圖3氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋醇

Fig.3Deracemization of alcohols by biocatalytic redox cascade

隨后，Li等[35]發(fā)現(xiàn)使用氧化微桿菌(M.oxydansECU2010)和紅酵母(Rhodotorulasp. AS2.2241)建立氧化還原體系，在不添加輔因子的情況下能夠去消旋苯乙醇制備(S)-苯乙醇，在此過程中，氧化微桿菌能夠選擇性氧化(R)-苯乙醇生成苯乙酮，紅酵母能夠立體選擇性還原苯乙酮生成(S)-苯乙醇。另外，利用該體系去消旋一系列芳基仲醇，收率在86.5%～99.0%之間，ee值大于99%。

使用L.kefirNRRL B-1839和R.glutunisDSM 70398建立氧化還原體系可去消旋苯乙醇制備(R)-苯乙醇。在最佳反應(yīng)條件下，L.kefir氧化(S)-1-苯乙醇為相應(yīng)的酮，ee值和轉(zhuǎn)化率分別為90%和45%；然后，酮被R.glutunis還原為(R)-1-苯乙醇，ee值和轉(zhuǎn)化率分別為85%和98%；兩菌同時(shí)反應(yīng)，(R)-1-苯乙醇的ee值和轉(zhuǎn)化率分別為86%和75%[36]。

研究發(fā)現(xiàn)，與單一菌株去消旋氨基酸類似，某些微生物的代謝系統(tǒng)也可以去消旋醇。Meena等[37]發(fā)現(xiàn)單一菌株M.koreensis可以去消旋仲醇制備R構(gòu)型仲醇，4種底物的收率在88%～96%之間，ee值大于98%。但催化機(jī)制目前還不清楚。

4　結(jié)語

目前，制備手性化合物的方法主要有化學(xué)拆分、酶法拆分、不對(duì)稱合成以及外消旋化合物的去消旋。拆分法理論收率只能達(dá)到50%，外消旋中的一種構(gòu)型得不到利用；不對(duì)稱合成理論收率雖然可以達(dá)到100%，但相比外消旋的化合物，潛手性的前體物質(zhì)不易獲得且價(jià)格昂貴。因此，從外消旋的化合物出發(fā)，通過去消旋外消旋化合物，理論收率可以達(dá)到100%，且原子利用率高，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，具有廣闊的應(yīng)用前景。其中利用氧化-還原生物催化偶聯(lián)一鍋法去消旋外消旋化合物，簡(jiǎn)化了去消旋反應(yīng)的催化系統(tǒng)，提高了催化效率，工業(yè)化應(yīng)用越來越廣泛，是目前制備手性化合物的重要方法。

氧化-還原生物催化偶聯(lián)法去消旋通過具有選擇性的氧化酶氧化外消旋化合物中的一種構(gòu)型，得到潛手性的中間體，然后利用具有立體選擇性的還原酶將相應(yīng)潛手性的中間體還原為另一種構(gòu)型。該方法理論原子利用率為100%，且已發(fā)現(xiàn)了很多具有立體選擇性的氧化還原酶，應(yīng)用價(jià)值高。由于該法多數(shù)反應(yīng)需要輔酶參與，而輔酶價(jià)格昂貴，直接加入輔酶不經(jīng)濟(jì)，因此，通常引入其它常用酶(如葡萄糖脫氫酶、甲酸脫氫酶等)實(shí)現(xiàn)輔酶的循環(huán)。另外，該法的反應(yīng)機(jī)制還不清楚、酶的催化效率還不高，需要進(jìn)一步探索研究。

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Research Progress on Deracemization by Biocatalytic Redox Cascade

ZENG Hao,XUE Ya-ping,ZHENG Yu-guo

(InstituteofBioengineering,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310014,China)

Chiralcompoundsarekeyintermediatesforthesynthesisofmedicines,pesticidesandfinechemicals.Deracemizationofracemiccompoundsisanimportantwaytoobtainenantiopurechiralcompounds.Deracemizationbybiocatalyticredoxcascadeisanimportantmethodforpreparationofchiralcompoundsduetoitsadvantagessuchassimplecatalyticsystem,highatomutilizationrate,highcatalyticefficiency,economyandenvironmentalprotection.Theresearchprogressonderacemizationof2-hydroxyacids,aminoacidandalcoholbybiocatalyticredoxcascadeissummarizedinthispaper.

deracemization;biocatalyticredoxcascade;2-hydroxyacid;aminoacid;alcohol

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.08.002

2016-04-06

曾浩(1990-)，男，河南信陽人，碩士研究生，研究方向：生物催化，E-mail:wexs@163.com；通訊作者：鄭裕國(guó)，教授，E-mail:zhengyg@zjut.edu.cn。

TQ 460O 643.3

A

1672-5425(2016)08-0004-06

曾浩，薛亞平，鄭裕國(guó).氧化-還原生物催化偶聯(lián)去消旋的研究進(jìn)展[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(8)：4-9.