譚　夢,華家才,馮鳳琴,2,3

(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058;2.馥莉食品研究院,浙江杭州 310058;3.浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310058)

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牛乳過敏原及加工技術(shù)對其致敏性的影響

譚夢1,華家才1,馮鳳琴1,2,3

(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058;2.馥莉食品研究院,浙江杭州 310058;3.浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310058)

對嬰幼兒來說,牛乳營養(yǎng)豐富,是母乳最好的替代品,但牛乳中的蛋白質(zhì)可能會引起過敏。牛乳中的主要過敏原是酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。本文從牛乳過敏原的結(jié)構(gòu)和抗原表位、熱處理、發(fā)酵和酶處理等不同的加工技術(shù)對牛乳蛋白致敏性的影響和過敏原標(biāo)記檢測方法三個方面進(jìn)行了綜述,為開發(fā)低致敏牛乳制品提供借鑒。

牛乳過敏原,加工技術(shù),檢測

食物過敏是各國政府和公眾廣泛關(guān)注的食品安全問題之一。據(jù)統(tǒng)計,全球有2.2～2.5億人對食物過敏[1]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織劃定,牛奶、雞蛋、魚、甲殼動物或者貝類、花生、大豆、堅(jiān)果和小麥為最常見的八類過敏食物[2]。牛乳含有3.3%～3.5%的蛋白質(zhì),營養(yǎng)豐富,是母乳最好的替代品,但牛乳中的蛋白質(zhì)可能會引起過敏反應(yīng)。對嬰幼兒來說,牛乳過敏是最常見的過敏疾病,發(fā)病率高達(dá)2%～7.5%[3]。牛乳過敏嚴(yán)重影響了嬰幼兒的生長發(fā)育,甚至威脅其生命。因此,系統(tǒng)研究牛乳過敏原種類、結(jié)構(gòu),尋求減輕牛乳過敏的新技術(shù)和過敏原的標(biāo)記檢測方法,對我國開發(fā)低致敏牛乳制品具有深遠(yuǎn)的理論和實(shí)踐意義。

1　牛乳過敏原蛋白的組成和特征

牛乳過敏是牛乳過敏原蛋白所引發(fā)的食物不良反應(yīng),主要是IgE介導(dǎo)的由免疫機(jī)制調(diào)節(jié)的變態(tài)反應(yīng)。牛乳和人乳在蛋白組成上存在一定差異(見表1),牛乳含有人乳中并不存在的α-酪蛋白及β-乳球蛋白,其次α-乳白蛋白和免疫球蛋白的含量也較少,這導(dǎo)致嬰幼兒配方奶粉中需要脫除某些蛋白或者調(diào)整不同蛋白比例以模擬人乳組成。

研究表明,牛乳中最主要的過敏原是酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白[5]。這些蛋白都含有可以被免疫系統(tǒng)識別的抗原表位,包括構(gòu)象表位和線性表位。構(gòu)象表位的活性依賴于構(gòu)象,線性表位則是依賴于氨基酸序列的一級結(jié)構(gòu)。目前,已有很多學(xué)者通過化學(xué)法或酶法切割、肽文庫技術(shù)和肽掃描技術(shù)進(jìn)行了過敏原表位定位(見表2)。酪蛋白是牛乳中最主要的蛋白質(zhì),占總蛋白的80%左右,分為αS1-,αS2-,β-,κ-酪蛋白,大部分對酪蛋白過敏的患者對這四種酪蛋白均過敏。大部分酪蛋白以膠束形式存在,具有柔性和熱穩(wěn)定性。β-乳球蛋白占總蛋白的10%,不存在于人乳中,由于其耐胃酸和胃蛋白酶消化,因此可通過腸道進(jìn)入血液循環(huán),約有82%的牛乳過敏患者對β-乳球蛋白過敏。牛乳α-乳白蛋白與人乳α-乳白蛋白有74%的氨基酸同源,但是仍是一種主要過敏原,這說明其致敏性可能主要依賴于構(gòu)象表位。

表1　牛乳和人乳的蛋白組成[4]Table 1　The main composition of cow’s milk and human milk[4]

表2　牛乳中主要過敏蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征[6-8]Table 2　The characteristics and structure of major allergens in cow’s milk[6-8]

2　加工技術(shù)對牛乳致敏性的影響

牛乳及其制品需通過一定的加工處理,以確保其微生物安全性,提高風(fēng)味和質(zhì)地,雖然充分了解過敏原的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有助于研究其致敏性,但在食品加工過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化,繼而引起其致敏性強(qiáng)弱改變,故研究加工技術(shù)對其致敏性的影響更具現(xiàn)實(shí)意義和指導(dǎo)作用。

2.1熱處理

熱處理是牛乳及其制品加工保藏過程最常用的方法。針對牛乳常見的熱處理方式為高溫短時巴氏殺菌和超高溫瞬時殺菌,不同的熱處理方式對于牛乳蛋白致敏性影響不盡相同,加熱可以誘導(dǎo)過敏原蛋白構(gòu)象發(fā)生變化,一方面可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活聚集,掩蔽抗原表位,降低致敏性;另一方面,可能會引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)舒展開來,使得內(nèi)部掩蓋的抗原表位暴露,增強(qiáng)其致敏性。這取決于處理方法的強(qiáng)弱和不同蛋白的熱敏性強(qiáng)弱。Rytk?nen等[9]發(fā)現(xiàn),在大鼠中的胃腸道粘膜反應(yīng)上,熱變性β-乳球蛋白(90 ℃ 30 min)較不經(jīng)熱處理組會誘發(fā)更密集的免疫反應(yīng)。Bu[10]等在不同溫度條件下分別加熱乳清分離蛋白20 min后,測定其抗原性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)加熱溫度為50～90 ℃時,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性增加,但是當(dāng)溫度高于90 ℃時,兩種蛋白質(zhì)的抗原性均顯著下降。Mehr[11]等研究了完全避免攝入牛乳的過敏患者對強(qiáng)加熱牛乳的口服耐受性,參與實(shí)驗(yàn)的70名兒童中有51名(73%)兒童可以忍受強(qiáng)加熱的牛乳,19名(27%)出現(xiàn)了不同程度的反應(yīng)。

熱處理時,乳蛋白除了自身結(jié)構(gòu)會舒展或相互聚集外,還會和牛乳制品中的還原糖(如乳糖)發(fā)生美拉德反應(yīng)。美拉德反應(yīng)使得牛乳蛋白的α或ε-氨基與還原糖中的羰基以共價鍵相連,形成蛋白質(zhì)-糖共價復(fù)合物,這不僅可以改善蛋白質(zhì)的功能特性,如乳化性、溶解性、起泡性、成膜性等,而且被引入糖分子的空間位阻和電荷作用可以修飾蛋白的抗原表位,降低其致敏性。Wu等人[12]研究了β-乳球蛋白與低聚果糖,低聚半乳糖和低聚異麥芽糖的美拉德反應(yīng),通過ELISA法分析反應(yīng)前后β-乳球蛋白與IgE和IgG結(jié)合能力發(fā)現(xiàn),β-乳球蛋白與這些功能性低聚糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物均能顯著降低其抗原性。Enomoto等[13]利用干熱法,將麥芽五糖結(jié)合到α-乳白蛋白上降低了其抗原性。美拉德反應(yīng)降低牛乳致敏性與反應(yīng)條件和反應(yīng)程度有關(guān)。乳清分離蛋白與葡萄糖的美拉德反應(yīng)結(jié)果顯示,不同的反應(yīng)底物質(zhì)量比(0.17～7.83)、溫度(40～60 ℃)和時間(24～120 h)條件下,β-乳球蛋白的抗原性下降從42%～96%不等[14]。值得注意的是,美拉德反應(yīng)容易造成堿性氨基酸的損失,副產(chǎn)物丙烯酰胺等也會對人體健康產(chǎn)生不利影響[15],用于低敏性嬰幼兒奶粉中需考慮其營養(yǎng)性和安全性。

表3　降低牛乳致敏性的發(fā)酵菌種Table 3　The strains which can reduce cow’s milk allergenicity

熱處理改變牛乳致敏性受很多因素如牛乳組成、加工條件和消費(fèi)者個體差異等的影響,開發(fā)低過敏性乳制品,需要控制熱處理?xiàng)l件,避免引起抗原性增強(qiáng)的情況發(fā)生。

2.2發(fā)酵

在食品工業(yè)中,發(fā)酵是一種傳統(tǒng)的加工技術(shù)。發(fā)酵的牛乳制品除了具有生物活性、減少腸道致病菌的功能外,還能調(diào)節(jié)免疫力,減少過敏癥狀。牛乳經(jīng)過發(fā)酵后,其抗原性會大大降低,其原因可能有兩種,一是乳酸菌具有復(fù)雜的蛋白酶系,發(fā)酵過程中產(chǎn)生的蛋白酶、肽酶使得牛乳蛋白分解成肽和氨基酸,破壞了一些抗原表位,從而降低其致敏性,二是乳酸菌本身具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用,能促進(jìn)I型和II型干擾素的產(chǎn)生,降低炎癥性細(xì)胞因子IL-4 和IL-5的分泌[16],從而起到降低過敏的效果。

1999年,Wroblewska[17]對滅菌乳采用嗜溫和嗜熱乳酸菌發(fā)酵,凝乳后用兔多克隆抗體間接競爭ELISA法測定上清液中乳清蛋白的殘余抗原性,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后乳清蛋白的抗原性比生牛乳降低了99%以上。在此之后,眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵可以有效降低α-乳白蛋白,β-乳球蛋白,酪蛋白的抗原性(見表3),且不同乳酸菌混合發(fā)酵具有協(xié)同效果[18]。然而,發(fā)酵過程中牛乳蛋白抗原性的變化取決于發(fā)酵菌種和條件,Ehn等[19]研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌發(fā)酵牛乳后,雖然色譜顯示降解了β-乳球蛋白,但并不能顯著降低其IgE的結(jié)合能力,這說明在某些條件下乳酸菌蛋白酶并不能完全破壞過敏蛋白上IgE的結(jié)合表位,或者是使得內(nèi)部表位暴露更易與抗體發(fā)生反應(yīng)。

2.3酶處理

隨著食品酶制劑的快速發(fā)展,蛋白水解酶已經(jīng)廣泛用于處理各類過敏原,降低其致敏性。蛋白酶能夠水解大分子的蛋白質(zhì)生成小分子肽和氨基酸,破壞一些引起過敏反應(yīng)的空間表位和線性表位,使得致敏性降低。目前研究較多的酶主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶等。Prakash等[27]用中性蛋白酶水解酪蛋白,體外間接ELISA結(jié)果顯示,當(dāng)水解度為5%時,抗原性降低了70%～80%。在小鼠模型中發(fā)現(xiàn),飼喂胰蛋白酶乳清蛋白水解物組較完整乳清蛋白組,小鼠血漿中具有顯著低的特異性IgE含量和組胺水平,且IL-4 和IL-5 的分泌量也顯著降低,這說明酶水解可以降低乳清蛋白致敏性[28]。單一種類的酶具有水解位點(diǎn)局限性,多種酶的復(fù)配使用不僅能夠更好的降低牛乳蛋白抗原性,還能減少苦味的生成[29]。酶水解具有條件溫和、高效性、節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn),丹麥Arla和新西蘭Fonterra等公司已開發(fā)出不同程度的水解乳清蛋白產(chǎn)品,為低敏嬰幼兒配方奶粉提供了原料。雖然水解產(chǎn)品抗原性顯著降低,但并不能完全消除。不同的水解模型和水解度可能會導(dǎo)致肽組成和口感上的差異,水解過程中各產(chǎn)物對其致敏性與風(fēng)味的影響機(jī)理,還需要進(jìn)一步的研究。

2.4其他加工技術(shù)

近年來,一些對食品風(fēng)味和營養(yǎng)影響較小的非熱物理加工方法越來越受到重視。高壓、輻照、微波、高強(qiáng)度超聲波等加工方式可能使得蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)展開或者氫鍵斷裂、蛋白聚合、抗原表位掩蓋或者暴露,從而改變牛乳致敏性。Kleber[30]在不同溫度下,用200～600 MPa處理β-乳球蛋白,間接競爭ELISA法測定其抗原性,結(jié)果表明高壓處理增強(qiáng)了β-乳球蛋白的抗原性,可能是非共價鍵的作用力使得蛋白結(jié)構(gòu)展開,更容易與抗體結(jié)合。輻射作為一種殺菌技術(shù),也可改變過敏蛋白的分子結(jié)構(gòu),掩蓋抗原表位,從而降低乳蛋白的過敏性[31]。Lee等[32]發(fā)現(xiàn)了牛乳中α-酪蛋白和β-乳球蛋白經(jīng)γ射線照射后,用過敏患者血清進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn),結(jié)果兩種蛋白抗原性均降低,可能是γ射線照射改變了抗原表位的結(jié)構(gòu)。

3　過敏原的標(biāo)記和檢測

3.1過敏原的標(biāo)記

食物過敏還沒有有效的治療方法。過敏患者需嚴(yán)格規(guī)避含有過敏原的食物和配料。因此,過敏患者選擇食品很大程度上依賴于準(zhǔn)確的過敏原標(biāo)簽和公開的配料信息。一些國家已經(jīng)提出過敏原標(biāo)簽的立法。2004,美國頒布了食物過敏原標(biāo)簽和消費(fèi)者保護(hù)法案,要求除美國農(nóng)業(yè)部管轄的肉制品、禽肉制品和蛋制品外,所有在美國銷售的包裝食品必須標(biāo)明8類過敏食物加工原料。2008年,歐盟要求所有導(dǎo)致過敏或不良反應(yīng)的成分都必須標(biāo)識。我國對食物過敏原的研究和關(guān)注相對落后,2012年4月實(shí)施的《GB 7718-2011 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》對八類致敏食物的標(biāo)簽提出規(guī)范性要求,但屬于推薦標(biāo)示內(nèi)容。該規(guī)定已是我國預(yù)包裝食品標(biāo)簽過敏原標(biāo)識的極大進(jìn)步,推動了食品產(chǎn)品信息向公開化的方向發(fā)展。目前絕大多數(shù)規(guī)定只適用于原配料有意添加的情況,并未定義過敏原的閾值,也未對食品行業(yè)如何針對過敏原交叉反應(yīng)提供指導(dǎo)建議。

3.2過敏原的檢測

高效、準(zhǔn)確的檢測過敏原含量是保證過敏原標(biāo)簽標(biāo)示制度順利實(shí)施的條件之一。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)[2]因其靈敏度高、快速方便且不需要昂貴的儀器等優(yōu)點(diǎn),是多個國家推薦的過敏原檢測方法,常用于食品安全和臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域,可以定性和定量分析過敏原。鄧小芳[33]自制相應(yīng)的單克隆抗體及多克隆抗體牛奶過敏原的雙抗體夾心ELISA檢測方法,酪蛋白檢測限可以達(dá)到0.55 ng/mL。隨著試劑生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展,檢測食物過敏原的商業(yè)試劑盒應(yīng)運(yùn)而生,極大的方便了過敏原的定量檢測。2008年3月實(shí)施的《中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1961.1-2007》中將ELISA法運(yùn)用于花生過敏成分的檢測上。但是,關(guān)于牛乳過敏原檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)還未出臺。ELISA法的局限性主要是基質(zhì)成分的交叉反應(yīng)性和動物抗體抗原表位無法真正地反映過敏患者抗原表位,且一次只能檢測一種過敏原。在實(shí)際情況下,過敏原種類繁多,再加之交叉污染的存在,如何快速、準(zhǔn)確、高通量地檢測出食物中的過敏原成為該領(lǐng)域需重點(diǎn)關(guān)注的問題。

4　展望

牛乳營養(yǎng)價值高,是嬰兒的主要食物來源,但是可能會導(dǎo)致嬰幼兒過敏,嚴(yán)重影響了其生長發(fā)育。在中國,治療嬰幼兒過敏患者采用的手段都是暫時的避免牛乳制品的攝入,容易造成嬰幼兒營養(yǎng)不良。因此,開發(fā)低敏性牛乳制品是解決牛乳過敏問題的有效途徑。目前,關(guān)于牛乳過敏原表位方面的研究已經(jīng)取得一些成績,但是酪蛋白的T細(xì)胞表位定位,乳鐵蛋白線性表位定位等尚未解決,需要對其過敏原抗原表位進(jìn)行更為系統(tǒng)的研究,從而為開發(fā)低致敏牛乳制品提供理論依據(jù)。通過控制處理?xiàng)l件,一些加工技術(shù)已經(jīng)可以有效降低牛乳蛋白的致敏性,但是加工過程中可能引起新的抗原表位的暴露,某些加工副產(chǎn)物的安全性需要進(jìn)行評估。另外,大多數(shù)過敏原和殘余抗原性的測定來源于體外ELISA法,需要結(jié)合生物信息學(xué)、免疫血清學(xué)、動物或者細(xì)胞致敏模型的建立等多種手段開展多級評價模式,得到更加全面準(zhǔn)確的結(jié)果。

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Cow’s milk allergen and effects of processing technology on its allergenicity

TAN Meng1,HUA Jia-cai1,FENG Feng-qin1,2,3

(1.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;2.Fuli Institute of Food Science,Hangzhou 310058,China;3.Zhejiang Key Laboratory for Agro-Food Processing,Hangzhou 310058,China)

Cow’s milk has rich nutrition and it is the best substitute for breast milk. However,its protein may cause allergy. The major allergen is casein,β-lactoglobulin andα-lactalbumin. This paper firstly illustrated the structure and epitope of cow’s milk major allergen,and then discussed the effects of milk processing technology including heat treatment,fermentation and enzymatic hydrolysis on its allergenicity,and finally introduced the labeling and detection methods of allergen,which can provide reference for producing hypoallergenic dairy products.

milk allergen;processing technology;detection

2015-06-18

譚夢(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：功能蛋白改性，E-mail：sherrytan0813@163.com。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(2013AA102207-3)。

TS252.1

A

1002-0306(2016)05-0384-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.070