劉盛華 劉小利 李彬 鄒增曉

熊果酸在大鼠自體靜脈移植再狹窄模型中抑制血管炎癥因子的實(shí)驗(yàn)研究

劉盛華 劉小利 李彬 鄒增曉

目的 探討熊果酸對大鼠自體靜脈再狹窄過程中炎癥反應(yīng)的抑制作用及可能的機(jī)制。方法SD大鼠45只，體重300～350 g，隨機(jī)分成A組、B組和C組，每組15只。A組大鼠不做任何處理；B組和C組大鼠用“套管法”將其右側(cè)頸外靜脈移植至右側(cè)頸總動脈；C組術(shù)后每天予以熊果酸30 mg·kg-1·d-1灌胃。術(shù)后48 h切除右側(cè)頸外靜脈檢測MCP-1、IL-1α、IL-6和 TNF-α等細(xì)胞因子。結(jié)果 MCP-1：A組（655.5±47.4）pg/mg，B 組 （7959.7±823.5）pg/mg，C 組 （4339.0±578.8）pg/mg；IL-1α：A 組 （496.8±46.2）pg/mg，B 組（4015.6±427.1）pg/mg，C 組（2838.5±298.9）pg/mg；IL-6：A 組（664.4±63.5）pg/mg，B 組（2414.8±155.1）pg/mg，C組（1325.8±56.4）pg/mg；TNF-α：A 組（149.5±7.8）pg/mg，B 組（546.0±72.6）pg/mg，C 組（286.2±18.6）pg/mg。B 組和C組細(xì)胞因子均較A組顯著增高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C組細(xì)胞因子較B組顯著降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 熊果酸可能通過抑制炎癥反應(yīng)中心物質(zhì)NF-κB的活化，進(jìn)而抑制MCP-1、IL-1α，IL-6及TNF-α的表達(dá)。熊果酸可以抑制術(shù)后靜脈橋血管的再狹窄。

冠狀動脈旁路移植術(shù)；再狹窄；熊果酸

冠狀動脈旁路移植術(shù)（coronary artery bypass graft，CABG）是治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的最主要外科方法之一。乳內(nèi)動脈和大隱靜脈是最常采用的橋血管。隨訪資料顯示，冠狀動脈旁路移植術(shù)中乳內(nèi)動脈吻合前降支，1年通暢率達(dá)95.7%，10年通暢率在90.0%以上[1]。研究表明，大隱靜脈1年、5年的通暢率分別為93%、74%，10年通暢率僅為50%～60%[2]，遠(yuǎn)期效果明顯不如乳內(nèi)動脈。目前認(rèn)為再狹窄可能與大隱靜脈在游離過程中的損傷、冠狀動脈旁路移植術(shù)后血流動力學(xué)的改變及炎癥因子釋放等一系列原因有關(guān)。熊果酸（ursolic acid，UA）為脂溶性物質(zhì)，可以穿透細(xì)胞膜起效。多年來國內(nèi)外學(xué)者已研究證明熊果酸具有廣泛的生物學(xué)活性，包括抗細(xì)胞突變、抗氧化、抗炎作用[3]。本研究通過建立大鼠靜脈橋再狹窄的動物模型，并予以熊果酸干預(yù)，同時(shí)設(shè)立對照組和模型組，比較術(shù)后48 h靜脈橋單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein，MCP-1）、白細(xì)胞介素-1α（interleukin-1α，IL-1α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等細(xì)胞因子。研究熊果酸抑制血管再狹窄的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級大鼠45只，雌雄不拘，體重300～350 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。熊果酸、MCP-1、IL-1α、IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒購自上海逸術(shù)生物科技有限公司。

1.2 動物分組 將 45只大鼠隨機(jī)分成 A、B、C組，每組各15只。A組為對照組，不做任何處理。B組為模型組，將大鼠右側(cè)頸外靜脈移植至右側(cè)頸總動脈后不予藥物干預(yù)。C組為熊果酸組，將大鼠右側(cè)頸外靜脈移植至右側(cè)頸總動脈，術(shù)后當(dāng)天開始予以 30 mg·kg-1·d-1熊果酸灌胃。

1.3 模型建立 B組和C組大鼠用“套管法”將右側(cè)頸外靜脈移植至右側(cè)頸總動脈建立大鼠自體靜脈再狹窄動物模型。術(shù)后所有大鼠均在SPF級動物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。三組大鼠術(shù)后第1天開始每只肌注青霉素鈉4萬U/d，用至術(shù)后5 d，每只給予阿司匹林10 mg·kg-1·d-1灌胃抗凝。C組術(shù)后當(dāng)天開始予以大鼠30 mg·kg-1·d-1熊果酸灌胃，直至大鼠取出標(biāo)本處死。

1.4 標(biāo)本采集 B、C組分別在術(shù)后48 h處死15只大鼠切取移植靜脈，A組取右側(cè)頸外靜脈，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測細(xì)胞因子MCP-1、IL-1α、IL-6及 TNF-α。將測得的樣品中細(xì)胞因子的蛋白含量轉(zhuǎn)化為pg/mg血管組織。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用±s表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。取α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

B、C組分別在術(shù)后48 h處死15只大鼠切取移植靜脈，A組取右側(cè)頸外靜脈，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞因子MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α。各細(xì)胞因子比較見表1。B組和C組細(xì)胞因子均較A組顯著增高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在術(shù)后應(yīng)用熊果酸組治療的C組較未予熊果酸干預(yù)的B組顯著降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 術(shù)后48 h靜脈橋細(xì)胞因子水平比較（±s，pg/mg）

表1 術(shù)后48 h靜脈橋細(xì)胞因子水平比較（±s，pg/mg）

注：MCP-1：靜脈橋單核細(xì)胞趨化蛋白-1；IL-1α：白細(xì)胞介素-1α；IL-6：白細(xì)胞介素-6；TNF-α：腫瘤壞死因子-α。與 A 組相比，aP＜0.05；與 B組相比，bP＜0.05

?

3 討論

冠狀動脈旁路移植術(shù)（CABG）是治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的最主要外科方法之一。乳內(nèi)動脈和大隱靜脈是最常采用的橋血管。隨訪資料顯示，冠狀動脈旁路移植術(shù)中乳內(nèi)動脈吻合前降支，1年通暢率達(dá)95.7%，10年通暢率在90.0%以上[1]，明顯優(yōu)于大隱靜脈。研究表明，大隱靜脈1年內(nèi)可能發(fā)生靜脈吻合口血栓形成、近端狹窄等并發(fā)癥，1年、5年的通暢率分別為93%、74%，10年通暢率僅為50%～60%[2]，遠(yuǎn)期效果明顯不如乳內(nèi)動脈。靜脈橋的再狹窄大大降低了手術(shù)的遠(yuǎn)期效果[4]，經(jīng)過多年的研究對于再狹窄的發(fā)生機(jī)制仍有許多不明之處。目前認(rèn)為再狹窄可能與大隱靜脈在游離過程中的損傷、冠狀動脈旁路移植術(shù)后血流動力學(xué)的改變及炎癥因子釋放等一系列變化，術(shù)后新生內(nèi)膜細(xì)胞增生、血管平滑肌增殖與遷移所導(dǎo)致血管重塑所共同作用的結(jié)果[5]。

熊果酸又名烏索酸、烏蘇酸，是廣泛存在于自然界中的α-香樹脂醇型五環(huán)三萜類化合物，通常以游離形式存在，或與糖結(jié)合成苷的形式存在，廣泛分布于自然界約7個科46個屬62種植物中[6]。熊果酸為脂溶性物質(zhì)，可以穿透細(xì)胞膜起效，多年來國內(nèi)外學(xué)者已研究證明熊果酸具有廣泛的生物學(xué)活性，包括抗細(xì)胞突變、抗氧化、抗炎等作用[3]。一直以來熊果酸抗腫瘤機(jī)制都是研究的熱點(diǎn)。研究表明，熊果酸對NF-κB活化的抑制作用與NF-κB依賴性周期蛋白D1、環(huán)氧合酶和基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)受抑制有關(guān)。這些作用可能是熊果酸抗腫瘤和化療增敏作用的機(jī)制[7]。同時(shí)，熊果酸對心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用也已被廣泛證實(shí)[8]。跟心血管相關(guān)的生物學(xué)活性包括舒張血管[9]、上調(diào)一氧化氮合酶[10]及抑制脂質(zhì)過氧化[11]等。NF-κB參與調(diào)控細(xì)胞的眾多生理及病理過程，是介導(dǎo)炎癥及病理免疫反應(yīng)過程的中心物質(zhì)。NF-κB幾乎存在于所有的細(xì)胞中，在細(xì)胞凋亡的過程中是最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一。在免疫反應(yīng)過程中各種免疫相關(guān)受體、炎癥因子（MIP-1α、MCP1）、細(xì)胞因子（如 IL-1、IL-2、IL-6、IL-12 和 TNF-α、LTα、LTβ、GM-CSF）、黏附分子（ICAM、VCAM、E-selectin）及急性期蛋白（如SSA）等均為其靶基因。NF-κB的激活介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)的整個過程。NF-κB可以在炎癥反應(yīng)過程中促進(jìn)各種炎癥因子和細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄，與此同時(shí)，這些炎癥因子和細(xì)胞因子又可反過來激活NF-κB，這種正反饋的效應(yīng)進(jìn)一步放大了炎癥反應(yīng)，對血管平滑肌細(xì)胞增生、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響而在再狹窄的過程中起著重要的作用。抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可為靜脈橋再狹窄防治提供新的治療靶點(diǎn)。

本研究中術(shù)后48 h對三組靜脈MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α的ELISA檢測顯示，將頸外靜脈移植至頸總動脈后，局部組織MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α明顯增加。使用熊果酸的C組較未用熊果酸的B組MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α明顯降低。實(shí)驗(yàn)表明，頸外靜脈移植至頸總動脈后局部會產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，熊果酸能抑制靜脈橋血管的炎癥反應(yīng)，這也是熊果酸防治靜脈再狹窄的藥物機(jī)制之一。

總之，熊果酸可能通過抑制炎癥反應(yīng)的中心物質(zhì) NF-κB 的活化，進(jìn)而抑制 MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α的表達(dá)。熊果酸可以抑制術(shù)后靜脈橋血管的再狹窄。

［1］Lawrie GM，Morris GC Jr，Earle N.Long-term results of coronary artery bypass surgery：Analysis of 1698 Patients followed 15 to 20 years.Ann Surg，1991，213：337-385.

［2］Small GR，Yam V，Chen L，et al.Progonstic assessment of coronary artery bypass patients with 64-slice computed tomography anatomical information is incremental to clinical risk prediction.J Am Coll Cardiol，2011，58：2389-2395.

［3］Dai Z，Nair V，Khan M，et al.Pomegranate extract inhibits the proliferation and viability of MMTV-Wnt-1 mouse mammary cancer stem cells in vitro.Oncol Rep，2010，24：1087-1091.

［4］Harskamp RE，Lopes RD，Baisden CE，et al.Saphenous vein graft failure after coronary artery bypass surgery：pathophysiology，management，and future directions.Ann Surg，2013，257：824-833.

［5］He XP，Li XX，Bi YW，et al.The proteasome inhibitor bortezomib inhibit intimal hyperplasia of autologous vein grafting in rat model.Transplantation Proceedings，2008，40：1722-1726.

［6］Ramachandran S，Prasad NR.Effect of ursolic acid，a triterpenoid antioxidant，on ultraviolet-B radiation-induced cytotoxicity，lipid peroxidation and DNA damage in human lymphocytes.Chem Biol Interact，2008，176：99-107.

［7］Shishodia S，Majumdar S，Banerjee S，et al.Ursolic acid inhibits nuclear factor-kappaB activation induced by carcinogenic agents through suppression of IkappaBalpha kinase and p65 phosphorylation：correlation with down-regulation of cyclooxygenase2，matrix metalloproteinase 9,and cyclin D1.Cancer Res，2003，63：4375.

［8］Liu J.Oleanolic acid and ursolic acid：Research perspectives.J Ethnopharmacol，2005，100：92-94.

［9］Sen R，Baltimore D.Multiple nuclear factors interact with the immune-globulin enhancer sequences.Cell，1986，46：705-716.

［10］Silverman N，ManiatisT.NF-κB signaling pathway in mammalian and insect innate immunity.Genes Dev，2001，15：2321-2342.

［11］Baeuerle PA，Henkel T.Function and activation of NF-kappa B in the immune system.Annu Rev Immunol，1994，12：141-179.

Study the effects of Ursolic acid on inhibition of inflammation in the autologous vein graft restenosis rat model

LIU Sheng-hua＊，LIU Xiao-li，LI Bin，et al.＊Department of Cardiac Surgery，Guangdong Provincial Corps Hospital of Chinese People′s Armed Police Forces，Guangzhou 510000，China

Objective To study the effects of Ursolic acid on inhibition of inflammation and the mechanism in the autologous vein graft restenosis rat model.Methods 45 rats，300-350 kg were randomly divided into 3 groups:group A，B，C.The right external jugular veins were implanted into the right carotid with cuff technique for rats of group B and group C.Ursolic acid 30 mg/kg was administrated daily in rats of group C via gavage.Samples of veins tissues were harvested at 48 hours.MCP-1，IL-1α，IL-6 and TNF-α were test by ELISA.Results MCP-1［Group A（655.5±47.4）pg/mg，Group B（7959.7±823.5）pg/mg，Group C（4339.0±578.8）pg/mg］，IL-1α［Group A（496.8±46.2）pg/mg，Group B （4015.6±427.1）pg/mg，Group C（2838.5±298.9）pg/mg］，IL-6［Group A（664.4±63.5）pg/mg，Group B（2414.8±155.1）pg/mg，Group C（1325.8±56.4）pg/mg］，TNF-α［Group A（149.5±7.8）pg/mg，Group B（546.0±72.6）pg/mg，Group C（286.2±18.6）pg/mg］.MCP-1，IL-1α，IL-6 and TNF-α of group B and group C were significantly higher than group A.MCP-1，IL-1α，IL-6 and TNF-α of group C were significantly reduced than group B.Conclusion The mechanism of the effect of ursolic acid is through inhibition of NF-κB activation，and then inhibit the expression of MCP-1，IL-1α，IL-6 and TNF-α.It can effectively inhibit the restenosis of vein graft that ursolic acid be early administrated after operation.

Coronary artery bypass graft；Restenosis；Ursolic acid

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：A2015433）

510000 廣東省廣州市，武警廣東省總隊(duì)醫(yī)院心外科（劉盛華、李彬、鄒增曉）；廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院新生兒科（劉小利）

10.3969/j.issn.1672－5301.2016.08.021

Q95-33；R541.4

A

1672-5301（2016）08-0755-03

2016-03-17）