滿建梅，郭軍堂，張代娟，陳安琪

(濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，濰坊　261053)

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A53T α-synuclein抑制SH-SY5Y細胞2型囊泡單胺轉(zhuǎn)運體的表達

滿建梅，郭軍堂，張代娟，陳安琪

(濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，濰坊261053)

目的研究穩(wěn)定表達A53T α-synuclein對神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞中2型囊泡單胺轉(zhuǎn)運體(VMAT2)蛋白表達的影響。方法構(gòu)建A53Tα-synuclein真核表達載體，用脂質(zhì)體lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆細胞株；分別采用 Western blotting及DCFH-DA染色檢測細胞系A(chǔ)53T α-synuclein過表達對VMAT2蛋白的表達及細胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)(ROS)水平的影響。結(jié)果Western blotting結(jié)果顯示VMAT2的表達在穩(wěn)定表達A53T α-synuclein的細胞系中明顯降低。DCFH-DA染色結(jié)果顯示穩(wěn)定表達A53T α-synuclein細胞系內(nèi)DCF signal (507.3±7.1)較對照組 (410.7±10.5)明顯增多 (P<0.05)。結(jié)論A53T α-synuclein能夠通過抑制VMAT2的表達，增加細胞內(nèi)的ROS水平,在帕金森病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

帕金森氏??；A53T α-synuclein；VMAT2

帕金森氏病(Parkinson′s disease, PD)的主要病理特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的選擇性變性及Lewy body(LB)的形成，α-synuclein是LB的重要成分[1]。A53T α-synuclein是人們在常染色體顯性家族PD患者中發(fā)現(xiàn)的突變體[2]，與PD的發(fā)病密切相關(guān)，但具體機制還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)A53T α-synuclein可與VMAT2在體外發(fā)生特異性分子間相互作用[3]，提示A53T α-synuclein參與了多巴胺(DA)的代謝調(diào)節(jié)過程，在PD的多巴胺神經(jīng)元選擇性變性過程中發(fā)揮作用。本研究目的是建立穩(wěn)定表達A53T α-synuclein的細胞系，并研究其對VMAT2蛋白表達的影響， 為研究PD的發(fā)病機制提供新思路。

1　材料和方法

1.1材料

神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)所細胞中心；攜帶A53T α-synuclein的T載體及β-半乳糖苷酶的pcDNA3.0-Lacz真核細胞表達載體為本室保存；LipofectamineTM2000購自Gibco BRL；山羊抗人VMAT2多克隆抗體、小鼠抗人α-synuclein多克隆抗體、小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz；辣根酶(HRP)標記IgG購自中杉金橋； XhoI、HindIII、T4DNA連接酶、高保真Pyrobest DNA聚合酶購自大連寶生物；2’-7’-二氯熒光素雙醋酸鹽 ( DCFH-DA)、X-gal購自Sigma；G418購自Amersco；PCR引物由上海博亞公司合成。

1.2方法

1.2.1真核表達載體構(gòu)建：合成正義引物 cttcataagcttcgacagtgtggt(含HindIII內(nèi)切酶位點)和反義引物taagatctcgaggaaactgggagcaaag(含XhoI內(nèi)切酶位點)，以攜帶A53T α-synuclein的T載體為模板進行PCR反應。條件：94℃ 變性1 min，60℃退火30 s，72℃延伸 30 s，25個循環(huán)。回收的PCR產(chǎn)物與pcDNA3.0分別用HindIII和XhoI酶切。酶切產(chǎn)物純化后加入T4連接酶4℃連接過夜后轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)大腸桿菌，挑取單菌落小量擴增，提取質(zhì)粒，用HindIII和XhoI酶切鑒定并進行測序，測序正確的克隆命名為pcDNA3.0-A53T。

1.2.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：將SH-SY5Y接種于高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100 IU/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素)中，37℃，5% CO2培養(yǎng)；取對數(shù)生長期細胞接種到24孔板內(nèi)，當細胞密度達到50%～80%時，按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(Gibco BRL)說明書進行轉(zhuǎn)染。24 h后加入抗生素含G418的完全培養(yǎng)基進行持續(xù)篩選,兩周后挑選單克隆進行擴大培養(yǎng)并繼續(xù)保持篩選壓力到2個月以上。穩(wěn)定表達A53T α-synuclein的細胞系為實驗組，穩(wěn)定表達β-半乳糖苷酶的細胞系為對照組。

1.2.3β-半乳糖苷酶活性檢測：培養(yǎng)細胞72 h后,用冰冷的PBS洗滌細胞兩次，10%甲醛固定液室溫固定 5 min。 PBS 洗滌兩次后加入X-gal染色液(1g/L)，37 ℃ 孵 育12 h。顯微鏡下觀察，藍染細胞為表達β-半乳糖苷酶陽性細胞。

1.2.4Western blotting檢測蛋白表達：胰酶消化細胞后,1 000 g離心10 min, PBS 洗3次后,棄上清液，加入1/5 體積的6×SDS蛋白質(zhì)上樣緩沖液，混勻后100 ℃煮沸10 min進行12% SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，用TBST稀釋的5%脫脂奶粉室溫搖動封閉1 h，一抗(VMAT2抗體1∶500，α-synuclein抗體1∶500，β-actin抗體1∶500)室溫孵育4 h，1∶5 000二抗室溫孵育1 h, ECL 化學發(fā)光與曝光。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS水平：培養(yǎng)細胞24 h后，用胰酶進行消化；將細胞重新懸浮于預冷的無血清培養(yǎng)基中，加入DCFH-DA(10 μmol/L)，孵育20 min后， 離心收集細胞，PBS重新洗滌細胞3次，最后重新懸浮于500 μL PBS， 流式細胞儀(E6155, BD FACS Calibur)中檢測熒光強度，每次10 000個，重復3次,記錄平均DCF signal。

2　結(jié)果

2.1pcDNA3.0-A53T真核表達載體的鑒定

Hind III和XhoI雙酶切pcDNA3.0和pcDNA3.0-A53T，酶切產(chǎn)物電泳可見1泳道有500 bp左右大小的條帶，與預期結(jié)果一致(見圖1)。DNA測序結(jié)果與Genbank報道的序列一致。

M：DNA marker；1：pcDNA3.0-A53T；2：pcDNA3.0圖1　pcDNA3.0-A53T真核表達載體的酶切鑒定M: DNA marker; Lane 1: pcDNA3.0-A53T; Lane 2: pcDNA3.0.Fig.1　Identification of eukaryotic expression vector pcDNA3.0-A53T

2.2穩(wěn)定表達β-半乳糖苷酶細胞系的鑒定

真核表達載體pCMVSYN-A53T沒有β-半乳糖苷酶基因，在細胞中無法產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，無法作用于X-gal中的吲哚環(huán)而顯藍色。想反，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染β-半乳糖苷酶基因的細胞系能夠產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，細胞則有明顯的藍染，提示β-半乳糖苷酶在細胞系中穩(wěn)定表達。如圖2所示。

2.3Western blotting結(jié)果

Western blotting結(jié)果顯示，在SH-SY5Y細胞中有野生型α-synuclein蛋白的表達，但α-synuclein蛋白的表達量在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A53T α-synuclein的細胞系中(實驗組)較穩(wěn)定表達β-半乳糖苷酶細胞系(對照組)明顯增多，提示細胞系中有A53T α-synuclein的過表達，而VMAT2在實驗組中的表達量較實驗組明顯降低。如圖3所示。

2.4細胞內(nèi)ROS水平的變化

如圖4所示, 穩(wěn)定表達A53T α-synuclein細胞系的DCF signal (507.3±7.1)較穩(wěn)定表達β-半乳糖苷酶細胞系(410.7±10.5)明顯增高 (P<0.05)，提示A53Tα-synuclein過表達能夠明顯增加細胞ROS的產(chǎn)生。

注：A：穩(wěn)定表達β-半乳糖苷酶細胞系； B：穩(wěn)定表達A53Tα-synuclein細胞系圖2　X-gal染色檢測β-半乳糖苷酶的表達Note. A: Cells stably expressing β-galactosidase; B: Cells stably expressing A53T α-synuclein.Fig.2　The detection of β-galactosidase by X-gal staining

注：實驗組：穩(wěn)定表達A53Tα-synuclein細胞系；對照組：穩(wěn)定表達β-半乳糖苷酶細胞系圖3　Western blotting檢測A53T α-synuclein及VMAT2的表達Note. Experimental group: Cells stably expressing A53T α-synuclein. Control group: Cells stably expressing β-galactosidase.Fig.3　Expression of A53T α-synuclein and VMAT2 detected by Western blotting

圖4　細胞系內(nèi)ROS水平的變化Fig.4　Changes of intracellular ROS level

3　討論

α-Synuclein是一種具有非β-淀粉樣結(jié)構(gòu)(NAC)的可溶性蛋白質(zhì)，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前末梢和核周，在突觸囊泡轉(zhuǎn)運、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及多巴胺的代謝過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[4，5]。α-Synuclein蛋白正常、錯誤折疊及其寡聚化之間存在動態(tài)平衡，失衡后如出現(xiàn)大量錯誤折疊，會導致寡聚體及纖維體的形成。Peelaerts W等[6]認為纖維態(tài)是主要的毒性物質(zhì)，它可引起進行性運動功能損害和細胞死亡，具體的機制尚不清楚。目前研究認為導致PD發(fā)病的重要因素可能與DA異常代謝產(chǎn)生的ROS有關(guān)，它能夠引起神經(jīng)元細胞的氧化損害[7]。細胞內(nèi)的DA，尤其是DA的代謝產(chǎn)物能夠與α-synuclein相互作用，促進α-synuclein的異常聚集及纖維化，形成LB小體[8]。生理條件下，多巴胺一旦在神經(jīng)元中合成，立即可以通過VMAT2轉(zhuǎn)運到突觸囊泡中進行儲存，否則中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的DA能夠通過自身氧化和酶降解產(chǎn)生ROS[9]。

本研究通過Western blotting檢測顯示A53T α-synuclein在SH-SY5Y細胞系中穩(wěn)定高效表達，為進一步研究PD發(fā)病機制提供了良好的細胞模型。在穩(wěn)定表達A53T α-synuclein細胞系中的VMAT2表達水平明顯低于對照組，提示其有抑制VMAT2蛋白表達的作用。為了進一步探討A53T α-synuclein抑制VMAT2表達可能對細胞系產(chǎn)生的影響，我們通過DCFH-DA染色檢測細胞內(nèi)ROS水平的變化，結(jié)果顯示A53T α-synuclein過表達能夠明顯的增加細胞內(nèi)的ROS水平，這可能與其抑制VMAT2的表達有密切的關(guān)系。據(jù)此，我們認為過表達的A53T α-synuclein作用于VMAT2，下調(diào)其蛋白表達水平，打破了細胞內(nèi)DA的平衡，致使細胞內(nèi)ROS累積，造成對細胞的損害。A53Tα-synuclein如何影響VMAT2基因的表達及具體功能有待于進一步研究。

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A53T α-synuclein decreases the expression of type 2 vesicular monoamine transporter in neuroblastoma SH-SY5Y cells

MAN Jian-mei, GUO Jun-tang, ZHANG Dai-juan, CHEN An-qi

(School of Clinical Medicine, Weifang Medical University, Weifang 261053, China)

ObjectiveTo investigate the effect of A53T α-synuclein on the expression of type 2 vesicular monoamine transporter (VMAT2) in neuronblastoma SH-SY5Y cells stably expressing A53T α-synuclein. Methods A53T α-synuclein eukaryotic plasmid was constructed by transfection of the SH-SY5Y cells using LipofectamineTM2000, and a stable transfected monoclonal cell line was selected by G418. Western blotting and DCFH-DA staining were used to detect the effect of A53T α-synuclein overexpression on the expression of VMAT2 protein and level of reactive oxygen species (ROS). ResultsWestern blotting showed that compared with the control group, the expression of VMAT2 protein was significantly decreased, and DCFH-DA staining showed that DCF signal was significantly increased (507.3±7.1) than that in the cell line stably expressing A53T α-synuclein (410.7±10.5) (P<0.05). ConclusionsA53T α-synuclein can increase the intracellular ROS level by inhibiting the expression of VMAT2, thereby playing an important role in the pathogenesis of Parkinson′s disease.

Parkinson′s disease; A53T α-synuclein; VMAT2

山東省自然科學基金(ZR2011HM014)；山東省自然科學基金(ZR2015HL126)。

滿建梅(1989-)，女，碩士研究生，專業(yè)：病理學與病理生理學。Email:1192746984@qq.com。

陳安琪(1981-)，女。Email: chenanqi_1981@163.com。

研究報告

R-33

A

1671-7856(2016) 08-0066-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.08.010

2016-03-09