申　靜,孟　雪,那美玲,徐曉麗,張錦勝

(南昌大學,江西南昌 330047)

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基于NMR納米探針的生物傳感器用于快速檢測沙門氏菌

申靜,孟雪,那美玲,徐曉麗,張錦勝*

(南昌大學,江西南昌 330047)

通過將沙門氏菌單抗與羧基磁珠偶聯(lián)制備免疫磁珠,并以此為NMR分子探針,以免疫磁珠為生物傳感器,特異性地捕獲并檢測出樣品中的致病菌,從而建立一種更快的檢測沙門氏菌的方法。實驗將得到的不同樣品溶液放入核磁共振儀中檢測自旋-自旋弛豫時間(T2)值,考察不同條件對T2值的影響。通過實驗發(fā)現(xiàn),免疫磁珠的使用量,緩沖溶液的選擇,捕獲時間的長短都會對樣品T2值產(chǎn)生影響。通過優(yōu)化實驗,分別繪制出不同條件下T2值的曲線變化,并得出最佳捕獲條件。在捕獲緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液PBS(0.01 mol/L,pH7.4),免疫磁珠使用量為50 μg,混勻捕獲時間為1.5 h的條件下,核磁共振儀測得的樣品T2值曲線最佳。其檢測線性范圍為104～107CFU/mL。本研究為沙門氏菌的檢測提供了新的方法和途徑,縮短了檢測時間和工序,并且為低場核磁共振技術(shù)研究應(yīng)用開辟了廣闊的空間。

免疫磁珠,沙門氏菌,核磁共振技術(shù),快速檢測

沙門氏菌(salmonella)是一類廣泛分布于自然界的一種重要的人畜共患、革蘭氏陰性病原菌。各類細菌性食物中毒中,沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。沙門氏菌具有致死率高的特征,為四大食源性致病菌之一,在各類食品標準中該致病菌都不得檢出。目前對于沙門氏菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)檢測方法國標法[1],酶聯(lián)免疫分析法(ELISA),熒光免疫分析法(FIA),免疫磁珠分離技術(shù)(IMS),核酸探針技術(shù),聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)等[2]。上述這些方法都具有各自的優(yōu)缺點,但都少不了對檢測樣品的預(yù)處理,需要對檢測菌進行增菌處理等,這些處理步驟耗時長,總操作步驟至少需要12 h。

核磁共振技術(shù)(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)誕生于20世紀40年代。研究表明,不同組織之間、正常組織和病變組織之間水質(zhì)子的弛豫時間信號存在差異。通過判別弛豫時間之間的差異,從而達到判斷和鑒別。醫(yī)學上研究表明,腫瘤及鄰近的水腫區(qū),由于腫瘤細胞的生長造成組織中結(jié)合水釋放、游離水增加。自由水的分子較小,因而運動頻率要比氫質(zhì)子的共振頻率高得多,這使得它有很長的T2值信號[3],因而在磁共振信號上表現(xiàn)出長T2信號,這也是磁共振疾病早期診斷的理論基礎(chǔ)。在核磁共振成像的超順磁造影劑中,因為納米Fe3O4具有順磁和超順磁特性,能夠顯著影響磁場的凈磁化矢量,因而改變組織的弛豫時間值。其Fe3O4磁性納米粒子表面可連接生化活性功能基團,通過包被修飾特異性抗體使納米磁珠成為免疫磁珠,用于免疫磁分離。磁分離被成功地用于研究副溶血弧菌[4-6],癌胚抗原[7],血吸蟲[8],氯霉素[9],鼠疫桿菌[10],大腸桿菌O157∶H7[11-12],結(jié)核桿菌[13],志賀菌[14]等。

本研究結(jié)合NMR技術(shù)和生物傳感器-免疫磁珠的優(yōu)點,嘗試建立一種基于磁性氧化鐵納米生物傳感器的食源性致病菌的NMR快速檢測方法,其特征是用Fe3O4納米免疫磁珠對其致病菌特征性免疫捕獲,再利用Fe3O4材料的超順磁特性,從核磁共振弛豫信號參數(shù)變化的角度,對比空白樣品的弛豫時間值變化,從而檢測出樣品中的有害致病菌。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

沙門氏菌(菌株編號:ATCC9270,Salmonella)由南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室提供;沙門氏菌單克隆抗體(編號:2C11-F3)由南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室提供;羧基修飾磁珠(PM3-020)上海奧潤微納米材料科技有限公司;1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亞胺鹽鹽酸(EDC·HCl)上海晶純生化科技股份有限公司;N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHSS)上海晶純生化科技股份有限公司;牛血清蛋白(BSA)北京索萊寶科技有限公司;一水嗎啉乙磺酸(MES)北京索萊寶科技有限公司等其他試劑。

磁力架無錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司;1.5TCUTE NMR小型核磁共振儀寧波健信機械有限公司;核磁共振分析儀上海紐邁電子科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1羧基修飾磁珠分析檢測在溫度為25 ℃時,將終濃度為2 mg/mL的羧基磁珠在PBS緩沖液放置，運用激光粒度儀對羧基磁珠PM3-020進行粒徑分析。

1.2.2免疫磁珠的制備活化:稱取磁珠(奧潤 10 mg/mL,180 nm,羧基表面摩爾密度150 nmol/L)1 mg,0.01 mol/L MES(0.01 mol/L,pH6.0)洗滌三次,重懸。加入NHSS 0.325 mg(與磁珠表面羧基密度摩爾比為10∶1),DEC·HCl 0.29 mg(與磁珠表面羧基密度摩爾比為10∶1),置于混勻儀上保持磁珠懸浮,室溫活化1 h。偶聯(lián):磁力架回收磁珠,1 mL 0.01 mol/L PBS(0.01 mol/L,pH7.4)洗滌三次后,磁珠重懸于PBS中,加入160 μg單克隆抗體(抗體/磁珠=80 μg/mg),置于混勻儀上37 ℃偶聯(lián)2 h。封閉:偶聯(lián)后,產(chǎn)物加入終濃度1% BSA室溫封閉45 min。保存:磁力架回收磁珠,PBS洗滌三次,1 mL PBS重懸免疫磁珠至終濃度為1 mg/mL,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3免疫磁珠的最佳捕獲條件優(yōu)化

1.2.3.1捕獲緩沖液分別用以下四種緩沖液:0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)、0.01 mol/L磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST,pH7.4,0.05% Tween-20)、0.01 mol/L一水嗎啉乙磺酸溶液(MES,pH6.0)、0.04 mol/L硼酸鹽溶液(BS,pH9.0)構(gòu)成反應(yīng)體系,用無菌緩沖溶液梯度稀釋菌液,稀釋101、102、103、104、105、106倍。各取1 mL菌體不同稀釋液分別加入到1～6號2 mL離心管中,7號加入無菌溶液,不添加稀釋菌液作為對照組。1～7號離心管中分別加入沙門氏菌單克隆抗體制備的免疫磁珠0.1 mg。每種緩沖液設(shè)置3個平行樣。反應(yīng)溶液置于混勻儀上37 ℃,孵育1.5 h,轉(zhuǎn)速為12 r/min。最后,將捕獲后的溶液取300 μL加入到核磁共振管,進行核磁共振測定T2值,每個樣品測3次。

1.2.3.2捕獲時間分別用以上四種不同的無菌緩沖溶液梯度稀釋菌液6次。各取1 mL菌體不同稀釋液分別加入到1～6號2 mL離心管中,7號加入無菌溶液,不添加稀釋菌液作為對照組。1～7號離心管中分別加入沙門氏菌單克隆抗體制備的免疫磁珠0.1 mg。每種緩沖液設(shè)置3個平行樣。反應(yīng)溶液置于混勻儀上37 ℃,分別孵育0.5、1.0、1.5、2.0 h,轉(zhuǎn)速為12 r/min。最后,將捕獲后的溶液取300 μL加入到核磁共振管,進行核磁共振測定T2值,每個樣品測3次。

1.2.3.3免疫磁珠使用量分別用以上四種不同的無菌緩沖溶液梯度稀釋菌液6次。各取1 mL菌體稀釋液加入到30個2 mL離心管,7個離心管為一組(其中1～6為菌體稀釋樣品,7號為無菌空白對照),共5組。1～5組離心管中分別加入沙門氏菌單克隆抗體制備的免疫磁珠25、40、50、60、100 μg。每個樣品設(shè)置3個平行樣。反應(yīng)溶液置于混勻儀上37 ℃,孵育1.5 h,轉(zhuǎn)速為12 r/min。最后,將捕獲后的溶液取300 μL加入到核磁共振管,進行核磁共振測定T2值,每個樣品測3次。

1.2.4沙門氏菌的微生物計數(shù)取用無菌溶液稀釋106～107倍的含有沙門氏菌的溶液100 μL,LB瓊脂平板計數(shù)檢測,每個樣品重復(fù)檢測三次,所有的平板培養(yǎng)溫度為(37±1) ℃,時間為18～24 h。通過平板計數(shù)法計算菌液的濃度,選擇菌落數(shù)在20～200范圍內(nèi)的進行計數(shù)。

1.2.5NMR檢測捕獲后的免疫磁珠溶液取300 μL加入到核磁共振管中,選擇合適的SE序列設(shè)定其參數(shù),測定樣品的弛豫時間(T2)。在實驗中,測定免疫磁珠捕獲不同濃度的菌液時發(fā)現(xiàn),免疫磁珠與沙門氏菌進行免疫反應(yīng)后,其磁珠上修飾的單抗被菌體封閉,無法與離心管進行物理吸附,只能殘留在溶液中。所以當樣品中的目的菌越多,就會有越多的免疫磁珠與之進行免疫反應(yīng),封閉的免疫磁珠越多,殘留在溶液中的免疫磁珠越多,NMR測定的T2值越小,反之,目的菌越少,封閉的免疫磁珠越少,殘留在溶液中的免疫磁珠越少,NMR測定的T2值越大。

2　結(jié)果與討論

本研究的主要原理是設(shè)想將這NMR造影劑技術(shù)和免疫磁分離方面的研究結(jié)合起來,研究一種基于磁性氧化鐵納米生物傳感器針對食源性致病菌的NMR快速檢測方法,其特征是利用Fe3O4具有順磁和超順磁特性,對于共振儀器非常敏感,相對于其他分子而言,微量的Fe3O4能夠大幅降低無菌的去離子水的自旋-自旋弛豫時間(T2),而無菌的緩沖溶液在一定的均勻場強下,T2是固定的。因而將待測樣品與無菌的緩沖液對照組進行對照,在核磁共振信號上顯示T2的下降幅度較大。通過對比從核磁共振弛豫信號參數(shù)變化的角度,檢測出樣品中的有害致病菌。

2.1羧基修飾磁珠分析檢測

運用激光粒度儀對羧基磁珠PM3-020進行粒徑分析。圖1表明,在溫度為25 ℃時,終濃度為2 mg/mL的羧基磁珠在PBS緩沖液下,其羧基磁珠的平均粒徑為170.5 nm,分散指數(shù)(PDI)為0.061。實驗數(shù)據(jù)表明,羧基磁珠PM3-020在PBS緩沖液中的分散性較好,并且其粒徑分布比較均勻。

圖1　羧基磁珠PM3-020的粒徑分析Fig.1　Size distribution of carboxyl magnetic nanospheres (PM3-020)by intensity

2.2免疫磁珠的最佳捕獲條件優(yōu)化

2.2.1最佳捕獲緩沖液不同緩沖溶液的捕獲實驗結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明,除PBST以外的其他緩沖溶液中,等量免疫磁珠和樣品,經(jīng)過1.5 h的捕獲混勻后,其T2值與樣品中菌濃度呈現(xiàn)明顯的曲線關(guān)系。隨菌濃度越高,其T2值越小,反之菌濃度越低,其T2值越大,且T2最大值與無菌對照組的T2值持平,說明在此方法檢測的最小濃度為104～105CFU/mL。在PBST緩沖溶液中,其T2值為平穩(wěn)直線,并沒有很大的波動,可能由于PBST是在PBS溶液中加入了0.05%Tween-20,而Tween-20為表面活性劑,導(dǎo)致剩余抗體與離心管壁難以實現(xiàn)物理吸附。從圖2可以看出,PBS緩沖溶液下的T2值,相鄰濃度之間的梯度差異性好,且曲線平滑。因此最佳的捕獲緩沖溶液為PBS緩沖溶液(0.01 mol/L,pH7.4)。

圖2　不同的緩沖液對T2值的影響Fig.2　Effect of buffer solution on T2

2.2.2最佳捕獲時間不同捕獲時間的捕獲溶液在NMR下,檢測得到的T2結(jié)果如圖3。捕獲時間在0.5～1.0 h時,其T2值趨向平穩(wěn),沒有波動趨勢。在達到1.5 h后,T2值明顯梯度增大,菌濃度越小,其值增長越大。樣品溶液中菌濃度越大,其溶液T2值越大。當捕獲時間為2.0 h后,其增長幅度最大。但是樣品中菌濃度較低時的T2值已經(jīng)達到400 ms以上,在檢測過程中T2值越大,檢測誤差越大。因此選擇1.5 h作為免疫磁珠與樣品的捕獲時間。

圖3　不同捕獲時間對T2值的影響Fig.3　Effect of capture time on T2

2.2.3最佳免疫磁珠使用量將不同量的免疫磁珠分別與濃度梯度樣品反應(yīng),其T2值如圖4。當免疫磁珠量為100 μg時,其T2值在60 ms上下浮動,呈平緩趨勢。而25～60 μg時,其T2與菌濃度有著明顯的曲線關(guān)系?？紤]T2值大于400 ms時,會增大其系統(tǒng)誤差,所以最佳的免疫磁珠使用量為50 μg。

圖4　不同免疫磁珠使用量對T2值的影響Fig.4　Effect of immunomagnetic beads usage on T2

3　結(jié)論

本研究通過將微生物技術(shù)與核磁共振技術(shù)相結(jié)合,以沙門氏菌為模型,建立一種全新的基于Fe3O4納米粒子的食源性致病菌NMR快速檢測方法。利用Fe3O4的順磁特性和超順磁特性對核磁共振的弛豫時間參數(shù)的影響,與無菌對照組比較,檢測出食品樣本中是否含有目標致病菌,并在一定范圍定量檢測目標菌。本次研究表明,通過不斷優(yōu)化實驗反應(yīng)條件,最終使得核磁共振檢測T2值與目標菌的濃度呈現(xiàn)明顯,光滑的曲線關(guān)系。研究得出:在PBS緩沖液(0.01 mol/L,pH7.4)中,免疫磁珠與抗體特異性結(jié)合能力最強。同時,免疫磁珠捕獲時間達到1.5 h時,T2值與目標菌的濃度曲線關(guān)系明顯。當免疫磁珠使用量為50 μg時,T2值與菌濃度的曲線關(guān)系最為明顯。

通過該方法,在實驗用于檢測的時間只有10 min。整個準備實驗也不超過2 h。與其他的檢測方法的檢測所需時間12 h相比,此方法提高了食品樣本中有害致病菌的快速檢測時間,可作為大批待檢樣品的快速篩選,為致病菌的快速檢測提供了新的途徑。

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Biological sensors based on nano magnetic beads applied in rapid detection ofsalmonella

SHEN Jing,MENG Xue,NA Mei-ling,XU Xiao-li,ZHANG Jing-sheng*

(Nanchang University,Nan Chang 330047,China)

By couplingsalmonellamonoclonal antibody with carboxyl magnetic beads,immunomagnetic beads were produced,which were used as NMR molecular probes and biological sensors,pathogenic bacteria specially captured and detected in the samples so as to create a more rapid method to detectsalmonella. Different sample solutions were put into the nuclear magnetic resonance apparatus to detect the spin relaxation time(T2)and examine the influence of different conditions to the value of T2. The experiment found that the sample value of T2 was influenced by the volume of immunomagnetic beads,the choice of buffer solution and the time of capturing. Through optimization experiment,curve variations T2 under different conditions were drawn with a result of ideal capturing conditions. Under the conditions that the capturing buffer solution was phosphate buffer solution(PBS)(0.01 mol/L,pH7.4),the volume of immunomagnetic beads was 50 μg and the blending capturing time was 1.5 h,the curve of the sample value of T2 was perfect,detection linear range being 104～107CFU/mL. A new method and approach was provided by this research,which was helpful to shorten the detection time and process and opened an immense space for the study of low field nuclear magnetic resonance.

immunomagnetic beads;salmonella;nuclear magnetic resonance;rapid detection

2015-03-12

申靜(1989-),男,碩士研究生,研究方向:食品加工與安全,E-mail:student1124sj@163.com。

張錦勝(1971-),男,博士，副教授,研究方向:食品加工與安全,E-mail:zjsmcl@163.com。

江西省科技支撐計劃項目(20151BBG70049)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)05-0187-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.028