羅　宏范英姬　王海波　王　娟　張　艷　杜　倩

氧化苦參堿對人黑素細(xì)胞增殖與炎癥因子自分泌的影響

羅宏☆范英姬王海波王娟張艷杜倩

目的： 明確氧化苦參堿（OMT）對黑素細(xì)胞增殖、TLR3、NF-κB的mRNA表達及相關(guān)細(xì)胞因子的影響。方法： 人表皮黑素細(xì)胞傳代培養(yǎng)，分為空白對照組及不同濃度的氧化苦參堿組（10μmol/ L，50μmol/L和100μmol/L），用MTT法測定細(xì)胞增殖，RT-qPCR檢測TLR3、NF-κB的mRNA表達，ELISA試劑盒檢測IL-6、IL-8及IL-17表達。結(jié)果： 各組黑素細(xì)胞的吸光度值均顯著高于空白對照組，隨OMT濃度上升而升高，當(dāng)OMT濃度為50μmol/L時增殖率達到平臺期。OMT組TLR3及NF-κBmRNA及IL-6、IL-8及IL-17蛋白表達較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：

氧化苦參堿可促進黑素細(xì)胞的增殖，下調(diào)TLR3、NF-κB的mRNA表達，減少IL-6、IL-8及IL-17的生成。

氧化苦參堿? 黑素細(xì)胞? TLR3? NF-κB

白癜風(fēng)是皮膚科常見的色素障礙性疾病，本病參與機制復(fù)雜，臨床上表現(xiàn)為發(fā)生于局部皮膚黏膜的色素減退或脫失性疾病。世界人群發(fā)病率為0.5%～1%，目前有逐年上升趨勢［1］。免疫損傷是白癜風(fēng)發(fā)病的關(guān)鍵步驟之一，而氧化苦參堿（Oxymatrine，OMT）具有較好的抗炎和免疫調(diào)節(jié)藥理學(xué)效應(yīng)，在呼吸、消化、血液等不同醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里發(fā)現(xiàn)OMT對NF-κB增殖抑制通路具有抑制作用，且其能減少TNF-α、IL-1β等促炎因子的表達［2-4］。而且在過敏性皮膚病、色素異常性皮膚病等皮膚科多種疾病的臨床應(yīng)用中，苦參素皆可表現(xiàn)出穩(wěn)定且安全的治療效果。因此，在針對白癜風(fēng)患者的治療里，本研究欲尋求OMT是否可通過阻斷TLR3-NF-κB增殖抑制通路，減輕炎癥所致黑素細(xì)胞的凋亡，從而達到治療效果呢?為此，我們進行了一系列細(xì)胞實驗，用MTT、ELISA、RT-qPCR等方法檢測了OMT處理黑素細(xì)胞后細(xì)胞的增殖情況，以及OMT對相關(guān)炎癥因子的表達影響。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗細(xì)胞 收集我院外科門診健康成人包皮環(huán)切術(shù)后手術(shù)標(biāo)本，患者既往無白癜風(fēng)，且無白癜風(fēng)家族史，標(biāo)本經(jīng)患者知情后簽署同意書，將黑素細(xì)胞分離及體外培養(yǎng)，使用第3代細(xì)胞進行實驗。

1.1.2實驗儀器與試劑配制 98%高純度氧化苦參堿（中國藥品生物制品檢定所）：氧化苦參堿水溶性好，加入不同體積的蒸餾水分別溶解成10μmol/L、50 μmol/L、100μmol/L濃度備用?核因子受體激活劑RANK（美國Sigma公司）：滅菌蒸餾水溶解配制成濃度為50 ng/mL［5］?Medium 254細(xì)胞培養(yǎng)基、生長因子HMGS、胎牛血清、PBS液（美國Gibco公司）?胰蛋白酶（上海碧云天）?二甲基亞砜、青霉素、鏈霉素（美國Sigma公司）?MTT粉（VETEC）?超凈工作臺（蘇州安泰）?二氧化碳培養(yǎng)箱（德國Heraeus）?倒置顯微鏡（日本Olympus）?酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海西塘生物）?LightCycler480熒光定量PCR系統(tǒng)等。

1.2實驗方法

1.2.1人表皮黑素細(xì)胞傳代培養(yǎng) 將包皮組織去除皮下組織部分并分離成小塊狀，加入分離酶將表皮部分分離后，再添加胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，重復(fù)數(shù)次，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，按5×105個/mL密度接種于培養(yǎng)瓶，放入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜，每日觀察細(xì)胞生長狀態(tài)并及時換液。當(dāng)細(xì)胞在瓶內(nèi)鋪壁約80%時，加入胰蛋白酶差別消化，提純黑素細(xì)胞。傳至第3代并通過測序驗證的黑素細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2實驗分組 第3代黑素細(xì)胞貼壁80%左右時，胰蛋白酶消化后以1×105個/mL密度接種于96孔板過夜，次日棄去廢液，空白對照組只加入新鮮培養(yǎng)基? OMT組分別加入含10μmol/L、50μmol/L、100μmol/ L這3種濃度的培養(yǎng)基各100μL，RANK組在OMT處理組基礎(chǔ)上加入含50 ng/m L RANK的培養(yǎng)基100 μL，空白對照組則加入完全培養(yǎng)基100μL，每組設(shè)6復(fù)孔，將其放置二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3黑素細(xì)胞增殖率檢測 結(jié)束培養(yǎng)后按照MTT步驟，各孔加入5mg/mLMTT溶液20μL，放回培養(yǎng)箱孵育4 h，后去除上清，各孔加入DMSO 150μL，上搖床震蕩10 min使結(jié)晶充分溶解。最后用酶標(biāo)儀測各孔490 nm處光吸收度，重復(fù)三次并記錄數(shù)據(jù)。細(xì)胞增殖率=（OMT組A490值-空白對照組A490值）/對照組A490值×100%。

1.2.4OMT促進黑素細(xì)胞增殖分子信號通路的檢測選擇能促進黑素細(xì)胞增殖最佳的OMT濃度（50 μmol/L），培育24 h后提取細(xì)胞總RNA。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板進行RT-qPCR熒光定量檢測TLR3、NF-κB、IL-6、IL-8及IL-17 mRNA表達情況。引物序列見表1。引物由上海生工生物公司合成。

表1　目的基因及內(nèi)參基因引物序列

1.2.5OMT對黑素細(xì)胞表面IL-6、IL-8及IL-17表達水平的檢測 50μmol/L OMT培育各組細(xì)胞24 h后，按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明，取各組上清液檢測IL -6、IL-8及IL-17的表達。

1.2.6NF-κB激動劑RANK對OMT處理下黑素細(xì)胞的影響 細(xì)胞培養(yǎng)方式同上，當(dāng)黑素細(xì)胞接種至96孔板過夜后，次日棄去廢液，加入含有50μmol/L OMT培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，再加入NF-κB激動劑RANK（終濃度為50 ng/mL）繼續(xù)培養(yǎng)24 h然后用RT -qPCR法檢測TLR3、NF-κB的表達，用ELISA技術(shù)檢測IL-6、IL-8及IL-17的表達情況。

1.2.7統(tǒng)計學(xué)方法 SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3結(jié)果

1.3.1MTT檢測OMT對黑素細(xì)胞增殖的影響 通過MTT法測得各組細(xì)胞吸光度并計算細(xì)胞增殖率，行方差分析及LSD-t檢驗，加入OMT培養(yǎng)48 h后，各組黑素細(xì)胞的吸光度皆顯著高于空白對照組，不同濃度OMT組間比較，細(xì)胞增殖趨勢隨OMT濃度上升而升高，當(dāng)OMT濃度為50μmol/L時增殖率達到一個平臺期（?P<0.05???P>0.05）見圖1。因此，后續(xù)實驗選擇培養(yǎng)時間48 h，50μmol/L OMT為實驗濃度。

1.3.2RT-qPCR檢測黑素細(xì)胞TLR3及NF-κB的mRNA表達 收集對照組、OMT處理組、OMT+RANK處理組細(xì)胞。TRIZOL法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后用RT -qPCR方法檢測TLR3、NF-κBmRNA表達情況。所得結(jié)果如圖2所示。我們可見，加入50μmol/L濃度的OMT后，黑素細(xì)胞TLR3、NF-κB mRNA表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。加入NF-κB特異性激動劑RANK后，TLR3與NF-κB mRNA表達得到恢復(fù)。說明OMT可以介導(dǎo)TLR3-NF-κB通路，降低TLR3、NF-κB的mRNA表達。

?P<0.05???P>0.05圖1　MTT檢測OMT對黑素細(xì)胞增殖的影響

圖2　RT-qPCR檢測OMT、RANK處理后，黑素細(xì)胞TLR3、NF -κB mRNA表達情況

1.3.3ELISA檢測黑素細(xì)胞IL-6、IL-8及IL-17的表達 黑素細(xì)胞經(jīng)不同處理后，應(yīng)用相應(yīng)的ELISA試劑盒測得上清液內(nèi)IL-6、IL-8及IL-17的結(jié)果如表2所示。經(jīng)方差分析可見，空白對照組相比，加入OMT的黑素細(xì)胞所表達出的炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-8和IL-17均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。加入NF-κB特異性激動劑RANK后，IL-6、IL-8與IL-17的產(chǎn)生較OMT組明顯升高。

表2　不同處理組對IL-6、IL-8及IL-17表達情況

2　討論

白癜風(fēng)是一種以黑素細(xì)胞丟失和白斑形成為特征的色素障礙性皮膚病，它的發(fā)病是多基因遺傳、在多種環(huán)境刺激因子的激發(fā)下表現(xiàn)出免疫功能紊亂，表皮黑素細(xì)胞（melanocyte，MC）受到破壞，導(dǎo)致局限或泛發(fā)性色素脫失，最終在局部皮膚形成大小不等、數(shù)目不定的色素完全脫失斑［4，6］。它在我國人群患病率呈逐年上升的趨勢，由于病程不定，病因不清，治療困難，往往給患者帶來心理負(fù)擔(dān)。近年來，臨床上對于白癜風(fēng)，除光療以外的大部分內(nèi)科療法采用免疫調(diào)節(jié)劑，細(xì)胞毒性藥物以及外科自體黑素細(xì)胞移植［7］。但由于白癜風(fēng)病因并不完全明確，部分患者同時合并其它自身免疫疾病，傳統(tǒng)療法具有一定療效，但存在局限性。因此尋找靶向藥物尤為重要。白癜風(fēng)存在一定的免疫學(xué)基礎(chǔ)、大量研究表明細(xì)胞免疫、體液免疫及相關(guān)細(xì)胞因子參與病情活動，其中以細(xì)胞免疫的效應(yīng)較為突出，自身免疫介導(dǎo)的黑素細(xì)胞凋亡一直是關(guān)注的熱點［8］。實驗研究發(fā)現(xiàn)患者外周血及皮損區(qū)IL -1β、IL-6、IL-8、IL-17、及TNF-α等炎癥因子的表達均顯著上調(diào)［9，10］。這些炎癥因子的表達增高，在趨化中性粒細(xì)胞至皮損區(qū)，促進白細(xì)胞與黑素細(xì)胞相互黏附，以及激活細(xì)胞毒T細(xì)胞等過程中發(fā)揮重要作用，從而加速免疫損傷推動疾病發(fā)展的進程。

已知由TLR3介導(dǎo)的T細(xì)胞依賴的B淋巴細(xì)胞激活，導(dǎo)致大量致病相關(guān)性抗體及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而促使黑素細(xì)胞凋亡，是白癜風(fēng)發(fā)病的主要原因之一。新近研究發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞上可以表達功能性的TLRs，且TLR3通過激活NF-κB信號通路介導(dǎo)黑素細(xì)胞的凋亡［11］。TLRs主要表達在免疫細(xì)胞和多種炎癥細(xì)胞表面，如樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DC）、巨噬細(xì)胞和T、B細(xì)胞等，與其相應(yīng)的配體結(jié)合后可以激活中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞，使其分泌大量的炎性細(xì)胞因子和趨化因子，參與活化天然免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答［12］。體內(nèi)外實驗研究發(fā)現(xiàn)抑制TLR3活性后黑素細(xì)胞的凋亡也逐漸減輕。通過轉(zhuǎn)染針對TLR3的ShRNA慢病毒載體，抑制原代培養(yǎng)的黑素細(xì)胞中TLR3的表達。然后用流式細(xì)胞術(shù)檢測下調(diào)TLR3表達黑素細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shTLR3的黑素細(xì)胞受到poly（I：C）刺激后，其凋亡率明顯降低，提示TLR3介導(dǎo)了dsRNA對黑素細(xì)胞的促凋亡效應(yīng)。且TLR3活化后能誘導(dǎo)I型IFN（包括IFN-α和IFN-β）的釋放，而I型IFN可以誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡途徑的激活。臨床治療發(fā)現(xiàn)在一些接受I型干擾素治療的患者中可以發(fā)生白癜風(fēng)，說明TLR3信號通路在白癜風(fēng)的誘發(fā)以及病情活動中可能發(fā)揮一定作用［13］。因此，靶向調(diào)控TLR3受體的功能將有助于調(diào)控黑素細(xì)胞介導(dǎo)的T、B細(xì)胞活化及T細(xì)胞介導(dǎo)的多種免疫應(yīng)答功能，對特異性治療白癜風(fēng)具有重要的理論和臨床意義。氧化苦參堿（Oxymatrine，OMT）具有較好的抗炎和免疫調(diào)節(jié)藥理學(xué)效應(yīng)，且在我們多年臨床用藥中發(fā)現(xiàn)OMT對白癜風(fēng)具有良好的治療作用［14］。在早期實驗中，馮亞珍等［15］通過喂養(yǎng)小鼠實驗發(fā)現(xiàn)OMT在小鼠體內(nèi)具有抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞的免疫功能活性作用。并且最新研究發(fā)現(xiàn)OMT對NF-κB凋亡信號通路具有抑制作用，且其能減少TNF-α、IL-1β等促炎因子的表達［2，14］。

本實驗給黑素細(xì)胞加入一定濃度差的OMT后，黑素細(xì)胞的增殖較對照組顯著提高。RT-qPCR檢測TLR3及NF-κB mRNA則顯示出OMT對其表達產(chǎn)生抑制作用，與熊永愛等研究結(jié)果一致。當(dāng)加入NF-κB特異性激活劑RANK后，由PCR結(jié)果可見NF-κB以及TLR3的測值與空白組表達程度相似，說明OMT參與TLR3-NF-κB凋亡通路變化，并能拮抗RANK作用，靶向抑制細(xì)胞凋亡通路的激活，從而保護黑素細(xì)胞。隨后我們進一步檢測黑素細(xì)胞上清液的情況，IL -6、IL-8、IL-17在OMT加入后表達減少，當(dāng)有RANK存在時，IL-6、IL-8、IL-17檢測值接近空白組，說明IL-6、IL-8、IL-17參與TLR3-NF-κB凋亡通路，受通路正反饋調(diào)節(jié)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用。加入50 μmol/L OMT后的黑素細(xì)胞數(shù)目比對照組顯著增高，且TLR3-NF-κB及相關(guān)炎性細(xì)胞因子表達下降，可見OMT可能是通過抑制TLR3介導(dǎo)的T、B細(xì)胞活化，而抑制IL-6、IL-8、IL-17等炎癥因子的產(chǎn)生，通過阻斷TLR3-NF-κB凋亡通路，抑制黑素細(xì)胞的凋亡，從而保護黑素細(xì)胞。

本研究采用第3代黑素細(xì)胞，觀察到OMT可抑制凋亡通路TLR3-NF-κB及減少相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，可見OMT能靶向調(diào)控黑素細(xì)胞上TLR3受體表達及其信號通路，將有助于從根源上治療自身免疫性白癜風(fēng)，這將是OMT在白癜風(fēng)治療領(lǐng)域的一大進展，但OMT臨床上在何種條件及何種濃度時對白癜風(fēng)患者達到滿意療效，還需進一步的動物及臨床研究證實。

［1］Guerra L，Dellambra E，Brescia S，et al.Vitiligo：pathogenetic hypotheses and targets for current therapies［J］.Curr Drug Metab，2010，11（5）：451-467.

［2］朱道立，王康樂，陳佩林，等.氧化苦參堿對H2O2誘導(dǎo)的L6成肌細(xì)胞凋亡的影響［J］.生物化學(xué)與生物物理進展，2012，39（7）：662-670.

［3］熊永愛，韓麗，王淼.氧化苦參堿對大鼠潰瘍性結(jié)腸黏膜細(xì)胞NF-κB mRNA表達的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2012，23（4）：375-378.

［4］張鳴號，王秀玉，何沿虹.氧化苦參堿對感染性休克大鼠心肌組織細(xì)胞因子的影響［J］.中草藥，2012，43（11）：2242-2246.

［5］熊琦，張里程，張立海.重組人骨保護素與重組核因子κb活化因子受體蛋白對破骨前體細(xì)胞分化的影響［J］.中國骨傷，2013，26（4）：324-327.

［6］Mohammed GF，Gomaa AH，Al-Dhubaibi MS.Highlights in pathogenesis of vitiligo［J］.World JClin Cases，2015，3（3）：221-230.

［7］Patel NS，Paghdal KV，Cohen GF.Advanced treatmentmodalities for vitiligo［J］.Dermatol Surg，2012，38（3）：381-391.

［8］Kumar R，Parsad D.Melanocytorrhagy and apoptosis in vitiligo：connecting jigsaw pieces［J］.Indian JDermatol Venereol Leprol，2012，78（1）：19-23.

［9］孫巖，錢立.白癜風(fēng)患者治療前后血清IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α水平［J］.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，36（3）：283-285.

［10］汪孌，楊慧蘭，樊建勇.白癜風(fēng)患者外周血中IL-17和IL-23檢測的臨床意義［J］.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2010，10（5）：591 -592.

［11］Laddha NC，DwivediM，MansuriMS，et al.Vitiligo：interplay between oxidative stress and immune system［J］.Exp Dermatol，2013，22（4）：245-250.

［12］Webb KC，Eby JM，Hariharan V，et al.Enhanced bleaching treatment：opportunities for immune assisted melanocyte suicide in vitiligo［J］.Exp Dermatol，2014，23（8）：529-533.

［13］Tomasiewicz K，Modrzewska R，Semczuk G.Vitiligo associated with pegylated interferon and ribavirin treatment of patients with chronic hepatitis C：a case report［J］.Adv Ther，2006，23（1）：139-142.

［14］吳琴，高云.氧化苦參堿藥理作用的分子機制研究進展［J］.中國藥理學(xué)通報，2015，31（6）：759-762.

［15］馮亞珍，周蓉.苦參調(diào)節(jié)免疫功能的實驗研究［J］.中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，1998，12（2）：192-193.

（收稿：2015-12-05 修回：2016-01-05）

Influence of oxymatrine on themelanocyte proliferation and inflammation factor autocrine

LUO Hong，F(xiàn)AN Yingji，WANG Haibo，WANG Juan，ZHANG Yan，DU Qian. Chenzhou 3rd People's Hospital，Hunan 423000，China

LUO Hong，E-mail：3602677@qq.com

Objective：To determine the influence of oxymatrine（OMT）on the melanocyte proliferation and inflammation factor autocrine.M ethods：The cultured melanocytes were divided into blank group and oxymatrine groups with different concentrations（10μmol/L，50μmol/L and 100μmol/L）.The proliferation ofmelanocyte，mRNA of TLR3 and NF-κB and the expression of IL-6，IL-8 and IL-17 were detected by MTT method，RT-qPCR and ELISA respectively.Results：Absorbance values of the melanocytes in oxymatrinegroupswere higher than that in control group，in a concentration-dependentmanner.The proliferation rate reached a plateau when OMT concentration reached up to 50μmol/L.The expression of TLR3 and NF-κBmRNA and the proteins of IL-6，IL-8，IL-17 in OMT groups were significantly lower than those in control group（P<0.05）.Conclusion：OMT can increase the proliferation ofmelanocyte，down-regulate the expression of TLR3 and NF-κB mRNA and the protein of IL-6，IL-8 and IL-17.

oxymatrine?melanocyte?TLR3?NF-κB

湖南省衛(wèi)生廳科研計劃項目（編號：C2014-59）郴州市科技局計劃項目（編號：CZ201314502）

郴州市第三人民醫(yī)院，湖南郴州，423000

☆現(xiàn)工作單位：長沙市第一人民醫(yī)院，410005

羅宏，E-mail：3602677@qq.com