董學(xué)艷,姜鐵民,劉繼超,陳歷俊

(國(guó)家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心,北京市乳品工程技術(shù)研究中心,北京三元食品股份有限公司,北京 100163)

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高通量快速檢測(cè)母乳總蛋白、乳清蛋白和酪蛋白含量方法的比較研究

董學(xué)艷,姜鐵民,劉繼超,陳歷俊*

(國(guó)家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心,北京市乳品工程技術(shù)研究中心,北京三元食品股份有限公司,北京 100163)

分別利用Lowry、BCA和Bradford三種方法對(duì)母乳中總蛋白、乳清蛋白和酪蛋白的含量進(jìn)行了測(cè)定,并以凱氏定氮法為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)三種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明Lowry和Bradford法適用于母乳中總蛋白含量的測(cè)定,Lowry法適于母乳中乳清蛋白含量的測(cè)定,Lowry、BCA和Bradford三種方法均適用于母乳中酪蛋白含量的測(cè)定。采用上述方法,只需要4 mL母乳樣本,1.5 h內(nèi)即可完成母乳總蛋白、乳清蛋白和酪蛋白的微量、高通量快速測(cè)定。上述方法適用于較大量母嬰營(yíng)養(yǎng)狀況的調(diào)查研究,可為母乳化嬰幼兒配方乳粉的研制以及促進(jìn)嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育提供科學(xué)依據(jù)。

母乳,總蛋白,乳清蛋白,酪蛋白,快速測(cè)定

母乳是嬰兒生命初始階段最理想的食物,它含有優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、豐富的脂肪酸、乳糖和免疫活性物質(zhì)等,且易于消化吸收,對(duì)嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。母乳的營(yíng)養(yǎng)成分組成及營(yíng)養(yǎng)模式一直是嬰幼兒配方乳粉的黃金標(biāo)準(zhǔn),對(duì)母乳的相關(guān)研究也成為國(guó)內(nèi)外嬰幼兒配方乳粉開發(fā)的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)是母乳中最重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一,與嬰幼兒的營(yíng)養(yǎng)狀況息息相關(guān)。其乳清蛋白和酪蛋白的比例是母乳化嬰幼兒配方乳粉的參考依據(jù),也是決定嬰幼兒配方乳粉質(zhì)量的重要指標(biāo)。為了改善嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)和嬰幼兒配方乳粉質(zhì)量,母乳中總蛋白質(zhì)、乳清蛋白和酪蛋白含量的檢測(cè)是非常重要的。

常用的母乳中總蛋白質(zhì)、乳清蛋白和酪蛋白含量檢測(cè)方法為凱氏定氮法[1-2],雖然是經(jīng)典的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法,但由于樣品用量大,操作復(fù)雜,測(cè)量時(shí)間較長(zhǎng),使其不利于較大量母乳樣本的分析。母乳分析儀是近年來(lái)發(fā)展較為迅速的用于母乳中蛋白質(zhì)等宏量成分的快速檢測(cè)方法[3],該方法能測(cè)定母乳總蛋白含量,但無(wú)法測(cè)出乳清蛋白和酪蛋白的含量,且儀器成本較高。在蛋白質(zhì)的眾多檢測(cè)方法中比色法下屬分支最多,使用最為靈活。使用較多的有Lowry法(Folin-酚試劑法),BCA法(二喹啉甲酸,Bicinchoninic acid)和考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)[4-5]。這類方法的共同特點(diǎn)是樣品用量少、操作簡(jiǎn)單、測(cè)定時(shí)間短,且可以實(shí)現(xiàn)高通量等目的,已分別在牛乳蛋白質(zhì)檢測(cè)中得到不同程度的應(yīng)用[6]。

表2　三種方法檢測(cè)母乳總蛋白含量的比較Table 2　The comparison of the total protein content detected by three methods

注:同行中標(biāo)不同字母的均值有顯著性差異(p<0.05)，表2、表3同。

本研究針對(duì)母乳中總蛋白質(zhì)、乳清蛋白和酪蛋白含量測(cè)定過程中存在的樣品用量大、操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)及檢測(cè)儀器成本較高等問題,以凱氏定氮法為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)比研究了Lowry,BCA和Bradford三種檢測(cè)方法對(duì)母乳蛋白質(zhì)的檢測(cè),以期找到適用于母乳中總蛋白質(zhì)、乳清蛋白和酪蛋白含量的微量、高通量快速測(cè)定方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

母乳樣本來(lái)源于北京地區(qū),采集上午9～10點(diǎn)哺乳前乳樣(1,2分別是同一人分娩后第10、30 d的母乳;3,4,5分別是同一人分娩后第6、30、60 d的母乳),存入-80 ℃冰柜待用;Lowry法蛋白濃度測(cè)定試劑盒北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒北京索萊寶科技有限公司;Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒碧云天生物技術(shù)。

3K-15高速冷凍離心機(jī)美國(guó)Sigma公司;BioTek Elx 800酶標(biāo)儀美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1母乳樣本的處理取4 mL母乳,0.5 mL用于總蛋白的測(cè)定,剩余3.5 mL 4 ℃條件下11000 r/min離心20 min。去掉上層脂肪,取中間清液,用鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.6,室溫靜置0.5 h,4 ℃ 11000 r/min離心20 min,上清液為乳清蛋白,酪蛋白沉淀用變性劑(含8 mol/L尿素,165 mmol/L Tris,44 mmol/L檸檬酸鈉和0.3%β-巰基乙醇)溶解。

1.2.24種方法測(cè)定母乳中的蛋白質(zhì)含量凱氏定氮法:凱氏定氮法按照GB/T 5009.5-2010測(cè)定母乳中總蛋白質(zhì)含量。Lowry法,BCA法和Bradford法分別按照試劑盒的操作說明繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行樣本的檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1三種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Lowry,BCA和Bradford三種方法分別以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的方程如表1所示。由表1中數(shù)據(jù)可知,在合適的濃度范圍內(nèi),牛血清白蛋白與Lowry,BCA和Bradford反應(yīng)體系線性關(guān)系較好,牛血清白蛋白適合作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

表1　三種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 1　The standard curve equations of three methods

2.2三種方法檢測(cè)母乳總蛋白結(jié)果

我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定食品中蛋白質(zhì)(GB/T 5009.5-2010)[7]有三種方法:凱氏定氮法、分光光度法和燃燒法。凱氏定氮法為最重要和經(jīng)典的方法,也被用于母乳中總蛋白含量的測(cè)定。Shi等[8]用凱氏定氮法測(cè)定母乳中總蛋白的含量為12.7～13.8 mg/mL。此外,Casadio等[9]和Silvestre等[10]分別利用Bradford法檢測(cè)了母乳中總蛋白的含量,分別為12.0 mg/mL和11.9 mg/mL。

以凱氏定氮檢測(cè)法作為標(biāo)準(zhǔn),利用Lowry,BCA和Bradford三種方法檢測(cè)母乳總蛋白含量的結(jié)果如表2所示。由表2可知,凱氏定氮法、Lowry法、BCA法、Bradford法檢測(cè)5份母乳中總蛋白含量分別為13.1～14.8、11.94～13.95、17.94～19.78、13.19～14.44 mg/mL。Lowry和Bradford法對(duì)母乳中總蛋白含量的檢測(cè)結(jié)果與凱氏定氮法的檢測(cè)結(jié)果比較無(wú)顯著性差異(p>0.05),且Lowry和Bradford法的檢測(cè)結(jié)果比較也沒有顯著性差異(p>0.05)。BCA法的檢測(cè)結(jié)果顯著高于凱氏定氮法,Lowry和Bradford法的檢測(cè)結(jié)果(p<0.05)。結(jié)果表明Lowry和Bradford法適用于母乳中總蛋白含量的測(cè)定。

BCA法的檢測(cè)結(jié)果高于凱氏定氮、Lowry和Bradford法,可能是因?yàn)闇y(cè)定過程中受到脂肪的影響。由于BCA法的檢測(cè)原理是在堿性條件下,蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+,Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物,測(cè)定其在562 nm處的吸收值。脂類物質(zhì)在500～600 nm處也有強(qiáng)烈的吸收,因此會(huì)干擾BCA法對(duì)蛋白濃度的測(cè)定[11]。

2.3三種方法檢測(cè)母乳乳清蛋白結(jié)果

利用Lowry,BCA和Bradford三種方法檢測(cè)母乳乳清蛋白含量的結(jié)果如表3所示。由表3可知,Lowry法、BCA法、Bradford法檢測(cè)5份母乳中乳清蛋白的含量分別為7.86～8.47、10.16～13.88、4.50～6.36 mg/mL,且三種方法檢測(cè)的結(jié)果之間均存在顯著性差異(p<0.05)。

Kunz等[2]用凱氏定氮法測(cè)定了母乳中乳清蛋白的含量,從過渡乳到成熟乳乳清蛋白的含量為7.3～8.6 mg/mL,與Lowry法的檢測(cè)結(jié)果基本一致。Yuen等[12]用Bradford法測(cè)定母乳成熟乳中乳清蛋白的含量為4.04 mg/mL,與本實(shí)驗(yàn)中Bradford法的測(cè)定結(jié)果基本一致,但是低于Lowry法。Yuen等與Kunz等測(cè)定的母乳乳清蛋白的含量不同可能是因?yàn)槭懿煌貐^(qū)乳母膳食不同影響。凱氏定氮法作為蛋白含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法,比較三種方法與凱氏定氮法的檢測(cè)結(jié)果可知,Lowry法更適于母乳中乳清蛋白含量的測(cè)定。

表3　三種方法檢測(cè)母乳乳清蛋白含量的比較Table 3　The comparison of the whey protein content detected by three methods

2.4三種方法檢測(cè)母乳酪蛋白結(jié)果

利用Lowry,BCA和Bradford三種方法檢測(cè)母乳酪蛋白含量的結(jié)果如表4所示。由表4可知,Lowry法、BCA法、Bradford法檢測(cè)5份母乳中酪蛋白的含量為5.22～5.78、5.38～6.13、5.15～5.64 mg/mL,且三種方法檢測(cè)的結(jié)果之間均沒有顯著性差異(p>0.05)。

Kunz等[2]用凱氏定氮法測(cè)定了母乳中酪蛋白的含量,從過渡乳到成熟乳酪蛋白的含量為5.5～5.9 mg/mL。Yuen等[12]用Bradford法測(cè)定母乳成熟乳中酪蛋白的含量為6.02 mg/mL。二人測(cè)得的結(jié)果均與本實(shí)驗(yàn)中Lowry、BCA和Bradford三種方法的檢測(cè)結(jié)果基本一致。由此可知,Lowry、BCA和Bradford三種方法均適用于母乳中酪蛋白含量的測(cè)定。

表4　三種方法檢測(cè)母乳酪蛋白含量的比較Table 4　The comparison of the casein protein content detected by three methods

3　結(jié)論

以凱氏定氮法為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)比研究了Lowry,BCA和Bradford三種方法對(duì)母乳蛋白質(zhì)含量的測(cè)定,確定了母乳總蛋白、乳清蛋白和酪蛋白含量的微量、高通量快速測(cè)定方法。Lowry和Bradford法適于母乳中總蛋白含量的測(cè)定,Lowry法適于母乳中乳清蛋白含量的測(cè)定,Lowry、BCA和Bradford三種方法均適于母乳中酪蛋白含量的測(cè)定。分別采用Lowry和Bradford法;Lowry法;Lowry、BCA和Bradford方法,使用4 mL母乳樣本,同批次檢測(cè)45個(gè)試樣,1.5 h內(nèi)(凱氏定氮法同批次檢測(cè)20個(gè)試樣,耗時(shí)6 h)可實(shí)現(xiàn)母乳總蛋白、乳清蛋白和酪蛋白含量的高通量快速測(cè)定,方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。

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A comparative study of rapid and high-throughput detection method for total protein,whey protein and casein in human milk

DONG Xue-yan,JIANG Tie-min,LIU Ji-chao,CHEN Li-jun*

(National Health Engineering Research Center for Maternal and Infant Dairy,The Dairy Engineering and Technology Research Center of Beijing,Beijing Sanyuan Foods Co.,Ltd,Beijing 100163,China)

The contents of human milk total protein,whey protein and casein were determined using Lowry,BCA and Bradford,respectively,and the results were compared with the Kjeldahl. The results showed that both Lowry and Bradford methods were suitable for determination of total protein content,while the whey protein content determined using Lowry method was closer to Kjeldahl. Lowry,BCA and Bradford methods were applicable for determination of the content of casein. Adopt the above-mentioned methods,the contents of human milk total protein,whey protein and casein can be rapidly determined within 1.5 h using only 4 mL human milk. These methods were suitable for the investigation of a large number of maternal and child nutritional status so that it provided the scientific basis for the development of human milk simulated infant formula and infant growth promotion.

human milk;total protein;whey protein;casein;fast determination

2015-07-13

董學(xué)艷(1983-)，女，博士，研究方向：乳品科學(xué)，E-mail:18910005185@163.com。

陳歷俊(1967-)，男，教授級(jí)高級(jí)工程師，研究方向：新型乳制品和質(zhì)量安全控制技術(shù)研究與開發(fā)，E-mail:chenlijun@sanyuan.com.cn。

北京市重大科技計(jì)劃項(xiàng)目(D141100004814002)

TS252.1

A

1002-0306(2016)05-0308-03

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.053