閆來(lái)洪，張振沖，郗麗君，梁文龍

(中國(guó)石油大學(xué)(華東)化學(xué)工程學(xué)院，山東 青島 266580)

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不同活性污泥中菌群多樣性及差異分析

閆來(lái)洪，張振沖，郗麗君，梁文龍

(中國(guó)石油大學(xué)(華東)化學(xué)工程學(xué)院，山東 青島 266580)

采用Illumina MiSeq第二代深度高通量測(cè)序方法測(cè)定了5種不同活性污泥中的菌群多樣性，通過(guò)稀釋度曲線、豐度分布曲線、活性污泥中菌群組成分析、微生物群落的聚類樹(shù)與條形圖組合分析、主坐標(biāo)分析(PCoA)等對(duì)5種不同活性污泥中的菌群差異進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，不同活性污泥中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相似，但某些細(xì)菌的含量存在較大差異，如:正常污泥中浮霉?fàn)罹繋缀跏桥菽械?倍，而正常污泥中放線菌含量不足泡沫中的一半；泡沫中WCHB1-60和Candidate division TM7的含量分別比正常污泥多1.3倍和3.2倍，而泡沫中硝化螺旋菌的含量?jī)H僅是正常污泥中的1/5。表明，活性污泥中的菌群組成與環(huán)境相似度呈正相關(guān)，且細(xì)菌含量與活性污泥的狀態(tài)密切相關(guān)。

活性污泥；高通量測(cè)序；菌群多樣性；差異

活性污泥是一個(gè)獨(dú)特的人工微生物生態(tài)系統(tǒng)，具有高的生物多樣性(超過(guò)700屬)及生物量濃度(2～10g·L-1)[1-2]。高度多樣化的細(xì)菌群落形成以菌膠團(tuán)為骨架的活性污泥絮體，有效保證了穩(wěn)定、良好的廢水生物處理性能[3-5]。

由于技術(shù)方法的限制，目前多數(shù)研究報(bào)道未能全面比較分析不同狀態(tài)活性污泥中的細(xì)菌群落變化及其是否存在區(qū)域差異[6-7]。而利用高通量測(cè)序技術(shù)及先進(jìn)的數(shù)據(jù)分析方法可以較全面地分析活性污泥及泡沫中微生物[8-9]。作者采用IlluminaMiSeq第二代深度高通量測(cè)序方法對(duì)來(lái)自污水處理廠和實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置中不同狀態(tài)的活性污泥的微生物組成進(jìn)行詳細(xì)的測(cè)定解析，同時(shí)分析了不同活性污泥的物種差異及其與區(qū)域特異性間的聯(lián)系，擬為維持實(shí)際生產(chǎn)中活性污泥的良好狀態(tài)提供理論指導(dǎo)。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1材料

1#、2#、4#、5#活性污泥樣品分別來(lái)自青島泥布灣污水處理廠(1#、2#、4#樣品)和鐮灣河水質(zhì)凈化廠(5#樣品)，3#活性污泥樣品來(lái)自實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置。樣品經(jīng)處理后移至-70 ℃低溫冰箱中長(zhǎng)期保存。

泥布灣污水處理廠采用倒置A2/O工藝，主要處理生活污水；鐮灣河水質(zhì)凈化廠采用百樂(lè)克工藝，主要處理生活用水。兩污水處理廠污水經(jīng)處理后均可達(dá)到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的一級(jí)B類排放標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置采用最基本的活性污泥法，由均質(zhì)池、曝氣池、二沉池及回流裝置組成。曝氣池與二沉池采用相同的圓柱形有機(jī)玻璃管(直徑10cm、高40cm、容積3.14L)。實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置進(jìn)水為人工配水，其配方為：葡萄糖220mg·L-1、蛋白胨200mg·L-1、氯化銨58mg·L-1、磷酸氫二鉀19mg·L-1、氯化鈣4mg·L-1、硫酸鎂2mg·L-1。

1.2儀器

超凈工作臺(tái)，全自動(dòng)滅菌鍋，超純水儀，哈希水質(zhì)檢測(cè)儀，蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)器，高速離心機(jī)，擴(kuò)增儀，水平電泳槽，凝膠成像系統(tǒng)，低溫冰箱，漩渦混合器，島津紫外分光光度計(jì)，ABIGeneAmp?9700型PCR儀。

1.3方法

1.3.1樣品采集

從泥布灣污水處理廠采集曝氣池中的正常活性污泥(1#)、上浮的污泥泡沫(2#)及二沉池中的回流上浮污泥(4#)；從實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置中采集好氧池中的正?；钚晕勰?3#)；從鐮灣河水質(zhì)凈化廠采集正常的活性污泥(5#)。每種類型的污泥樣品分別在3個(gè)不同的采樣點(diǎn)同時(shí)采集，混合后進(jìn)行總DNA的提取。

1.3.2總DNA的提取

將混合污泥樣品放入50 mL離心管中于6 000 r·min-1高速離心10 min，去上層清液，用基因組提取試劑盒(E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit，Omega公司)提取總DNA后取5 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。剩余污泥于-70 ℃冷凍備用。每種樣品做3個(gè)平行，電泳檢測(cè)后混合。

1.3.3PCR擴(kuò)增

按指定測(cè)序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物。5種污泥樣品均在正式實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行，每種樣品做3個(gè)重復(fù)，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.4熒光定量

根據(jù)電泳初步定量結(jié)果，用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，再按照每種樣品的測(cè)序量要求進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

1.3.5MiSeq測(cè)序

MiSeq文庫(kù)構(gòu)建：(1)連接“Y”字形接頭；(2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段；(3)利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；(4)氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。

MiSeq測(cè)序：(1)DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上；另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定住，形成“橋”；(2)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA簇；(3)DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈；(4)加入改造過(guò)的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個(gè)堿基；(5)用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)聚合上的核苷酸種類；(6)將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3′端粘性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸；(7)統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲得模板DNA片段的序列。

1.3.6生物信息分析

MiSeq測(cè)序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析。基于OTU聚類分析結(jié)果，對(duì)OTU進(jìn)行多樣性指數(shù)分析及測(cè)序深度的檢測(cè)；基于分類學(xué)分析結(jié)果，在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與討論

2.1MiSeq測(cè)序結(jié)果

5種樣品的高通量測(cè)序結(jié)果如表1所示，5種樣品所含操作分類單元及所含序列數(shù)目見(jiàn)圖1。

由圖1可知，1#樣品中含細(xì)菌種類969個(gè)，2#樣品中含1 027個(gè)，3#樣品中含435個(gè)，4#樣品中含1 066個(gè)，5#樣品中含829個(gè)；1#、2#、4#樣品來(lái)自同一污水處理廠，有相同種類833個(gè)；1#、5#樣品是同一性質(zhì)的污泥，有相同種類635個(gè)；1#、2#、4#、5#樣品全部來(lái)自實(shí)際運(yùn)行工藝中，共有相同種類566個(gè)；1#、2#、3#、4#、5#樣品共有相同種類248個(gè)。1#～5#樣品特有的微生物種類分別是5個(gè)、1個(gè)、46個(gè)、20個(gè)、85個(gè)。

表15種樣品的高通量測(cè)序結(jié)果

Tab.1High throughput sequencing results of five samples

樣品序列數(shù)堿基數(shù)/bp平均長(zhǎng)度/bp1#4737018741233395.642#4733918733986395.743#4114216260732395.234#4892119349945395.535#4294416987670395.58

圖1　操作分類單元維恩圖[10]

2.2物種豐度及群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1稀釋度曲線(圖2)

圖2　5種樣品的稀釋度曲線

稀釋度曲線[11]是從樣品中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個(gè)體，用來(lái)說(shuō)明測(cè)序數(shù)量是否合理，也可比較測(cè)序數(shù)量不同的樣品的物種豐度，反映每種樣品物種豐度與取樣深度的關(guān)系。

從圖2可以看出，1#、2#、4#樣品具有非常相似的變化趨勢(shì)與幅度，5#樣品與1#、2#、4#樣品差異較大，但相比2#、4#樣品，5#樣品與1#樣品更接近，3#樣品與其它樣品差異最大。說(shuō)明同一污水處理廠不同樣品(1#、2#、4#)的物種豐度最接近，不同污水處理廠相同狀態(tài)(1#、5#樣品皆為正常污泥)樣品次之，實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置中樣品(3#)的物種豐度與實(shí)際污水處理廠中樣品的物種豐度差異最大。

2.2.2豐度分布曲線

豐度分布曲線[12]是分析菌群多樣性的一種方法，既可用來(lái)解釋物種豐度也可解釋物種均勻度。5種樣品的OTU等級(jí)豐度分布曲線如圖3所示。

圖3　5種樣品的OTU等級(jí)豐度分布曲線

從圖3可以看出，1#、2#、4#、5#樣品的斜率較小且非常接近，又以1#、2#樣品斜率最接近，3#樣品斜率最大。說(shuō)明1#、2#樣品因取自同一位置所以均勻度最相似且最好，1#、2#、4#、5#樣品因取自實(shí)際污水處理廠不同位置所以均勻度較相似，3#樣品因取自實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置所以均勻度最差。此外，豐度分布曲線在橫軸上的寬度再次印證了5種樣品的相對(duì)豐度及其相互關(guān)系。

2.2.3活性污泥中菌群組成分析

圖4反映了5種活性污泥樣品在屬的層次上包含的微生物種類及各物種的相對(duì)含量。

從圖4可知，5種活性污泥樣品所含微生物屬的種類基本一致，但其相對(duì)含量差異較大。對(duì)所含主要微生物屬進(jìn)行分析和歸類發(fā)現(xiàn)，1#、2#、4#、5#樣品主要物種為叢毛單胞菌、腐敗螺旋菌和光合細(xì)菌；3#樣品與其它樣品明顯不同，含有大量的叢毛單胞菌和嗜酸菌，而光合細(xì)菌的含量卻非常少；相比于其它樣品，2#樣品中存在大量的未培養(yǎng)的Candidate division TM7、下水道桿菌、水單胞菌、鹽單胞菌、分枝桿菌、斯科曼氏菌。

表2是正常污泥與泡沫中微生物主要組成。

從表2可知，2種樣品中的微生物組成差異主要表現(xiàn)在：對(duì)于高豐度微生物而言，正常污泥中浮霉?fàn)罹?Planctomycetes)的含量幾乎是泡沫中的2倍，而正常污泥中放線菌(Actinobacteria)的含量不足泡沫中的一半；對(duì)于低豐度微生物而言，泡沫中WCHB1-60、Candidate division TM7的含量高達(dá)3.72%、2.31%，分別比正常污泥多1.3倍、3.2倍，而泡沫中硝化螺旋菌(Nitrospirae)的含量只有0.26%，僅為正常污泥樣品中的1/5，該菌是亞硝酸鹽氧化菌中的一個(gè)主要譜系，在廢水生物處理中具有重要作用。

圖45種樣品的微生物菌群分布圖

Fig.4Microbial community distribution barplot of five samples

表2正常污泥與泡沫中微生物主要組成

Tab.2　Main components of microbacteria in normal sludge and foaming sludge

據(jù)報(bào)道，放線菌中的某些種屬與泡沫的形成密切相關(guān)，如本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：(1)分枝桿菌，能在體內(nèi)合成大量的分枝菌酸，因而細(xì)胞壁中含有大量的分枝菌酸，細(xì)胞壁中所含的長(zhǎng)鏈枝狀的分枝菌酸導(dǎo)致細(xì)胞表面的疏水性(CSH)，而CSH 正是泡沫形成的選擇性浮選的必要條件[13]，因而分枝桿菌是泡沫形成的重要原因之一。(2)斯科曼氏菌，原屬于諾卡氏菌，可產(chǎn)生與分枝桿菌不同的分枝菌酸，是造成泡沫的另一主要微生物[14]。(3)戈登氏菌，在泡沫中含量為0.24%，1#樣品中含量為0.021%，5#樣品中含量為0.024%，可以推斷戈登氏菌在泡沫中大量增殖，表明戈登氏菌是重要的發(fā)泡微生物，與泡沫的形成有重要關(guān)系[15]。

2.2.4微生物群落聚類樹(shù)與條形圖組合分析

5種樣品的微生物群落聚類樹(shù)與條形圖如圖5所示。

圖5中左邊是5種樣品基于群落組成的層次聚類分析[16](bray-curtis算法)，右邊是5種樣品的微生物群落條形圖[17]。通過(guò)聚類樹(shù)可以看出，不同地區(qū)不同工藝的樣品微生物差異最大，同一地區(qū)不同狀態(tài)的樣品微生物差異次之，同一狀態(tài)不同類型的樣品微生物差異最小。通過(guò)5種樣品的條形圖可以看出每種菌屬的相對(duì)含量。聚類樹(shù)與條形圖組合分析定量而直觀地反映了5種樣品的相似性及菌屬含量差異性。

圖5　5種樣品的微生物群落的聚類樹(shù)與條形圖

2.2.5主坐標(biāo)分析

主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis，PCoA)，可用來(lái)研究群落組成的相似性或差異性，與PCA[18]類似。通過(guò)降維找出影響5種樣品群落組成差異的潛在主成分，樣品間距離通過(guò)各樣品序列間的進(jìn)化信息計(jì)算得出，從而可以確定5種不同活性污泥樣品間的多樣性差異，如圖6所示。

圖6　5種樣品的主坐標(biāo)分析

從圖6可知，1#、2#、4#樣品聚在了一起，而3#、5#樣品與它們相距較遠(yuǎn)。表明5種活性污泥樣品群落處于同一地點(diǎn)相同處理工藝中的差異很小，處于不同地點(diǎn)不同處理工藝中的差異很大，因此區(qū)域特征及處理工藝對(duì)活性污泥中微生物群落有著重要影響。

2.3討論

據(jù)報(bào)道，環(huán)境條件(主要是污泥停留時(shí)間和無(wú)機(jī)氮等)對(duì)微生物的影響主要體現(xiàn)在相對(duì)含量上，而微生物間的相互作用則對(duì)微生物的群落組成與結(jié)構(gòu)起主導(dǎo)作用[19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在屬的水平上一些稀有微生物只存在于某一個(gè)水廠或?qū)嶒?yàn)室人工模擬裝置中，如泥布灣污水處理廠中特有微生物有(括號(hào)中為正常污泥中微生物含量)AKYG587(0.063%)、Actinobacteria unclassified(0.17%)、Armatimonadales unclassified(0.17%)、CL500-3(0.063%)等；鐮灣河水質(zhì)凈化廠中特有微生物有Alcaligenaceae uncultured(0.11%)、Burkholderiales unclassified(0.096%)、Byssovorax(0.016%)等；實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置中特有微生物有Achromobacter(0.093%)、Aquitalea(0.054%)等。說(shuō)明除環(huán)境條件影響微生物相對(duì)含量外，不同地方活性污泥中微生物組成并不相同，即不同狀態(tài)的活性污泥中微生物群落具有區(qū)域性分布特點(diǎn)。

3　結(jié)論

采用Illumina MiSeq測(cè)序方法，從5種活性污泥樣品中共分離了細(xì)菌門36個(gè)、綱78個(gè)、目140個(gè)、科248個(gè)。

泥布灣污水處理廠正?；钚晕勰鄻悠分兄饕?個(gè)類群(含量>5%)，其中變形菌門與擬桿菌門所占比例最大，分別為33.9%、16.01%；其次是綠菌、綠彎菌、浮霉?fàn)罹謩e為12.88%、8.97%和9.28%。好氧池上浮的污泥泡沫中主要包含6個(gè)類群(含量>5%)，其中變形菌門與擬桿菌門所占比例最大，分別為32.44%和20.64%；其次是放線菌、綠菌、綠彎菌、浮霉?fàn)罹謩e為10.44%、8.5%、6.19%、5.05%；其中放線菌中的分枝桿菌、斯科曼氏菌和戈登氏菌含量均高于正常污泥，它們?yōu)橹饕呐菽a(chǎn)生菌。二沉池中的回流上浮污泥中主要包含5個(gè)類群(含量>5%)，其中變形菌門與擬桿菌門所占比例最大，分別為38.13%、20.67%；其次是綠菌、綠彎菌、浮霉?fàn)罹謩e為10.6%、7.52%、6.15%。

實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置污泥樣品中主要包含2個(gè)類群(含量>5%)，其中變形菌門與擬桿菌門所占比例最大，分別為70.36%、17.15%。

鐮灣河水質(zhì)凈化廠正常污泥中主要包含5個(gè)類群(含量>5%)，其中變形菌門與擬桿菌門所占比例最大，分別為33.69%、18.54%；其次是綠菌、綠彎菌、酸桿菌，分別為12.66%、12.23%、5.54%。

稀釋度曲線、豐度分布曲線、活性污泥中菌群組成分析、微生物群落的聚類樹(shù)與條形圖組合分析、主坐標(biāo)分析結(jié)果表明，同一水廠同一位置不同狀態(tài)污泥樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)最相似，同一水廠不同位置次之，不同水廠樣品差異最大。因此，微生物群落組成與環(huán)境相似度呈正相關(guān)且微生物種群相對(duì)含量變化與活性污泥的狀態(tài)密切相關(guān)。人工模擬裝置樣品與其它樣品對(duì)比結(jié)果表明，小型模擬裝置難以模擬實(shí)際污水的處理過(guò)程。

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Bacteria Community Diversity and Differences in Different Types of Activated Sludge

YAN Lai-hong,ZHANG Zhen-chong,XI Li-jun,LIANG Wen-long

(CollegeofChemicalEngineering,ChinaUniversityofPetroleum,Qingdao266580,China)

Thebacteriacommunitydiversityoffivetypesofactivatedsludgewasdetectedbyusingasecondgenerationhighthroughputdeepsequencingtechnology(IlluminaMiSeq).Throughtherarefactioncurves,theabundancedistributioncurves,analysisofbacteriacommunitycomponents,clusteringtreecombinedbarplotanalysisofbacteriacommunityandprincipalcoordinateanalysis(PCoA),thedifferencesinfivetypesofactivatedsludgewereanalyzed.Resultsindicatedthat,dominantbacteriaindifferentactivatedsludgeweresimilartoeachother,butthecontentofsomebacteriahadsignificantdifference.Forexample,thecontentofPlanctomycetesinnormalsludgewasalmostdoubleofthatinfoam,whilethecontentofActinomycetesinnormalsludgewaslessthanhalfofthatinfoam;thecontentofWCHB1-60andCandidatedivisionTM7infoamwas1.3times,3.2timesmorethanthatinnormalsludge,respectively,whilethecontentofNitrospiraeinfoamwasone-fifthofthatinnormalsludge.Bacteriacommunitycompositionwaspositivelycorrelatedwithenvironmentalsimilarity,andthecontentsofbacteriawerecloselyrelatedtothestateoftheactivatedsludge.

activatedsludge;highthroughputsequencing;bacteriacommunitydiversity;difference

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.08.014

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31400005)，山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2013CL028)，中央高校專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(R1304006A)

2016-04-07

閆來(lái)洪(1952-)，男，山東東營(yíng)人，副教授，主要從事水污染治理及環(huán)境影響評(píng)價(jià)，E-mail：yanlh918@126.com。

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1672-5425(2016)08-0057-06

閆來(lái)洪，張振沖，郗麗君，等.不同活性污泥中菌群多樣性及差異分析[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(8)：57-62.