汪建紅,李　迪

(1.內(nèi)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,四川內(nèi)江 641112；2.四川省高等學(xué)校“果類(lèi)廢棄物資源化”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川內(nèi)江 641112)

?

纖維素酶法提取荸薺皮中多糖的工藝研究

汪建紅1,2,李迪1

(1.內(nèi)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,四川內(nèi)江 641112；2.四川省高等學(xué)校“果類(lèi)廢棄物資源化”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川內(nèi)江 641112)

以低溫烘干的荸薺皮為原料,利用纖維素酶法提取荸薺皮中的多糖,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)考察了pH、酶用量、液料比、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)多糖提取效果的影響。結(jié)果表明:當(dāng)pH為5,酶用量為2.0%,液料比為30∶1 mL/g,酶解溫度為60 ℃,酶解時(shí)間為2 h時(shí),得率最高。在此條件下作了5次平行實(shí)驗(yàn),平均得率可達(dá)32.33%,遠(yuǎn)大于相同條件下水提法的得率18.31%,而且實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好。因此,用于荸薺皮中多糖提取的纖維素酶法是一種很有發(fā)展前途的提取方法。

纖維素酶,多糖,荸薺皮,提取

荸薺是一種原產(chǎn)于中國(guó)的歷史悠久、美味可口、營(yíng)養(yǎng)豐富的水果,深受人們喜愛(ài)[1]。但荸薺皮往往被作為垃圾直接拋棄,既污染了環(huán)境,又浪費(fèi)了資源。荸薺皮含有大量的淀粉、多糖、色素、果膠等生物活性物質(zhì),尤其是多糖含量十分豐富[2-4]。多糖具有清熱開(kāi)胃、抗腫瘤、抗輻射、增強(qiáng)免疫等藥用價(jià)值,引起人們的廣泛關(guān)注[1,2,5]。

多糖的常用提取方法有水浸提法[6-8]、超聲波提取法[6,8]、微波提取法[6]、酶法[9-11]等。水浸提法操作簡(jiǎn)便,但得率低。超聲波法和微波法操作簡(jiǎn)便,條件溫和,得率較高,但超聲波會(huì)導(dǎo)致多糖分解,微波也會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu),而且超聲波和微波會(huì)對(duì)人體帶來(lái)較大危害,長(zhǎng)期接觸低劑量的超聲波會(huì)有致癌的風(fēng)險(xiǎn)。酶法條件溫和,操作簡(jiǎn)便,提取效率高,便于工業(yè)化應(yīng)用。到目前為止文獻(xiàn)中[12]僅見(jiàn)到超聲波法、水提法提取荸薺多糖的記載,還未見(jiàn)過(guò)使用酶法提取荸薺皮多糖的報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇酶法提取荸薺皮中的多糖。

常用的酶有纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶等。纖維素酶[13]溶解容易,活性較高,操作簡(jiǎn)便,后處理容易,因此本實(shí)驗(yàn)選擇纖維素酶提取荸薺皮中的多糖,并優(yōu)化提取條件,為其應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

纖維素酶(活力值>15 U/mg,優(yōu)級(jí)純)上海伯奧生物科技有限公司;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(優(yōu)級(jí)純)成都金山化學(xué)試劑有限公司;濃硫酸、苯酚、乙酸、乙酸鈉 成都金山化學(xué)試劑有限公司均為分析純;荸薺四川內(nèi)江。

DFT-100手提式萬(wàn)能高速粉碎機(jī)溫嶺市林大機(jī)械有限公司;722型可見(jiàn)分光光度計(jì)上海菁華科技儀器公司;CS101-2AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海興創(chuàng)科學(xué)儀器設(shè)備有限公司;FA2204A型電子天平上海精天電子儀器有限公司;TDL-5-A型低速大容量離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:參照文獻(xiàn)方法[14],將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于105 ℃干燥至恒重,準(zhǔn)確稱(chēng)取此標(biāo)準(zhǔn)品50.00 mg,于50 mL容量瓶中配制1.00 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,放置備用。

測(cè)定波長(zhǎng)的選擇:參照文獻(xiàn)方法[14],準(zhǔn)確移取1.00 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照苯酚硫酸法顯色,并在300～600 nm之間進(jìn)行掃描,發(fā)現(xiàn)488 nm處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰,因此選擇488 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:參照文獻(xiàn)方法[14],分別精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mL于50 mL容量瓶中,加蒸餾水至刻度,搖勻。精確吸取上述各溶液2.0 mL,于帶刻度試管中,分別加入1.0 mL 6%苯酚溶液,振蕩搖勻,緩慢加入5.0 mL濃硫酸,搖勻,于40 ℃水浴中顯色30 min,在488 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以被測(cè)定的溶液濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出直線回歸方程。

1.2.2荸薺皮多糖的提取與測(cè)定稱(chēng)取2.00 g干荸薺皮粉,在一定pH下,加入一定量的纖維素酶溶液,在一定溫度下利用水作溶劑提取一定時(shí)間,然后沸水浴(約90 ℃)下滅酶60 min,離心,取上層清液裝入100 mL容量瓶中,蒸餾水定容,放置備用。

用移液管準(zhǔn)確移取1.0 mL上述提取液于25 mL容量瓶中,用蒸餾水定容。再?gòu)纳鲜?5 mL容量瓶中用移液管準(zhǔn)確移取1.00 mL溶液于10 mL比色管中,定容、搖勻。

從上述10 mL比色管中取2.00 mL溶液于另一10.00 mL比色管中,加入1 mL 6%的苯酚溶液,搖勻,再加入5 mL濃硫酸,搖勻,然后于40 ℃水浴中顯色30 min,利用分光光度計(jì),在488 nm處測(cè)定其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及其回歸方程計(jì)算提取液中多糖的濃度,多糖的得率按下式計(jì)算:

Et(%)=(C×V×N)/M×100

式中Et為得率(%),C為測(cè)得的提取液濃度(g/mL),N為稀釋倍數(shù),V為提取液體積(mL),M為荸薺皮干粉質(zhì)量(g)。

1.2.3pH的影響在酶用量(酶用量占荸薺皮粉的質(zhì)量百分比)0.5%,液料比(V溶劑∶m荸薺皮)15∶1 mL/g,酶解溫度40 ℃,酶解時(shí)間1 h的條件下,研究了pH(3、4、5、6)對(duì)荸薺皮多糖提取效果的影響。

1.2.4酶用量的影響在液料比15∶1 mL/g,前面步驟確定的pH,酶解溫度40 ℃,酶解時(shí)間1 h的條件下,研究了酶用量占荸薺皮粉的質(zhì)量百分比(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對(duì)荸薺皮多糖提取效果的影響。

1.2.5液料比的影響在前面步驟確定的酶用量、pH,酶解溫度40 ℃,酶解時(shí)間1 h的條件下,研究了液料比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g)對(duì)荸薺皮多糖提取效果的影響。

1.2.6酶解溫度的影響在前面步驟確定的酶用量、pH、液料比,酶解時(shí)間1 h的條件下,研究了酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)對(duì)荸薺皮多糖提取效果的影響。

1.2.7酶解時(shí)間的影響在前面步驟確定的酶用量、pH、液料比、酶解溫度的條件下,研究了酶解時(shí)間(1、2、3、4 h)對(duì)荸薺皮多糖提取效果的影響。

1.2.8正交實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[14]方法,以pH、酶用量、液料比、酶解溫度、酶解時(shí)間為考察因素,每個(gè)因素選取4個(gè)水平,使用L16(45)正交表來(lái)安排實(shí)驗(yàn),每組實(shí)驗(yàn)條件作了三次平行實(shí)驗(yàn)。

表1　因素水平表Table 1　The factors and levels chart

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析,得出最佳提取工藝條件和因素影響大小順序。在此最佳工藝條件下重復(fù)1.2.2的操作,并在此條件下在不用酶的情況下利用水提法重復(fù)1.2.2的操作。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示:

圖1　多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of polysaccharide

從圖1可知標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=0.0334C-0.0704,R2=0.9994。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1pH的影響pH對(duì)荸薺皮多糖提取效果的影響如圖2所示。

圖2　pH的影響Fig.2　Effects of pH

從圖2可看到pH在3～5的范圍內(nèi),荸薺皮多糖的得率隨pH的增大而增大,當(dāng)pH達(dá)到5時(shí),得率達(dá)最大值;此后隨pH的增加,多糖得率卻逐漸下降。這是由于pH會(huì)影響酶蛋白活性,在一定范圍內(nèi)隨pH的增大,纖維素酶的活性逐漸增大,但pH過(guò)大時(shí),酶的活性隨其升高而減弱。故綜合考慮后確定最佳pH=5。

2.2.2酶用量的影響在前面得到的pH=5的基礎(chǔ)上,酶用量(酶用量占荸薺皮粉的質(zhì)量百分比)對(duì)荸薺皮多糖提取效果的影響如圖3所示。

圖3　酶用量的影響Fig.3　Effects of the amount of enzyme

從圖3可看出,在酶用量0.5%～2.0%的范圍內(nèi),多糖得率隨酶用量的增加而增加,當(dāng)達(dá)到2.0%時(shí),得率達(dá)最大值;此后隨酶用量的繼續(xù)增加,多糖得率不但沒(méi)增加反而逐漸下降。這是由于酶用量越大,活力值越大,因此更有利于多糖的浸出;但酶用量過(guò)大時(shí)也會(huì)增加被酶催化分解變質(zhì)的多糖的量。因此選擇2.0%的酶用量。

2.2.3液料比的影響液料比對(duì)荸薺皮多糖提取效果的影響如圖4所示。

圖4　液料比的影響Fig.4　Effects of the liquid-solid ratio

從圖4可看到,荸薺皮多糖得率隨溶劑用量的增加而增加,當(dāng)液料比達(dá)到30∶1 mL/g時(shí),多糖得率達(dá)最大值,此后隨溶劑用量的增加,多糖得率卻逐漸下降。這是由于溶劑量的增加也增加了能溶解的多糖的量,有利于多糖的浸出;但溶劑量的增加,也會(huì)降低酶的濃度,使其活性降低。綜合考慮選擇30∶1 mL/g的液料比。

2.2.4酶解溫度的影響酶解溫度對(duì)荸薺皮多糖提取效果的影響如圖5所示。

圖5　酶解溫度的影響Fig.5　Effects of enzymolysis temperature

從圖5可知,在30～50 ℃范圍內(nèi),多糖得率隨酶解溫度的上升而增大,當(dāng)達(dá)到50 ℃時(shí),得率達(dá)最大;此后,隨酶解溫度升高,多糖得率卻逐漸下降。這是由于在一定范圍內(nèi)酶解溫度越高,酶活性越強(qiáng),多糖分子也越活躍,有利于多糖的浸出,但過(guò)高的溫度也會(huì)降低酶的活性,甚至使酶失活。綜合考慮,選擇酶解溫度50 ℃。

2.2.5酶解時(shí)間的影響酶解溫度50 ℃的基礎(chǔ)上,酶解時(shí)間的影響如圖6所示。

圖6　酶解時(shí)間的影響Fig.6　Effects of enzymolysis time

從圖6可看到隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),多糖得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),酶解時(shí)間2 h時(shí),荸薺皮多糖得率達(dá)到最大值。那是由于提取初期,提取液中多糖濃度小,遠(yuǎn)未達(dá)到飽和,對(duì)酶的抑制作用也小,因此逐漸上升;當(dāng)達(dá)到2 h后,溶劑中多糖濃度達(dá)到較大,接近于飽和狀態(tài),對(duì)酶的抑制作用也增加;另一方面酶與多糖接觸時(shí)間的延長(zhǎng)也會(huì)增加被分解變質(zhì)的多糖的量。綜合考慮,選擇2 h的提取時(shí)間。

2.3正交實(shí)驗(yàn)

按照L16(45)正交表安排的正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表2、表3所示。

表2　L16(45)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　L16(45)orthogonal experimental design and results

從表2可看出,荸薺皮中多糖得率受到了pH、酶用量、液料比、酶解溫度、酶解時(shí)間這5個(gè)因素的交叉影響,各影響的主次次序?yàn)閜H>液料比>酶解時(shí)間>酶解溫度>酶用量。最佳水平組合為A3B3C3D4E2,即pH5,酶用量2.0%,溶劑水合荸薺皮粉的液料比30∶1 mL/g,酶解溫度60 ℃,酶解時(shí)間2 h。

表3　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3　Variance analysis of the orthogonal experiment results

注:F0.05(3,3)=9.280,F0.01(3,3)=29.500,*代表p<0.05為影響顯著,**代表p<0.01為影響極顯著。

為了進(jìn)一步確定實(shí)驗(yàn)因子的可信度,對(duì)荸薺皮中多糖得率的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析見(jiàn)表3。從表3可看到,在荸薺皮多糖所選擇提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)所選取因素和水平范圍內(nèi),因素A即pH的影響達(dá)到了極顯著的水平(p<0.01),因素B、C、D、E的影響未達(dá)到顯著水平。而F值結(jié)果表明,方差分析結(jié)果與直觀的極差分析結(jié)果一致。

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果荸薺皮中多糖的得率分別為32.23%、32.35%、32.16%、32.47%、32.45%,平均值為32.33%,正交優(yōu)化條件可行。

2.4兩種提取方法的比較

表4列舉了并比較了兩種提取方法提取荸薺皮中多糖的情況。

表4　兩種提取方法下的荸薺皮多糖提取情況Table 4　The extracting effects of polysaccharide in water chestnut peel by two kinds of extracting methods

從表4可知,纖維素酶法的多糖得率遠(yuǎn)大于相同條件下的水提法,其原因就在于纖維素酶對(duì)荸薺皮組織的破壁作用使得多糖更容易浸出,更利于提取。

3　結(jié)論

本文通過(guò)設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),得出了纖維素酶法提取荸薺皮中多糖的實(shí)驗(yàn)中,影響荸薺皮中多糖得率指標(biāo)的因素大小順序?yàn)?pH>液料比>酶解時(shí)間>酶解溫度>酶用量,提取的最佳工藝條件為:pH5,酶用量2.0%,溶劑水合荸薺皮粉的液料比30∶1 mL/g,酶解溫度60 ℃,酶解時(shí)間2 h。通過(guò)平行實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證可知,該方法不但得率較高,而且實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好,也說(shuō)明正交實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論是正確的。同不使用酶的水提法相比,纖維素酶法具有條件溫和,得率較高的優(yōu)點(diǎn)。該研究結(jié)果對(duì)于天然產(chǎn)物中有效成分的提取研究具有一定的參考價(jià)值。

[1]王薇. 荸薺的保健功能及加工利用[J]. 食品與藥品,2005,7(4A):45-48.

[2]趙廣河,陳振林. 荸薺活性成分與功能作用研究進(jìn)展[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā),2011,32(9):235-237.

[3]孔進(jìn)喜,韓文芳,呂廣英,等. 荸薺食品加工研究進(jìn)展[J]. 保鮮與加工,2011,11(1):43-46.

[4]江文,李楊瑞,楊麗濤,等. 荸薺球莖主要性狀觀察及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)分析[J]. 中國(guó)蔬菜,2009,(2):51-54.

[5]蔡健. 荸薺的營(yíng)養(yǎng)保健和加工利用[J]. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2005,(2):40-42.

[6]陳建平,湯化琪,武旭芳,等. 中蒙藥多糖提取方法及工藝研究[J]. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,35(2):158-162.

[7]尚喜雨. 水提法·酶法提取鐵皮石斛多糖的比較研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(18):9787-9788.

[8]徐雅琴,崔崇士,王洪偉,等. 南瓜多糖提取方法研究[J]. 食品工業(yè),2006,(5):45-47.

[9]孟憲軍,朱金艷,孫希云,等. 酶法優(yōu)化藍(lán)莓多糖的提取工藝[J]. 食品工業(yè)科技,2009,30(3):185-187.

[10]國(guó)立東,王麗群,劉曉艷. 枸杞多糖提取技術(shù)研究進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)藥,2012,25(6):835-837.

[11]李波,宋江良,趙森,等. 酶法提取香菇多糖工藝研究[J].食品科學(xué),2007,28(9):274-277.

[12]王忠合,王軍,黎健文. 荸薺多糖的提取及特性研究[J]. 食品科技,2012,37(7):196-198.

[13]田瑞紅,江連洲,胡少新,等. 超聲波酶法提取豆渣中水溶性多糖條件的優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2011,32(11):305-308.

[14]張海容,白娟,魏增云,等. 超聲萃取-響應(yīng)面法優(yōu)化淡竹葉多糖提取方法研究[J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用,2013,25(3):303-310.

Study on the extraction technology of polysaccharide in water chestnut peel by cellulase

WANG Jian-hong1,2,LI Di1

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Neijiang Normal University,Neijiang 641112,China;2.Key Laboratory of Fruit Waste Treatment and Resource Recycling,Neijiang 641112,China)

With low-temperature baked water chestnut peel as raw material,the polysaccharide was extracted from the water chestnut peel by cellulase. The effect of the pH,the amount of cellulase,the liquid-solid ratio,the enzymolysis temperature,and the enzymolysis time,on the extraction of polysaccharide,were studied by the single factor experiments and the orthogonal tests. The results showed that when the pH was 5,the amount of cellulase was 2.0%,the liquid-solid ratio was 30∶1 mL/g,the enzymolysis temperature was 60 ℃,the enzymolysis time was 2 h,the extraction rate reached the maximum. Under the optimal conditions,five parallel experiments were carried out and the extraction rate could reach 32.33%,which was highly more than the extraction rate of 18.31% of water extraction method at the same conditions. The reproducibility of the experiments was good. So the cellulase method used for extraction of polysaccharide in water chestnut peel,was one kind of promising extracting method.

cellulase;polysaccharide;water chestnut peel;extraction

2015-08-04

汪建紅(1981-)，男，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事天然產(chǎn)物的提取、純化及性質(zhì)等方面的研究，E-mail:cunhua2@126.com。

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(15ZA0291 )。

TS255.36

B

1002-0306(2016)05-0248-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.040