崔云風(fēng),石斌超,李　晶,趙志軍,史吉平,張　霞,*

(1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆石河子 832000;2.中國科學(xué)院上海高等研究院,上海 201210)

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大腸桿菌絲氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)單基因敲除對絲氨酸生產(chǎn)的影響

崔云風(fēng)1,石斌超1,李晶2,趙志軍2,史吉平2,張霞1,*

(1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆石河子 832000;2.中國科學(xué)院上海高等研究院,上海 201210)

氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)改造是一種重要的氨基酸菌種選育方式。sdaC,cycA,sstT和tdcC是目前報道的大腸桿菌中與L-絲氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)吸收相關(guān)的四個基因,本研究以實驗室前期構(gòu)建的L-絲氨酸工程菌SWCH-05為基礎(chǔ),采用Red重組系統(tǒng),分別構(gòu)建了sdaC,cycA,sstT和tdcC單基因敲除菌,并通過補(bǔ)料分批發(fā)酵實驗考察了轉(zhuǎn)運(yùn)吸收基因缺失對菌株產(chǎn)L-絲氨酸的影響。發(fā)酵結(jié)果表明,sdaC敲除菌L-絲氨酸產(chǎn)量達(dá)到了16.3 g/L,與出發(fā)菌株相比提高了43%,cycA敲除菌L-絲氨酸產(chǎn)量為14.1 g/L,與出發(fā)菌株相比提高了25%,而sstT和tdcC基因敲除菌的L-絲氨酸產(chǎn)量均與對照菌相近。

轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),L-絲氨酸,大腸桿菌,基因敲除

目前,L-絲氨酸(L-serine,L-Ser)已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、飼料、醫(yī)藥等行業(yè)[1-2]。發(fā)酵法生產(chǎn)L-Ser具有原料廉價、易提取等優(yōu)點(diǎn),其代謝工程育種研究獲得了廣泛關(guān)注[3-5]。

氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)改造是新發(fā)展起來的一種氨基酸育種方式,其通過提高胞內(nèi)目的氨基酸的分泌速率或者降低胞外目的氨基酸的吸收速率,可以提高菌株的氨基酸生產(chǎn)強(qiáng)度;還可以使胞內(nèi)目的氨基酸的濃度一直保持在較低水平,進(jìn)而減弱或規(guī)避各種復(fù)雜的反饋調(diào)控作用,促進(jìn)氨基酸的合成。近年來,關(guān)于蘇氨酸、賴氨酸和丙氨酸等氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的研究結(jié)果表明,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)改造已經(jīng)成為了氨基酸代謝工程策略的一種重要手段[6-10]。

目前L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的研究仍處于生化與分子鑒定的階段,但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)個與L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白,如:轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SdaC被認(rèn)為是專一性調(diào)控L-Ser的吸收[11-12],轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CycA同時參與調(diào)控細(xì)胞對L-Ala、L-Gly和L-Ser的吸收[13];轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SstT同時調(diào)控L-Thr和L-Ser的吸收[14];而透酶TdcC主要負(fù)責(zé)L-Thr的吸收,但在厭氧條件下也參與L-Ser的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)[15-16]。此外,對于L-Ser的分泌轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),目前僅研究發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)L-Thr分泌的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ThrE同時也參與調(diào)控L-Ser的分泌[17]。

本研究以實驗室前期構(gòu)建的L-Ser基因工程菌SWCH-05為出發(fā)菌株,利用Red重組技術(shù)分別構(gòu)建了L-Ser吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因sdaC,cycA,sstT和tdcC的單基因敲除菌,并通過發(fā)酵實驗考察了L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因敲除對菌體生長及L-Ser生產(chǎn)的影響。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株SWCH-01是大腸桿菌模式菌株E.coliW3110的sdaA基因敲除菌;菌株SWCH-05是實驗室前期誘變篩選獲得的一株E.coliSWCH-01衍生菌株;質(zhì)粒pSC-05是攜帶抗反饋調(diào)節(jié)基因serAfbr(feedback inhibition-resistant)和其它3個大腸桿菌絲氨酸合成途徑關(guān)鍵酶基因serB、serC和pgk的低拷貝,具有PR和PL雙啟動子的原核表達(dá)質(zhì)粒;SWCH-05/pSC-05由實驗室前期通過基因工程手段構(gòu)建(數(shù)據(jù)另文發(fā)表)。敲除所需的工具質(zhì)粒pKD13,pKD46和pCP20購自美國耶魯大學(xué)大腸桿菌菌株庫(E.coliGenetic Stock Center,New Haven,USA)[17]，本研究所用到的菌株和質(zhì)粒具體見表1；>Primer STAR HS DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶(Mix)均購自大連寶生物有限公司;DNA Ladder Mix購自Fementas公司;氨芐青霉素、硫酸卡那霉素購自上海捷倍思基因技術(shù)有限公司;質(zhì)粒小量制備試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒、PCR清潔試劑盒購自AxyPrep公司;L-Ser標(biāo)準(zhǔn)品、異硫氰酸苯酯購自Sigma公司;其他化學(xué)試劑購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;常規(guī)試劑采用國產(chǎn)分析純;引物合成和測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

Gel Dox XR+凝膠成像系統(tǒng)、S1000PCR儀、電轉(zhuǎn)儀MicroPulser美國BIO-RAD公司;DU730型紫外分光光度計德國Beckman公司;ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智城儀器制造有限公司;Centrifuge5430低溫離心機(jī)德國Eppendorf公司;MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋日本三洋公司;高效液相色譜儀RID-10A/SPD-20A日本島津公司。

表1　實驗用菌株和質(zhì)粒Table 1　Strains and plasmids used in the experiment

1.2實驗方法

1.2.1引物設(shè)計根據(jù)大腸桿菌W3110基因組序列,分別設(shè)計四對敲除引物sdaC _p1和sdaC _p2,cycA _p1和cycA_p2,sstT_p1和sstT_p2,tdcC_p1和tdcC_p2,其中下劃線部分為目標(biāo)基因上下游各50 bp的同源臂序列,以質(zhì)粒pKD13 DNA為模板,分別擴(kuò)增1403 bp目標(biāo)基因打靶DNA片段。選取大腸桿菌W3110基因組中目標(biāo)基因上游和下游的某段DNA序列作為鑒定目標(biāo)基因敲除的引物。引物k1和k2分別為質(zhì)粒pKD13中Kan基因內(nèi)部序列。本研究所用引物的DNA序列如表2所示。

1.2.2大腸桿菌基因的敲除采用Red同源重組的方法分別敲除sdaC,cycA,sstT和tdcC四個基因,具體操作方法參照文獻(xiàn)[19]。

1.2.3培養(yǎng)基的配制種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基:10 g/L Typtone,5 g/L Yeast extract,10 g/L NaCl。發(fā)酵培養(yǎng)基組分包括:3 g/L MgSO4·7H2O,0.017 g/L CaCl2·2H2O,8 g/L葡萄糖和3 g/L KH2PO4,1 g/L NaCl,5 g/L(NH4)2SO4,0.07 g/L FeSO4·7H2O,0.11 g/L檸檬酸鈉,0.2 g/L酵母膏,1.5 mL/L微量元素液1000×母液(7 g/L CoCl2·6H2O,2.5 g/L CuSO4·5H2O,25 g/L H3BO,16 g/L MnCl2·4H2O,1.5 g/L Na2MoO4·2H2O,3 g/L ZnSO4·7H2O)。

1.2.4發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng):挑取單菌落至裝有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,30 ℃,200 r/min培養(yǎng)8～10 h。發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng):以10%(v/v)的比例轉(zhuǎn)接種子培養(yǎng)液至裝有2.5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)基中發(fā)酵。發(fā)酵初始溫度為35 ℃,當(dāng)菌體生長至對數(shù)生長期前期時,升溫至38 ℃開始誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)L-Ser。當(dāng)發(fā)酵液中初始葡糖糖基本耗盡時,開始流加600 g/L的葡萄糖溶液,并調(diào)控流速使發(fā)酵液中的葡萄糖濃度小于5 g/L。發(fā)酵過程中,通過流加濃氨水使培養(yǎng)基pH保持在pH6.8～7.0。

表2　本研究使用的引物Table 2　Primers used in the experiment

注:下劃線部分為目標(biāo)基因上下游各50 bp的同源臂序列。

1.2.5測定方法發(fā)酵液中的菌體密度以600 nm波長下分光光度計檢測的吸光值OD600 nm表示,細(xì)胞干重根據(jù)前期構(gòu)建的經(jīng)驗公式獲得(1OD=0.492 g/L CDW)。

發(fā)酵液中的葡萄糖濃度采用高效液相色譜測定[20]。

本研究采用高效液相色譜異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生法檢測發(fā)酵液中L-絲氨酸的含量,具體衍生方法參照文獻(xiàn)[21]。

分析條件:發(fā)酵液中的L-Ser濃度通過島津LC-20A測定。采用的色譜柱為:Agilent Extend C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱。流動相為:(A)0.05 mol/L乙酸鈉(pH為6.50±0.05)和(B)甲醇∶乙腈∶水(20∶60∶20),流速為1 mL/min。梯度洗脫程序為:0～12 min,流動相(B)濃度保持7%;12～13 min流動相(B)濃度由7%升至100%;流動相(B)濃度保持100%至18 min,18～19 min流動相(B)濃度由100%降至7%,19～25 min流動相(B)濃度保持7%,回到初始條件。使用紫外檢測器檢測標(biāo)樣及樣品中L-Ser在254 nm的吸收峰值,進(jìn)樣體積10 μL,柱溫45 ℃。

1.2.6數(shù)據(jù)處理方法每個實驗重復(fù)三次,實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性分析,采用Origin 7.0軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1sdaC,cycA,sstT,tdcC單基因敲除菌的構(gòu)建

將E.coliSWCH-05作為研究對象,在其基因組上分別敲除L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)吸收基因sdaC,cycA,sstT和tdcC。以質(zhì)粒pKD13 DNA為模板,通過引物sdaC_p1和sdaC_p2擴(kuò)增得到打靶PCR片段sdaCD50-Kan-sdaCD50,將PCR片段轉(zhuǎn)化至E.coliSWCH-05/pKD46的感受態(tài)細(xì)胞中,同源重組后在Kan抗性平板上初步篩選基因sdaC的敲除突變株。分別通過兩對引物sdaC_v1和k1,k2和sdaC_v2對sdaC敲除突變菌進(jìn)行菌落PCR鑒定。依據(jù)敲除原理,當(dāng)sdaC基因敲除后,其基因組經(jīng)PCR擴(kuò)增后可分別獲得1218 bp和1299 bp的PCR片段。DNA凝膠電泳的結(jié)果與理論值大小相符,表明基因sdaC已經(jīng)被Kan基因所置換(圖1a,泳道1～2)?；騝ycA,sstT和tdcC的敲除方法與sdaC類同,分別通過其相應(yīng)的兩對鑒定引物進(jìn)行菌落PCR鑒定后,發(fā)現(xiàn)其各自DNA凝膠電泳的結(jié)果與理論值大小相符,表明基因cycA,sstT和tdcC已分別被Kan基因所置換(圖1b,c,d的泳道1～2)。

圖1　大腸桿菌sdaC、cycA、sstT、tdcC基因敲除的PCR分析Fig.1　Identification of the sdaC,cycA, sstT,tdcC knockout strain by PCR 注:M:Marker;(a)Lane 1:sdaC_v1→k1;Lane 2:k2→sdaC_v2;Lane3:sdaC_v1→sdaC_v2;(b)Lane 1:cycA_v1→k1;Lane2:k2→cycA_v2;Lane3:cycA_v1→cycA_v2;(c)Lane1:sstT_v1→k1;Lane2:k2→sstT_v2;Lane3:sstT_v1→sstT_v2;(d)Lane1:tdcC_v1→k1;Lane 2:k2→tdcC_v2;Lane3:tdcC_v1→tdcC_v2。

將質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)化至sdaC基因被Kan置換的菌株中,誘導(dǎo)FLP重組酶表達(dá),消除其Kan抗性基因,利用引物sdaC_v1和sdaC_v2進(jìn)行菌落PCR根據(jù)序列分析,Kan基因消除后,PCR擴(kuò)增應(yīng)獲得1406 bp的DNA片段。DNA凝膠電泳的結(jié)果與理論值相符(圖1a,泳道3)。將PCR片段膠回收后連接至 pMD19-T載體后送測序,測序結(jié)果表明sdaC基因敲除正確,命名sdaC敲除菌為SWCH-51。利用同樣的方法消除cycA,sstT和tdcC三個基因敲除菌中的Kan抗性基因,菌落PCR鑒定后,DNA凝膠電泳的結(jié)果與理論值大小相符(圖1b,c,d的泳道3)。經(jīng)測序證明cycA,sstT和tdcC基因敲除均正確,分別命名三個基因敲除菌為SWCH-52、SWCH-53、SWCH-54。

2.2L-絲氨酸基因工程菌的構(gòu)建

將攜帶L-絲氨酸合成途徑關(guān)鍵酶基因的質(zhì)粒pSC-05分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌L-絲氨酸吸收系統(tǒng)基因敲除菌SWCH-51、SWCH-52、SWCH-53和SWCH-54中構(gòu)建L-絲氨酸基因工程菌SWCH-51/pSC-05、SWCH-52/pSC-05、SWCH-53/pSC-05、SWCH-54/pSC-05。

2.3L-絲氨酸基因工程菌的補(bǔ)料分批發(fā)酵

為了考察L-Ser吸收系統(tǒng)基因敲除對菌體發(fā)酵產(chǎn)L-Ser的影響,在5 L發(fā)酵罐中分別對對照菌SWCH-05/pSC-05及構(gòu)建的基因工程菌SWCH-51/pSC-05、SWCH-52/pSC-05、SWCH-53/pSC-05和SWCH-54/pSC-05進(jìn)行了補(bǔ)料分批發(fā)酵。結(jié)果表明:與對照菌相比(圖2),當(dāng)敲除基因sdaC,sstT或tdcC時,菌體的生長未受到明顯的影響;但當(dāng)敲除基因cycA時,菌體的最高OD600 nm達(dá)到58,與對照菌相比提高了28%,改善了菌體的生長情況(圖3b)。這是因為SdaC、CycA、SstT和TdcC四個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同時控制著L-Ser以及L-Thr和L-Ala等幾種氨基酸的吸收,而氨基酸是菌體組成的基本單位,因此其基因的敲除必然會不同程度地影響菌體的生長。

圖2　菌株SWCH-05/pSC-05的補(bǔ)料分批發(fā)酵Fig.2　Fed-batch fermentation of E. coli SWCH-05/pSC-05

在L-Ser生產(chǎn)方面,當(dāng)敲除sstT或tdcC時,菌株發(fā)酵的L-Ser產(chǎn)量分別為12.2 g/L 和11.6 g/L,與對照菌11.3 g/L 相近;當(dāng)敲除基因cycA時,L-Ser產(chǎn)量為14.1 g/L,與對照菌相比提高了25%;當(dāng)敲除基因sdaC時,L-Ser產(chǎn)量提高至16.3 g/L,與對照菌相比提高了43%(圖3a)。這可能是由于SdaC專一性調(diào)控L-Ser吸收,而其他三個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同時調(diào)控著2～3種氨基酸的吸收,因此sdaC基因的敲除對菌株產(chǎn)L-Ser的影響更大。

圖3　菌株 BJ-02/pSC-05的補(bǔ)料分批發(fā)酵 Fig.3　Fed-batch fermentation of E. coli SWCH-51/pSC-05(a)、SWCH-52/pSC-05(b)、 SWCH-53/pSC-05(c)、SWCH-54 pSC-05(d)

3　結(jié)論

本文首次考察了與L-Ser吸收相關(guān)的4個基因sdaC,cycA,sstT和tdcC的缺失突變對菌株發(fā)酵產(chǎn)L-Ser的影響。結(jié)果表明sdaC的敲除可以明顯促進(jìn)菌體積累L-Ser;cycA的敲除對菌體積累L-Ser的影響次之;而其它兩個基因的敲除對L-Ser的產(chǎn)量基本沒有影響。這為進(jìn)一步考察L-Ser吸收轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的多基因缺失突變對菌體積累L-Ser的影響奠定了基礎(chǔ)。

本研究初步考察L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因敲除對菌株積累L-Ser的影響,未來仍可從以下幾個方面進(jìn)行深入的研究:a.L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)基因的鑒定。本研究涉及的sdaC等四個基因主要是依據(jù)其生理生化特征發(fā)現(xiàn)與L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān),仍缺乏分子層次上的鑒定;此外仍需探索是否存在其它尚未鑒定的L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因。b.L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)作用機(jī)制的研究。有些L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)蛋白同時調(diào)控幾個氨基酸的吸收或分泌,作為菌體細(xì)胞基本單位的氨基酸必然會影響菌體的正常生理代謝活動,這種情況下除考察其對L-Ser積累的影響外,還應(yīng)該考察其對其它氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,進(jìn)而探究菌體生理代謝活動的變化機(jī)制。c.L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白間的協(xié)同效應(yīng)。本研究考察了sdaC等四個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的單基因缺失對菌株積累L-Ser的影響,仍可以通過構(gòu)建其多基因敲除菌考察上述四個基因之間的協(xié)同效應(yīng)。

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Effect of single-gene knockout of L-serine transport system on L-serine production inEscherichiacoli

CUI Yun-feng1,SHI Bin-chao1,LI Jing2,ZHAO Zhi-jun2,SHI Ji-ping2,ZHANG Xia1,*

(1.College of Life Science,Shihezi University,Shihezi 832000,China;2.Shanghai Advanced Research Institute of Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China)

Transport system modification is an important method in strain improvement. It has been reported that the uptake of L-serine was regulated by four genes ofsdaC,cycA,sstTandtdcCinEscherichiacoli. In this study,the four single-gene knockout mutant strains ofsdaC,cycA,sstTand tdcC were constructed,respectively. The fermentation results showed that thesdaCandcycAknockout mutants produced 16.3 g/L and 14.1 g/L L-serine,respectively,which were 43% and 25% higher than that of the control strain. However,the production ofsstTandtdcCmutants were both similar to the control strain.

transport system;L-serine;Escherichiacoli;gene knockout

2016-01-04

崔云風(fēng)(1989-),男,碩士研究生,研究方向:氨基酸代謝工程,E-mial:cyfsdau@163.com。

張霞(1964-),女,教授,研究方向:植物資源與遺傳,E-mail:xiazh@shzu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(31300048)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)14-0191-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.030