易　旭， 龍　黎， 程明亮

(1．貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)　550002；2．貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染科，貴州 貴陽(yáng)　550004)

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金屬硫蛋白表達(dá)在C57BL/6J小鼠肝細(xì)胞癌發(fā)生中的變化及意義

易旭1， 龍黎2， 程明亮2

(1．貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)550002；2．貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染科，貴州 貴陽(yáng)550004)

目的了解金屬硫蛋白(MTs)基因表達(dá)水平在小鼠肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化及其規(guī)律，探討MTs在HCC發(fā)生中的重要意義。方法將125只5～8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和HCC模型組。模型組小鼠于第1、2周分別腹腔注射一次二乙基亞硝胺(100 mg/kg，50 mg/kg)，第3周起灌胃給予乙醇(53%，5 mL/kg，5 d/周)，直至35周；正常組始終給予等量滅菌自來(lái)水灌胃。分別于實(shí)驗(yàn)1、3、9、13、24及35周末處死小鼠，收集肝組織樣本并計(jì)算肝臟指數(shù)。采用組織病理學(xué)HE、Masson及網(wǎng)狀纖維染色檢測(cè)肝組織損傷及HCC發(fā)生情況，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)肝組織勻漿丙二醛( MDA)的活性；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析MTs轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果模型組小鼠可見(jiàn)進(jìn)行性的肝臟病變，35周末時(shí)，肝臟質(zhì)地顯著變硬，表面可見(jiàn)大小不等結(jié)節(jié)形成，約50%小鼠可見(jiàn)肝細(xì)胞異常核分裂像和異常的肝板結(jié)構(gòu)等HCC發(fā)生病理改變，具有顯著增加的肝臟指數(shù)；不同時(shí)段均表現(xiàn)出增加的MDA活性；實(shí)驗(yàn)13周前各時(shí)段具有顯著增加的MTs mRNA水平，24周后可見(jiàn)III級(jí)纖維化形成，且MTs mRNA水平顯著下降，甚至低于正常水平。結(jié)論小鼠肝組織MTs mRNA水平從損傷初期的顯著增加直至顯著纖維化后的低表達(dá)變化，表明MTs表達(dá)下調(diào)與HCC發(fā)生有關(guān)。

肝細(xì)胞癌；金屬硫蛋白；基因表達(dá)；小鼠

金屬硫蛋白(metallothioneins, MTs)是一小分子量、富含半胱氨酸的重金屬結(jié)合蛋白，其抗氧化能力在動(dòng)脈粥樣硬化、心肌保護(hù)、腦缺血再灌注損傷及肝毒性等多種生理及病理過(guò)程中具有重要意義[1-3]。研究認(rèn)為，MTs在包括上皮及葉間來(lái)源的多種腫瘤中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，且與腫瘤的侵襲能力及較差的預(yù)后密切相關(guān)，但在胃腸道腫瘤和肝細(xì)胞癌(HCC)中的研究數(shù)據(jù)卻得出相反的結(jié)論，即具有下調(diào)的，甚至低于正常水平的MTs水平[4-6]。由于大量研究表明了氧化應(yīng)激和HCC惡性轉(zhuǎn)化的相關(guān)性[7]，因此，為了進(jìn)一步明確肝臟MTs這一重要抗氧化劑的表達(dá)水平與HCC發(fā)生的關(guān)系，本文參考文獻(xiàn)[8]，以遺傳毒物二乙基亞硝胺為引發(fā)劑，乙醇為促進(jìn)劑制備C57BL/6J雄性小鼠HCC發(fā)生模型，在不同處理時(shí)段動(dòng)態(tài)檢測(cè)肝組織MTs基因表達(dá)水平，探討其變化規(guī)律，以期為HCC的防治提供有意義的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下：

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠125只，5～8周，體重(21±2)g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供(動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)：SCXK (京)2009-0004)。飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心帶有IVC系統(tǒng)的飼養(yǎng)房?jī)?nèi)，使用許可證號(hào)為SYXK(黔)2012-0001，SPF級(jí)小鼠用飼料喂養(yǎng)，自由飲用滅菌自來(lái)水，恒溫(20～23)℃。

1.2試劑

二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，美國(guó)Sigma, N0756)；無(wú)水乙醇(20110714，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純AR)；丙二醛ELISA試劑盒(JK10167，美國(guó)BD)；離心柱型總RNA提取試劑盒(L1126，北京天根)；離心柱型RNA純化試劑盒(K0011，北京天根)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(00135397，美國(guó)Thermo Scientific)；2× SYBR Green Mix (1210，美國(guó)Biomiga)；β-actin、MT-1及MT-2引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成；

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

健康雄性C57BL/6J小鼠125只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組(60只)和模型組(65只)。模型組小鼠于實(shí)驗(yàn)第1、2周分別腹腔注射一次二乙基亞硝胺(100 mg/kg，50 mg/kg)，第3周起灌胃給予乙醇(53%，5 mL/kg，5 d/周)，直至35周。正常對(duì)照組小鼠始終灌胃給予滅菌自來(lái)水。

1.4檢測(cè)指標(biāo)和檢測(cè)方法

1.4.1標(biāo)本采集與組織病理學(xué)檢測(cè)：小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，分別于實(shí)驗(yàn)1、3、9、13、24及35周末觀察、收集肝組織樣本并計(jì)算肝臟指數(shù)(肝臟指數(shù)=肝臟濕重/體重 × 100%)；病理學(xué)檢測(cè)用肝組織置于4%中性甲醛內(nèi)固定24～48 h后，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm切片，行HE、Masson及網(wǎng)狀纖維染色，鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化(HCC發(fā)生組織學(xué)判斷以國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)出版的嚙齒類動(dòng)物腫瘤標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[9]，由貴州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室協(xié)助完成)。1.4.2肝組織勻漿丙二醛的含量(nmol/mg)測(cè)定：分別制備各階段兩組小鼠肝組織混合樣本0.5～0.8 g，置于預(yù)冷的1 mL生理鹽水中，玻璃勻漿器手工勻漿，4 000 r/min，離心10～15 min，取上清液，稀釋100倍后參考試劑盒說(shuō)明書(shū)以雙抗體夾心法檢測(cè)勻漿中丙二醛的活性。

1.4.3肝組織MT-1、MT-2基因mRNA水平：提取、純化各時(shí)段小鼠肝組織總RNA，運(yùn)用變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外吸收測(cè)定法對(duì)RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)；以1 μg總RNA于10 μL逆轉(zhuǎn)錄體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；cDNA產(chǎn)物4倍稀釋后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，設(shè)置實(shí)時(shí)定量PCR程序：50℃ 2 min(1個(gè)循環(huán))，95℃ 10 min(1個(gè)循環(huán))，95℃ 15 s，60℃ 1 min(40個(gè)循環(huán))。目的基因Ct值經(jīng)同一樣本的內(nèi)參基因校正后計(jì)算各組間每個(gè)基因的ΔΔCt，通過(guò)2-ΔΔCt計(jì)算組間對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)差異。β-actin、MT-1及MT-2基因引物序列如下：MT-1 F5′-AATGTGCCCAGGGCTGTGT-3′，R5′- GCTGGGTT GGTCCGATACTATT-3′；MT-2 F5′-TGTGCCTCC GATGGATCCT-3′，R5′-GCAGCCCTGGGAGCACTT-3′；β-actin F 5′-GGCCAACCGTGAAAAGATGA-3′，R5′- CAGCCTGGATGGCTACGTACA-3′。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1小鼠肝臟解剖與鏡下病理學(xué)觀察

35周后，正常組小鼠無(wú)肉眼可見(jiàn)的病理改變。模型組小鼠肝臟外觀呈黃褐色，腫脹、質(zhì)地變硬且表面形成大小不等結(jié)節(jié)(最大直徑可達(dá)到0.5～1.0 cm)(圖1)。運(yùn)用H&E、Masson和網(wǎng)狀纖維染色鏡檢發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)1周后，肝細(xì)胞明顯水腫，3周后可見(jiàn)較多點(diǎn)灶狀壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2 A，B)；9周后可見(jiàn)肝細(xì)胞氣球樣變、脂肪變性，部分肝組織可見(jiàn)輕度(I級(jí))的纖維化形成(圖2 C)；13周后可見(jiàn)明顯的碎片狀壞死，II級(jí)纖維化形成(圖2 D)；24周時(shí)見(jiàn)顯著的橋接壞死、亞大塊壞死與密集的非典型增生，III級(jí)纖維化形成(圖2 E)；35周末可見(jiàn)異常核分裂像、異常的肝板結(jié)構(gòu)(肝板數(shù)量增加≥3層)等肝細(xì)胞癌病理改變，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維間隔及假小葉形成(圖2 F)。

2.2肝臟指數(shù)及肝組織勻漿MDA水平

處理35周后，與正常組比較，模型組小鼠肝臟顯示顯著增加的肝臟指數(shù)(P<0.01)；在觀察的6個(gè)時(shí)段，模型組均呈現(xiàn)比正常組顯著增加的肝組織MDA水平(P<0.01)(表1)。

注：與正常組比較，aP<0.01。

Note.aP<0.01, compared with the control group.

注：A：正常組；B：模型組圖1　35周末正常組與模型組小鼠肝臟大體觀(箭頭示腫瘤結(jié)節(jié))Note. A: Control group; B: Model groupFig.1　Representative images of the mouse livers at 35-week (arrows indicate the tumor nodules)

注：A、B、C、D、E、F、分別為處理1、3、9、13、24及35周末時(shí)肝組織鏡下觀(箭頭示肝組織病理改變)。圖2　不同時(shí)段小鼠肝組織H&E、Masson及網(wǎng)狀纖維染色鏡下觀(標(biāo)尺=100 μm/50 μm)Note. A-F: Light microscopy of mice liver at 1 ,3, 9, 13, 24 and 35 weeks, respectively (arrows indicate the pathological changes of liver).Fig.2　Pathological changes of the liver in mice. H&E, Masson and reticular fiber staining. (Bar=100 μm/50 μm)

2.3肝組織MT-1、MT-2 mRNA水平

正常組小鼠在不同時(shí)段間具有相似的肝組織MT-1或MT-2 mRNA表達(dá)水平；實(shí)驗(yàn)1、3、9及13周末，模型組小鼠均顯示比正常組顯著增加的MT-1 mRNA表達(dá)水平(P<0.01)，且隨病程進(jìn)展逐漸降低；實(shí)驗(yàn)24及35周末，模型組小鼠肝組織MT-1的mRNA水平均顯著低于正常組小鼠(P<0.01)；MT-2 mRNA表達(dá)水平于實(shí)驗(yàn)13周末時(shí)與正常組相似，24周后也顯著低于正常組小鼠(表2)。

表2　不同時(shí)段小鼠肝組織MT-1、MT-2 mRNA表達(dá)水平分析

注：與正常組比較，aP<0.01

Note.aP<0.01, compared with the control group.

3　討論

肝細(xì)胞癌(HCC)是世界范圍內(nèi)第5位最常見(jiàn)和第3位引起癌癥相關(guān)死亡的惡性腫瘤，治療選擇非常局限[10]。許多研究證實(shí)了人類多種腫瘤中同時(shí)具有增加的MTs表達(dá)，如乳腺癌、腎癌、肺癌、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌、唾液腺癌、睪丸癌和膀胱癌等[6]，但也發(fā)現(xiàn)MTs的表達(dá)并不常見(jiàn)于所有人類腫瘤，如HCC[3,4]。運(yùn)用DEN誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠HCC模型，Jharna D等[5]發(fā)現(xiàn)MT的表達(dá)在HCC組織中顯著減少甚至缺乏，一致地，運(yùn)用HCC臨床樣本，發(fā)現(xiàn)癌組織中MT表達(dá)亦顯著低于相應(yīng)的鄰近正常肝組織。Park Y等[11]也發(fā)現(xiàn)，MT-1、MT-2人HCC癌組織細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)MT-1、MT-2表達(dá)的丟失比鄰近癌旁組織顯著，多元變量分析揭示MT-1、MT-2表達(dá)的減弱是無(wú)復(fù)發(fā)生存和總生存率的獨(dú)立預(yù)后不良因素。研究表明[12]，MTs敲除鼠(MTKO鼠)顯示了更高的超氧化物陰離子水平，MTs的缺失通過(guò)活化NF-κB靶基因促進(jìn)DEN誘導(dǎo)的肝癌形成。上述研究結(jié)果均提示MTs下調(diào)可能與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，因此，有必要了解HCC發(fā)生過(guò)程中MTs表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步證實(shí)其與HCC發(fā)生的相關(guān)性?；谏鲜鲅芯吭O(shè)想，本文通過(guò)制備HCC發(fā)生動(dòng)態(tài)小鼠動(dòng)物模型，了解了不同時(shí)段肝組織MTs基因的轉(zhuǎn)錄水平。

基于酒精相關(guān)性肝癌形成的機(jī)制及HCC化學(xué)誘導(dǎo)模型制備的原理，本文參考文獻(xiàn)方法[8]，采用化學(xué)誘導(dǎo)二步法制備小鼠HCC發(fā)生模型，以遺傳毒物二乙基亞硝胺(DEN)為引發(fā)劑，乙醇為促進(jìn)劑。該誘導(dǎo)方法的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)肝臟的損傷-纖維化-惡性轉(zhuǎn)變周期同人類HCC的發(fā)生高度相似[13]。研究表明，HCC的發(fā)生除與誘導(dǎo)劑及濃度有關(guān)外，還與性別、年齡和鼠種類有關(guān)[5]。Brandon-Warner等研究了乙醇對(duì)HCC發(fā)生的影響，發(fā)現(xiàn)慢性乙醇喂養(yǎng)能協(xié)同DEN明顯增加雄性小鼠腫瘤的發(fā)生[14]。基于上述研究背景，本文選擇雄性C57BL/6J小鼠作為實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙醇 + DEN處理35周，顯著誘導(dǎo)了小鼠肉眼可見(jiàn)的肝臟病變及鏡下進(jìn)行性的肝臟損傷、癌前病變甚至典型的HCC發(fā)生等病理改變；同時(shí)，通過(guò)對(duì)不同時(shí)段肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化物的檢測(cè)也揭示了模型組小鼠始終增加的肝臟丙二醛含量。

基于氧化應(yīng)激在DEN及酒精相關(guān)性肝細(xì)胞癌形成中的重要作用，以及過(guò)多自由基形成和MTs缺失或減弱促進(jìn)肝癌形成的理論基礎(chǔ)[7,15,16]，從抗氧化應(yīng)激角度探討MTs水平動(dòng)態(tài)變化與HCC發(fā)生的相關(guān)性具有重要的毒理學(xué)與臨床意義。在哺乳動(dòng)物中，MTs包括4種亞型(MT1-MT4)，其中MT-1和MT-2幾乎存在于所有類型軟組織，能夠被多種刺激，包括金屬離子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和氧化應(yīng)激等活化，呈數(shù)倍增加，從而保護(hù)細(xì)胞抗細(xì)胞毒性、輻射和DNA損傷[17,18]。Klaassen等[19]認(rèn)為，肝臟MTs的誘導(dǎo)是一影響對(duì)肝臟毒性結(jié)果發(fā)生發(fā)展的重要適應(yīng)性機(jī)制。運(yùn)用MTs過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)染鼠或MTs裸鼠的研究也強(qiáng)有力地顯示了不同氧化應(yīng)激條件下MTs的抗氧化損傷保護(hù)，如阿霉素心臟毒性、缺血-再灌注、糖尿病和酒精消費(fèi)等[1]。本文對(duì)不同時(shí)段小鼠肝組織MT-1、MT-2基因轉(zhuǎn)錄水平的分析發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)早期，即出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死、急性炎癥病理表現(xiàn)時(shí)，小鼠產(chǎn)生非常顯著的MTs轉(zhuǎn)錄水平，尤其MT-1。隨著誘導(dǎo)的進(jìn)行，肝臟出現(xiàn)中重度纖維化，此時(shí)肝組織MTs表達(dá)水平亦顯著下降，甚至低于正常水平。結(jié)果顯示小鼠肝組織MTs基因表達(dá)水平呈現(xiàn)一定的變化與規(guī)律性，總的趨勢(shì)表現(xiàn)為與肝臟損傷程度呈負(fù)相關(guān)，即從損傷初期的顯著增加直至纖維化形成后的低表達(dá)。表明隨著肝臟損傷因素的持續(xù)，肝組織應(yīng)激性增加MTs轉(zhuǎn)錄的能力逐漸減弱甚至喪失，從而失去了其對(duì)肝臟損傷的保護(hù)。因此，本文結(jié)果進(jìn)一步提示MTs在不同病理時(shí)段的表達(dá)差異性表明了其在肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的潛在作用。由于大量的研究認(rèn)為增加抗氧化劑的運(yùn)用可降低癌癥的發(fā)生率[20]，故設(shè)想若早期刺激肝組織中MTs合成或外源補(bǔ)充MTs也許是阻止HCC發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要策略。綜合目前國(guó)內(nèi)外的研究，尚未有關(guān)不同病因所致HCC過(guò)程中MT表達(dá)情況的報(bào)道，因此，本文也是首先初步探討了MT表達(dá)動(dòng)態(tài)變化與酒精相關(guān)性肝癌發(fā)生的相關(guān)性，對(duì)于其他病因所致的HCC，尤其是乙型肝炎病毒/丙型肝炎病毒相關(guān)性HCC，其發(fā)生過(guò)程中MT表達(dá)的變化將是我們下一步努力探討的方向。

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Changes and significance of metallothionein expression during hepatocarcinogenesis in C57BL/6J mice

YI Xu1, LONG Li2, CHENG Ming-liang2

(1．Central Laboratory, Second Hospital Affiliated to Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China;2. Department of Infectious Diseases, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China)

ObjectiveTo investigate the dynamic changes of metallothionein(MTs)gene expression and explore the important significance of MTs during hepatocarcinogenesis. Methods One hundred and twenty-five SPF 5-8-week old male C57BL/6J mice were randomly divided into control group and model group. Diethylnitrosamine (DEN) was given to the mice at a dose of 100 mg/kg, ip, and 50 mg/kg, ip, in the first and next week, respectively. The mice were given ethanol (53%, 5 mL/kg/day, 5 days/week) from the third week of experiment till 35 weeks. At 1, 3, 9, 13, 24 and 35 weeks of the experiment, liver samples were taken for histopathological examination of liver damages and incidence of HCC. The liver index and malondialdehyde (MDA) of liver homogenate were determined. All liver tissue samples were examined by histopathology using hematoxylin and eosin (HE), Masson and reticular fiber staining. Real-time RT-PCR was used to analyze the mRNA expression level of liver metallothionein-1/2 (MT-1/2) in different periods. ResultsProgressive liver damages in model group mice were identified in different periods. Hepatocytes abnormal tission and abnormal liver plate structure, architecture often characteristic of HCC could be seen in approximately 50% of mice at 35 weeks. In addition to these, a higher liver index also were seen at 35 weeks. Increased MDA levels in the mouse liver tissues were observed in each stage. Real-time RT-PCR analysis showed that significantly increased transcription of MT-1 and MT-2 at 1, 3 and 9 weeks, then gradually declined and even below the normal level. ConclusionsMTs gene expression levels in mouse liver tissues are changed from significantly increased in the early stage of injury to decreased expression combined with distinct fibrosis. Our findings further demonstrate that the down-regulation of MTs level is closely correlated with hepatocarcinogenesis.

Hepatocellular carcinoma; Carcinogenesis; Metallothionein; Gene expression; Mice

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃前期專項(xiàng))(2011CB512114)。

易旭(1976-)，女，研究方向：肝病的基礎(chǔ)研究。 E-mail: yixu2013@yeah.net。

程明亮(1956-)，男，研究方向：肝病的防治基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail: mlcheng@yeah.net。

研究報(bào)告

R-33

A

1671-7856(2016) 08-0053-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.08.008

2016-03-28