周　琴　張　勤　周素芽.浙江省人民醫(yī)院兒科，浙江杭州　3004；.杭州市兒童醫(yī)院新生兒科，浙江杭州　30006

TLR4在晚發(fā)型新生兒敗血癥中的意義

周琴1張勤1周素芽2
1.浙江省人民醫(yī)院兒科，浙江杭州310014；2.杭州市兒童醫(yī)院新生兒科，浙江杭州310006

目的探討Toll樣受體4（TLR4）對(duì)晚發(fā)型新生兒敗血癥診斷的臨床意義。方法選取2011年8月～2014年11月我院收治的血培養(yǎng)陽(yáng)性的新生兒38例作為敗血癥組，根據(jù)感染病原體將其分為革蘭陽(yáng)性菌感染組（G+組）23例，革蘭陰性菌感染組（G-組）15例，另選取我院同期收治的無(wú)感染性疾病的新生兒20例作為對(duì)照組，采集各組患兒外周血，應(yīng)用密度梯度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用RT-PCR法檢測(cè)TLR4 mRNA表達(dá)水平，免疫投射比濁法檢測(cè)血清CRP水平。比較組間各指標(biāo)的差異，并分析兩者的相關(guān)性。結(jié)果 G+組與G-組TLR4 mRNA及CRP水平與對(duì)照組相比均明顯升高（P<0.01）；CRP在G+組與G-組兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；G-組TLR4 mRNA的表達(dá)明顯高于G+組（P<0.05）。TLR4與CRP呈正相關(guān)（r=0.749，P＜0.01）。結(jié)論TLR4可以作為診斷晚發(fā)型新生兒敗血癥的有效指標(biāo)，尤其對(duì)于識(shí)別革蘭陰性菌感染更有意義。

Toll樣受體4；C反應(yīng)蛋白；新生兒；敗血癥

[Abstract]Objective To investigate the clinical significance of toll-like receptor 4(TLR4)in the diagnosis of late-onset neonatal septicemia.Methods A total of 38 newborns with positive blood culture who were admitted from August 2011 to November 2014 were selected as the septicemia group.According to the infection pathogens,the newborns were divided into gram positive bacteria infection group(G+)with 23 cases,gram negative bacteria infection group(G-)with 15 cases and 20 newborns without infectious diseases from the same period of time were selected as the control group. The peripheral blood of the newborns was collected and peripheral blood mononuclear cells were isolated with the density gradient centrifugation.The expression level of TLR4 mRNA was detected with RT-PCR method and serum CRP level was detected with immunity transmission turbidity.Compare the differences of each index of the two groups and analyze the correlation of the two groups.Results G+group and G-group both had significant higher TLR4 mRNA and CRP level compared with that of the control group(P<0.05);the difference of CRP level of the G+group and G-group had no statistical significance(P>0.05);the TLR4 mRNA level of G-group was significantly higher than that of the G+group(P<0.05).TLR4 and CRP had positive correlation(r=0.749,P<0.01).Conclusion TLR4 can be taken as the effective index in the diagnosis of late-onset neonatal septicemia,especially for the identification of G+infection.

[Key words]Toll-like receptor 4;C-reactive protein;Newborn;Septicemia

新生兒免疫系統(tǒng)未成熟，免疫功能較差，極易發(fā)生細(xì)菌感染，發(fā)生感染后很難局限而導(dǎo)致敗血癥[1]。新生兒敗血癥早期臨床表現(xiàn)不典型，病情發(fā)展迅速，是新生兒死亡的重要原因[2]，因此選取敏感性、特異性高的指標(biāo)對(duì)新生兒敗血癥的早期診斷具有非常重要的意義。雖然C反應(yīng)蛋白（C-reaction protein，CRP）是新生兒敗血癥經(jīng)典的指標(biāo)之一，但其仍缺乏一定的特異性[3]。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁，可與病原識(shí)別模式分子結(jié)合，通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)致炎癥因子釋放，從而識(shí)別病原微生物、啟動(dòng)炎癥應(yīng)答[4]。為了探討TLR4與 CRP在晚發(fā)型新生兒敗血癥中的表達(dá)及其臨床價(jià)值，本研究選取了我院收治的患敗血癥新生兒進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2011年8月～2014年11月浙江省人民醫(yī)院新生兒科收治的血培養(yǎng)陽(yáng)性的新生兒38例作為敗血癥組，所有患兒均于出生7 d后發(fā)病，且符合新生兒敗血癥相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。38例患兒中，男21例，女17例，胎齡37～42周，日齡8～28 d，平均（19.2±5.4）d。根據(jù)血培養(yǎng)結(jié)果將其分為革蘭陽(yáng)性菌組（G+組）23例，其中表皮葡萄球菌13例，溶血性葡萄球菌7例，金黃色葡萄球菌3例；革蘭陰性菌組（G-組）15例，其中大腸埃希菌 6例，肺炎克雷伯桿菌5例，鮑曼不動(dòng)桿菌4例。另選取我院同期收治的無(wú)感染性疾病的新生兒20例作為對(duì)照組，其中男12例，女8例，日齡8～28 d，平均（20.1±5.7）d。各組之間在出生體重、日齡以及胎齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

TRI Reagent總RNA提取試劑盒（TR-118）為MRI公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒（DRR023A）購(gòu)自TaKaRa公司。Ficoll分離液（CL5020）購(gòu)自上海普飛生物技術(shù)有限公司。RT-PCR儀為Biometra Germen公司產(chǎn)品。CRP檢測(cè)采用邁瑞公司BECKMAN生化儀。

1.3標(biāo)本收集與處理

敗血癥組患兒使用抗生素前，于清晨空腹抽取2 mL靜脈血，取0.5 mL用免疫投射比濁法檢測(cè)CRP的水平；1.5 mL加入Ficoll分離液，采用密度梯度離心法以3500 rpm/min，時(shí)間20 min，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞[6]。加入Trizol提取總RNA，隨后放于-70℃凍存。對(duì)照組患兒于空腹采集2 mL外周靜脈血，標(biāo)本處理同上。

1.4RT-PCR法檢測(cè)TLR4 mRNA

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按TaKaRa公司試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。用β-actin作為內(nèi)參照，引物序列及反應(yīng)條件：①βactin：5’-CTACAATGCTGCGT GTGG-3’，5’-ATGGC TACGTACATGGCTGG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度138 bp；②TLR4：5’-GCCGGAAAGTTATTGTGGTGGT-3，5’-ATGGGT TTTAGGCGCAGAGTTT-3’；94℃3 min后，94℃30 s，59℃30 s，72℃1 min，循環(huán)32次，72℃延伸5 min終止，產(chǎn)物長(zhǎng)度356 bp。用SmartView分析產(chǎn)物光密度值，以TLR4條帶與β-actin的光密度值比，作為其mRNA水平的指標(biāo)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以（x±s）表示，G+組與G-組和對(duì)照組比較采用單因素方差分析，G+組與G-組比較用LSD檢驗(yàn)，TLR4與CRP的相關(guān)性采用Pearson等級(jí)相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1三組新生兒TLR4 mRNA、CRP水平檢測(cè)水平比較

與對(duì)照組比較，G+組與G-組新生兒TLR4 mRNA 及CRP水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；CRP在G+組[（46.92±18.69）mg/L]與G-組[（55.70± 26.97）mg/L]兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；TLR4 mRNA在G-組（1.94±0.23）的表達(dá)明顯高于 G+組（1.78±0.26），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2TLR4與CRP的相關(guān)性分析

TLR4 mRNA的含量與CRP的水平呈正相關(guān)（r= 0.749，P＜0.01）。

表1　三組新生兒TLR4 mRNA與CRP水平比較（x±s）

3　討論

新生兒由于免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，特異性與非特異性免疫反應(yīng)均較差，因此對(duì)感染普遍易感，且感染后不能有效清除體內(nèi)病原體，容易擴(kuò)散形成敗血癥[7]。同時(shí)新生兒敗血癥早期缺乏典型的臨床表現(xiàn)，多為不哭、不動(dòng)、嗜睡、反應(yīng)力低下等，因此不易被及時(shí)診斷[8]。血培養(yǎng)是確診敗血癥的金標(biāo)準(zhǔn)，但陽(yáng)性率低，且至少需要48 h才能得到結(jié)果，不能進(jìn)行早期診斷。因此，迫切需要尋找一種準(zhǔn)確而快速診斷新生兒敗血癥的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

CRP是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，主要是由肝臟合成，其含量在機(jī)體炎癥反應(yīng)或組織損傷時(shí)明顯增加，是非特異性炎性指標(biāo)[9]。CRP可在新生兒感染后在6 h內(nèi)迅速增加，達(dá)峰于48 h，半衰期約19 h，高峰可為正常值的100~1000倍[10]。CRP可在敗血癥的過(guò)程中持續(xù)升高，但其亦可在腫瘤、其他免疫性疾病中升高，故缺乏一定的特異性[11]。且我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CRP的表達(dá)在G+與G-細(xì)菌感染之間無(wú)差異，這對(duì)于我們臨床在區(qū)分可能的病原菌感染及選擇抗生素時(shí)，帶來(lái)了一定的困難。我們實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在CRP上升的同時(shí)，TLR4的表達(dá)也逐漸增加，兩者呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)。那么在敗血癥的新生兒患兒中檢測(cè)TLR4是否可以作為CRP的補(bǔ)充指標(biāo)呢？

TLRs最早由果蠅體內(nèi)分離得到，是一類與免疫系統(tǒng)識(shí)別微生物有關(guān)的細(xì)胞膜跨膜受體，是機(jī)體抵抗病原體的屏障，在非特異性免疫中發(fā)揮重要作用[12]。當(dāng)細(xì)胞外病原體相關(guān)分子模式配體與 TLRs結(jié)合后，又可激活特異性免疫[13]。TLR4是首個(gè)在人類細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的TLR，主要表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞膜上，可識(shí)別革蘭陰性菌的細(xì)胞壁成分：如脂多糖、脂磷壁酸等，激活后可產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子及效應(yīng)因子，進(jìn)一步活化放大炎癥反應(yīng)，從而有效清除病原體[14，15]。王琳等[16]認(rèn)為，新生兒尤其早產(chǎn)兒TLR表達(dá)低下，可能是新生兒免疫功能差、易患新生兒敗血癥等感染性疾病的原因之一。Kollmann等[17]發(fā)現(xiàn)在晚發(fā)型新生兒敗血癥患兒體內(nèi)，TLR通過(guò)識(shí)別細(xì)菌表面的脂多糖成分活化單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，從而激活絲裂原蛋白活化激酶，發(fā)揮清除細(xì)菌的作用。Redondo等[18]在血培養(yǎng)陽(yáng)性的敗血癥新生兒的單核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TLR4的表達(dá)明顯升高，且在革蘭陰性菌組TLR4的升高更加明顯，但TLR2的表達(dá)水平與對(duì)照組相比卻無(wú)明顯上升。張金萍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，新生兒敗血癥組TLR2與TLR4均明顯增高，且TLR2在革蘭陽(yáng)性菌感染時(shí)升高明顯，而革蘭陰性菌感染時(shí)TLR4顯著增高。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，革蘭陰性菌感染組TLR4 mRNA的表達(dá)明顯高于革蘭陽(yáng)性菌感染組，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符[20]，其機(jī)制可能與TLR4能識(shí)別脂多糖等革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分相關(guān)。這一結(jié)果也提示，在可疑新生兒敗血癥的患兒早期檢測(cè)CRP的同時(shí)，測(cè)定TLR4的水平，不僅能作為判斷敗血癥感染的指標(biāo)，而且TLR4的明顯升高更能提示革蘭陰性菌感染的可能性，為在取得血培養(yǎng)結(jié)果之前經(jīng)驗(yàn)性選擇抗生素提供有力的實(shí)驗(yàn)保障。

綜上所述，TLR4可以作為診斷晚發(fā)型新生兒敗血癥的有效指標(biāo)，尤其對(duì)于識(shí)別革蘭氏陰性菌感染更有意義。但我們?nèi)孕柩芯堪l(fā)生新生兒敗血癥時(shí)TLR4的下游信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)一步研究是否可以通過(guò)抑制其活化，來(lái)達(dá)到控制炎癥瀑布反應(yīng)的產(chǎn)生，從而為臨床治療新生兒敗血癥帶來(lái)新的思路和理論依據(jù)。

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Significance of TLR4 in the late-onset neonatal septicemia

ZHOU Qin1ZHANG Qin1ZHOU Suya2
1.Department of Pediatrics,Zhejiang People's Hospital,Hangzhou310014,China;2.Department of Neonatology, Hangzhou Children's Hospital,Hangzhou310006,China

R722.1

A

1673-9701（2016）12-0011-03

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金計(jì)劃（2011ZB014）

2016-01-04）