申敏娜，陳建華

(中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京 210009)

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曲酸發(fā)酵及生物合成途徑研究進展

申敏娜，陳建華

(中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京 210009)

簡要介紹了曲酸發(fā)酵現(xiàn)狀，綜述了曲酸生物合成途徑的研究手段和成果，包括常規(guī)手段同位素標記以及新興的基因組學研究，總結了可能的曲酸生物合成途徑以及相關合成與調節(jié)基因。

曲酸；發(fā)酵；生物合成；基因組學

曲酸(kojicacid)于1907年由齋藤首次分離得到；1913年，藪田將其命名為曲酸；1924年，首次確定曲酸的結構[1]。曲酸化學名為5-羥基-2-羥甲基-1，4-吡喃酮，主要來源于真菌發(fā)酵的次級代謝產(chǎn)物，純品為無色柱狀晶體，分子式C6H6O4，分子量142.1，熔點153～154 ℃，易溶于水、醇、丙酮，微溶于醚、乙酸乙酯、氯仿和吡啶，不溶于苯。曲酸具有微弱酸性，其分子上的每個位點都具有反應活性，5位上的側鏈相當于一個伯醇，核上臨近的氧原子能夠提高其反應活性；曲酸與三氯化鐵作用呈特殊的紅色，可還原斐林試劑和銀氨溶液[2]。

曲酸應用廣泛。基于其酪氨酸酶抑制劑活性，在化妝品中作為美白成分，進入皮膚細胞后能夠與細胞中的銅離子絡合，改變酪氨酸酶的立體結構，抑制酪氨酸酶的活化，阻止皮膚黑色素的形成[3]；基于其抗菌、抗氧化活性[4]，在食品運輸貯藏中作為防腐劑、護色劑，阻斷多酚氧化酶的需氧途徑。曲酸來源于微生物的次級代謝產(chǎn)物，無生理毒性，結構簡單，但由于其烯醇式結構存在一定的不穩(wěn)定性，常作為骨架進行修飾和衍生，如合成曲酸雙棕櫚酸酯、曲酸酯等[5-8]，這些衍生物不僅提高了曲酸在油性化妝品中的溶解度和穩(wěn)定性，而且生物活性也大幅提高。曲酸在不同領域中的應用如表1所示。

1　曲酸發(fā)酵研究現(xiàn)狀

曲酸主要來源于某些絲狀真菌或醋桿菌的次級代謝分泌，某些植物(如非洲吊燈樹)也能產(chǎn)曲酸。目前，產(chǎn)曲酸菌株主要集中于米曲霉和黃曲霉，其中，黃曲霉為條件性致病菌。Manabe等[9]對149株米曲霉和46株黃曲霉進行研究時發(fā)現(xiàn)，黃曲霉全部產(chǎn)曲酸且有34株同時產(chǎn)黃曲霉毒素；而米曲霉只有105株產(chǎn)曲酸且全部不產(chǎn)黃曲霉毒素。因此選用黃曲霉作為產(chǎn)曲酸菌株時，需格外注意安全問題。

表1曲酸在不同領域中的應用

Tab.1　Applications of kojic acid in different fields

1955年，輝瑞公司最先將曲酸生產(chǎn)工業(yè)化[10]。為了提高曲酸產(chǎn)量，國內(nèi)外學者進行了大量研究工作，主要包括菌株選育、發(fā)酵方法優(yōu)化兩方面。表2列出了近年來產(chǎn)曲酸菌株的選育研究成果。

從表2可知，曲霉屬菌株作為曲酸生產(chǎn)菌，通過不同的物理及化學方法誘變，曲酸產(chǎn)量均有不同幅度的提升。但對比2007年趙新河等[18]的統(tǒng)計結果不難發(fā)現(xiàn)，通過誘變提高產(chǎn)量的效果已明顯降低，這與理論推測一致。因為在菌株選育過程中，存在誘變方法隨機、方向不易掌握、理想個體篩選困難等局限性，另外，多輪篩選造成菌株敏感性降低、耐受性提高。因此，提高曲酸產(chǎn)量需另辟蹊徑。

2　曲酸生物合成途徑研究

為了進一步提高曲酸產(chǎn)量，研究人員開始從分子水平闡述曲酸生物合成原理，嘗試利用基因工程手段突破目前的瓶頸。

表2產(chǎn)曲酸菌株的選育研究成果

Tab.2　Research achievements of screening for kojic acid-producing strain

微生物次級代謝產(chǎn)物種類多(如抗生素、毒素、激素、色素等)且具有不同的生物活性。研究人員通過提高上調基因的表達或剔除負向調節(jié)基因來提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量，但需以生物合成途徑的闡明為前提。常用的生物合成途徑研究手段包括同位素示蹤標記底物、分離并鑒定中間產(chǎn)物等傳統(tǒng)方法。由于曲酸及轉化底物結構簡單，并且骨架相似，因此中間產(chǎn)物研究缺乏靶標性和唯一性。

近年來，基因組學和生物信息學的蓬勃發(fā)展為次級代謝產(chǎn)物的生物合成途徑研究提供了新思路。目前，曲霉屬已測序完畢，在NCBI數(shù)據(jù)庫可查詢的基因組序列包括黃曲霉NRRL3357、煙曲霉Af293、米曲霉RIB40等。次級代謝產(chǎn)物合成基因一般分為兩類：一類是結構基因(structural genes)，主要是一些催化次級代謝產(chǎn)物合成的酶類基因；另一類是調節(jié)基因(regulatory genes)，主要參與調控次級代謝產(chǎn)物合成相關基因的轉錄。絲狀真菌次級代謝產(chǎn)物結構基因通常成簇存在于染色體相鄰的位置，形成基因簇(gene clusters)[19]。在一個基因簇中，除了多個編碼酶的結構基因外，一般還包括編碼轉運蛋白的基因(負責將基因簇合成的次級代謝產(chǎn)物及時運出細胞)及編碼轉錄因子的簇內(nèi)調節(jié)基因(調節(jié)基因簇中其它基因的轉錄[20])。此外，甲基化酶、組蛋白去乙?；敢约靶盘栟D導蛋白等全局性調控因子(global regulators)也參與調節(jié)次級代謝產(chǎn)物的合成，屬于簇外調節(jié)基因。

曲酸生物合成途徑研究大致可分為底物同位素示蹤法研究和基因組學研究2個階段。

2.1底物同位素示蹤法研究

底物同位素示蹤法研究始于曲酸結構及生物合成途徑的推測。由于米曲霉在產(chǎn)生曲酸時，既可利用己糖，也可利用C原子數(shù)目低于6的甘油、乙醇、二羥基丙酮等，因此形成了分裂說和分割說兩派。20世紀50年代，Arnstein等[21-25]最早用底物同位素示蹤法研究曲酸的生物合成，發(fā)現(xiàn)由葡萄糖轉化為曲酸最多需要2～3種酶，而且不破壞吡喃糖環(huán)直接轉化成曲酸；當標記底物為[1-14C]-D-葡萄糖時，產(chǎn)物曲酸的76.3%的放射性來自于C-1；當以[6-14C]-D-葡萄糖為標記底物時，產(chǎn)物曲酸的90.7%的放射性來自于C-6[26]；當以[3-3H]-D-葡萄糖或[5-3H]-D-葡萄糖為標記底物時，產(chǎn)物曲酸只呈現(xiàn)微弱的3H放射性。

1981年，印度國家糖業(yè)研究所根據(jù)不同實驗條件下酶活性和曲酸濃度的關系，確定葡萄糖脫氫酶和葡萄糖酸脫氫酶參與了曲酸的生物合成，并提出了曲酸生物合成的可能途徑[27](圖1)。至此，以葡萄糖為底物時，曲酸合成通過簡單的氧化脫水反應而不破壞環(huán)結構這一理論基本得到證實。

圖1　葡萄糖為底物時曲酸生物合成的可能途徑

在以[2-14C]-二羥基丙酮為底物的同位素示蹤實驗中，C-2和C-5的放射性幾乎相等，其它位上也有一定的放射性；在已生長的培養(yǎng)基(碳源為無放射性葡萄糖)中再加入[2-14C]-二羥基丙酮后培養(yǎng)相同時間，C-5的放射性(66.5%)強于C-2(12.7%)，可能是由于加入的[2-14C]-二羥基丙酮與底物葡萄糖分解得到的丙糖或磷酸丙糖反應生成曲酸所致。在以[1-14C]-D-核糖為底物的同位素示蹤實驗中，放射性多分布在C-1、C-2、C-3，分別為36.7%、18.9%、24.5%，表明曲酸生成過程中有轉醛醇酶、轉酮醇酶等的參與[21-25]。由此看出，以不同的小分子糖為轉化底物時，所需酶類截然不同，底物同位素示蹤法并沒有推測出完整的轉化酶系，并且存在不小的出入，可能是因為曲霉屬菌株產(chǎn)曲酸存在不同的生物合成途徑。

2.2基因組學研究

基因組學研究始于21世紀初，隨著基因組測序技術的發(fā)展，米曲霉RIB40首先完成測序，包括8條染色體，大小為37.6 Mb；與煙曲霉和構巢曲霉相比，米曲霉基因組要大25%～30%，大約包括2 000～3 000個基因，這些基因主要與代謝相關，尤其是與次級代謝產(chǎn)物相關[28]，包括分泌型水解酶、轉運蛋白等。

2.2.1合成基因簇kojA、kojR、kojT

2010年，日本金澤工業(yè)大學的基因組生物技術實驗室和先進科學技術研究院通過調節(jié)曲酸生產(chǎn)的影響因素(氮源、發(fā)酵時間等)檢測基因的轉錄水平；通過參數(shù)設置，運用反向遺傳學方法和DNA微陣列技術鑒別和表征了與曲酸生物合成顯著相關的基因，分別是AO090113000136(kojA)和AO090113000138(kojT)，位于米曲霉菌的第五號染色體[29]；通過保守結構域的注釋，kojA主要負責編碼FAD氧化還原酶，kojT主要負責編碼轉運蛋白超家族。將這2個基因敲除后向培養(yǎng)基中加入Fe3+檢驗(與曲酸反應呈紅色)，培養(yǎng)基幾乎無色。

2011年，他們對kojA和kojT包夾的AO090113000137(kojR)進行研究時發(fā)現(xiàn)，kojR編碼蛋白具有Zn2Cys6雙核簇DNA結合域，15～58位氨基酸殘基由6個半胱氨酸殘基結合2個鋅原子組成，這一保守蛋白是真核典型的轉錄激活調節(jié)因子，通常結合于目的基因的上下游形成簇狀結構，如圖2所示。

圖2　Zn2Cys6調節(jié)因子的結構

通過構建米曲霉kojR缺失株(△kojR)及過表達株發(fā)現(xiàn)，kojR表達量與曲酸產(chǎn)量呈正相關，即△kojR中曲酸產(chǎn)量大幅降低，而過表達株曲酸產(chǎn)量升高，并且添加外源性的曲酸可以啟動該基因。在此基礎上，Marui等[30]推測出3個基因的相互作用機制為：kojR作為轉錄調控因子可正向調節(jié)kojA和kojT的表達，從而提高曲酸產(chǎn)量，如圖3所示。

圖3　kojR作用示意圖

Yamada等[31]通過構建質粒在米曲霉RIB40中過表達轉錄因子kojR時發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖為底物發(fā)酵12 d的曲酸產(chǎn)量從野生菌株的16.4 g·L-1升至26.4 g·L-1，提高了0.6倍；以淀粉為底物發(fā)酵18 d的曲酸產(chǎn)量從野生菌株的6.2 g·L-1升至19.4 g·L-1，提高了2.1倍，并且kojA、kojT轉錄水平也得到了大幅提高，上述推測得到證實。

2.2.2laeA

laeA基因是Bok等[32]于2004年首次從構巢曲霉中分離得到的新型絲狀真菌次級代謝全局性調控基因，編碼374個氨基酸，含有一個保守的與核蛋白甲基轉移酶硫腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionin，SAM)結合位點相同的結構域，SAM結合位點是laeA的關鍵功能域，對真菌次級代謝產(chǎn)物合成酶的調控主要表現(xiàn)為轉錄激活，比如，構巢曲霉中l(wèi)aeA可上調異青霉素N合成酶基因ipnA的mRNA水平，從而提高青霉素產(chǎn)量[33]。laeA及其同源類似物不僅存在于構巢曲霉中，同樣也存在于許多其它的絲狀真菌(如煙曲霉、黃曲霉等)中。

2011年，在已有的理論基礎上，日本金澤工業(yè)大學基因組生物技術實驗室通過構建米曲霉基因敲除模型對laeA進行敲除和回補，觀察曲酸生物合成相關的基因表達及曲酸合成情況[34]。結果發(fā)現(xiàn)，laeA敲除后，kojA、kojR和kojT的表達量明顯下降，發(fā)酵9 d后幾乎沒有曲酸積累，回補株則回到正常水平。表明，laeA在曲酸生物合成過程中起重要的調控作用。

2.2.3msnA

msnA及其同源基因編碼一種C2H2型鋅指調節(jié)蛋白，在多種應力調節(jié)反應中發(fā)揮作用。當微生物面臨生長壓力時，msnA可通過結合位于目標基因上游的應力調節(jié)元件的保守區(qū)域CCCCT，調控目標基因的轉錄和表達[35-36]。

為了研究msnA在菌株承受外界壓力時對菌落表型、次級代謝產(chǎn)物等方面的調節(jié)作用，Chang等[37]將msnA敲除后發(fā)現(xiàn)，A.parasiticusBN9、A.parasiticusRH、A.flavusCA14發(fā)酵8 d后，曲酸產(chǎn)量較野生菌株分別下降了20倍、10倍和4倍，表明msnA在曲酸合成過程中具有一定的負向調節(jié)作用。

3　結語

目前，國內(nèi)關于曲酸的研究主要集中在菌株篩選方面，水平遠落后于日本。為了避免傳統(tǒng)誘變育種的盲目性，需從分子水平進行突破。考慮到調節(jié)基因的范圍廣，有一定的研究基礎，曲酸的生物合成研究更傾向于調節(jié)基因，但合成基因簇方面的研究自2010年一直停滯不前，未能揭示曲酸的生物合成途徑。因此從分子水平上提高曲酸產(chǎn)量有待深入研究。

隨著各類數(shù)據(jù)庫以及生物信息學軟件(如SMURF、KEGG等)的開發(fā)，真菌次級代謝產(chǎn)物的研究有了更加便捷的手段，但一般的次級代謝研究軟件對次級代謝產(chǎn)物(如青霉素、黃曲霉毒素等)合成的研究是基于聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)和非核糖體肽合成酶(nontibosomal peptide synthetase，NRPS)等骨架基因的發(fā)現(xiàn)，而曲酸結構簡單，并不涉及這2種酶的利用，從而阻礙了生物信息學軟件在曲酸生物合成途徑研究中的應用。

綜上，盡管普通的誘變育種可使曲酸產(chǎn)量較野生菌株大幅提高，但曲酸應用廣泛，需求量大，為了進一步指導曲酸生產(chǎn)，研究方向應逐漸轉到分子水平，致力于合成基因簇的界定及代謝途徑的確定。盡管存在一定的困難，但以闡明合成途徑為橋梁，以基因工程為手段進行誘變育種，具有更明確的靶向性及更廣闊的發(fā)展前景。

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Research Progress on Fermentation and Biosynthesis Pathways of Kojic Acid

SHEN Min-na，CHEN Jian-hua

(SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China)

Thestatusofkojicacidfermentationwasintroducedinthispaper.Theresearchmeansandachievementsforbiosynthesispathwaysofkojicacidwerereviewed,includingtraditionalmeanisotopelabelingandemergingapproachgenomicanalysis.Thepossiblebiosynthesispathwaysofkojicacidandrelatedsynthesisandregulationgenesweresummarized.

kojicacid;fermentation;biosynthesis;genomics

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.08.003

2016-04-06

申敏娜(1991-)，女，河北石家莊人，碩士研究生，研究方向：微生物與生化藥學，E-mail：minna910320@163.com；通訊作者：陳建華，教授，E-mail：chenjhnj@163.com。

TQ 921.7

A

1672-5425(2016)08-0010-05

申敏娜，陳建華.曲酸發(fā)酵及生物合成途徑研究進展[J].化學與生物工程，2016，33(8)：10-14.