彭樹英，賈魏珉，謝遇春，李　雯，魏　樂①（淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮北 235000）

可視化LAMP鑒定冬蟲夏草方法的研究

彭樹英，賈魏珉，謝遇春，李雯，魏樂
①
（淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮北 235000）

為建立可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）鑒定冬蟲夏草的方法，根據(jù)冬蟲夏草csp2（serine protease-2）基因設(shè)計(jì)引物，采用CTAB法提取亞香棒蟲草，古尼蟲草和冬蟲夏草的基因組DNA.并在LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行特異性和靈敏度檢測.在LAMP產(chǎn)物中加入CuSO4或SYBR Green I核酸染料.結(jié)果表明，經(jīng)優(yōu)化最適反應(yīng)溫度為65℃，最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min.電泳結(jié)果顯示，該法可特異性檢測出蟲草真?zhèn)危潇`敏度檢測限為6.34 pg/mL.反應(yīng)結(jié)束后，添加SYBR Green I，在紫外燈下進(jìn)行觀察陽性管呈明顯的綠色熒光.加CuSO4后，在可見光下進(jìn)行觀察，陰性管中有藍(lán)色環(huán)狀沉淀.因此，本研究建立的可視化LAMP為鑒定冬蟲夏草真?zhèn)翁峁┝艘环N參考方法.

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；冬蟲夏草；可視化檢測

0　引言

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis（Brek）Sacc）是一種傳統(tǒng)的珍貴滋補(bǔ)中藥材，它寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上，是一種麥角真菌復(fù)合體，可以改善免疫系統(tǒng)，具備提高免疫、抗疲勞等多種功效.因?yàn)橄x草藥用價(jià)值較高，并且近幾年來，冬蟲夏草野生資源消減，產(chǎn)量逐年下降，人工培育冬蟲夏草市場前景越來越好，就導(dǎo)致了偽冒品擾亂市場，因此冬蟲夏草的快速簡單有效的檢測變得尤為重要.迄今為止，冬蟲夏草檢測方法包括分離培養(yǎng)、子實(shí)體人工誘發(fā)和PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析等多種方法.這些方法由于用時(shí)長、靈敏度不高、操作繁雜、檢測成本高等原因而不適于推廣.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-medi?ated isotherma amplification，LAMP）技術(shù)是在60～65℃條件下進(jìn)行的自動(dòng)循環(huán)的鏈置換核酸擴(kuò)增和核酸變性反應(yīng)，整個(gè)反應(yīng)僅在水浴鍋中十幾分鐘便可完成.該方法具備靈敏性高、操作簡便快速、低成本等優(yōu)勢，已在很多領(lǐng)域得到推廣.

傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳法雖然電泳圖譜清晰，重復(fù)性好，可是分辨率和靈敏度都不高，并且不能辨別片段差異比較小的片段，更主要的是染料有毒，極易對人體造成傷害.在傳統(tǒng)LAMP技術(shù)的基礎(chǔ)上，很多研究者［1-6］嘗試對LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行可視化檢測.可視化LAMP檢測方法具有快速、簡便和更加精準(zhǔn)的優(yōu)勢，不需特殊儀器進(jìn)行更多繁雜的操作，只需用肉眼在日光下或紫外燈下觀察就可判斷結(jié)果.本研究除對LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化以及對特異性和敏感性的檢測外，并嘗試應(yīng)用SYBR GreenⅠ染料和硫酸銅進(jìn)行可視化檢測.

1　材料與方法

1.1主要材料

冬蟲夏草Cordyceps sinensis（Brek）Sacc（產(chǎn)地青海）購自淮北醫(yī)藥大廈，亞香棒蟲草Cordyceps hawke?sii，古尼蟲草Cordyceps Gunnii（產(chǎn)地貴州）購自廣西網(wǎng)店.

1.2主要試劑

植物基因組DNA提取試劑盒（快速型）、RNA酶、λDNA HindⅢ、D2000 marker、500 mL TBE緩沖液、2.5 mmol/L dNTP、Loading buffer、ddH2O購自天根生化科技（北京）有限公司；8 U/μL Bst DNA聚合酶購自NEB公司；SYBR GreenⅠ購自Invitrogen；其他常規(guī)試劑購于上海國藥集團(tuán).

引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成.

1.3LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成

登陸GenBank查找冬蟲夏草csp2基因序列（基因序列號：EU282382.1），再將此基因?qū)隠AMP在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http：//primerexplorer.jp/e/），并根據(jù)保守序列用V3和V4軟件設(shè)計(jì)LAMP的特異性引物.序列見表1.

表1LAMP引物序列

1.4CTAB法提取DNA

10 mL CTAB溶液配方如下：3%（w/v）的CTAB，100 mmol/L Tris-HCl和20 mmol/L EDTA溶液，1.4 mmol/L NaCl溶液，1%（w/v）的PVP，0.2%的（v/v）β-巰基乙醇.

基因組DNA的提取采用CTAB方法（參照文獻(xiàn)［7-8］）.

1.5DNA純度的測定

將所提取的DNA用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行濃度純度測定，并電泳觀察.

1.6LAMP反應(yīng)體系

參照相關(guān)文獻(xiàn)［9-10］選取25 μL反應(yīng)體系：10 mmol/L dNTP 2.5 μL，10×buffer 2.5 μL，內(nèi)引物BIP和FIP 各1.6 μmol，外引物F3和B3各0.2 μmol，25 mmol/L MgCl24 μL，基因組DNA為1 μL，8 U/μL Bst DNA聚合酶1 μL，最后用ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)體積.

反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min；快速取出反應(yīng)管放入冰盒中，加1 μL Bst DNA聚合酶大片段混勻離心，選擇擴(kuò)增溫度為65℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)60 min；再加熱到80℃，10 min后結(jié)束反應(yīng).

1.7LAMP靈敏度檢測

參照文獻(xiàn)［10～12］進(jìn)行靈敏度檢測，取1 μL DNA基因組，用ddH2O對模板進(jìn)行如下稀釋：1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，然后進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，并將產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，確定檢測范圍.

1.8LAMP產(chǎn)物可視化的鑒定

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中可形成焦磷酸鎂的可見沉淀，即用肉眼就可直接看到陽性反應(yīng)管中有混濁產(chǎn)生，但人眼睛的敏感性差異不同，渾濁程度不易判定，所以可進(jìn)一步添加指示劑使檢測更加精準(zhǔn).本研究所用指示劑為SYBR GreenⅠ和CuSO4進(jìn)行檢測，在自然光下或紫外燈下觀察顏色的變化，從而進(jìn)行鑒定蟲草的真?zhèn)?

1.8.1用SYBR GreenⅠ進(jìn)行檢測

將SYBR GreenⅠ按1：3 000稀釋，然后取50 μL，將LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL加入到50 μL溶液中，充分混勻.在紫外光下觀察顏色變化.

1.8.2用CuSO4進(jìn)行檢測

直接將1 μL CuSO4加入到LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中，充分混勻，即可自然光下觀察顏色變化.

2　結(jié)果

2.1基因組DNA提取結(jié)果

用超微量分光光度計(jì)對用CTAB法提取的DNA基因組織進(jìn)行濃度和純度的檢測，其結(jié)果見表2.

表23種蟲草DNA測定

表2數(shù)據(jù)顯示，本研究提取的DNA的A260/A280比值均高于2.0，可能由于DNA降解成小片段或者RNA污染造成數(shù)值較高.一般A260/A230的數(shù)值為2.0～2.5時(shí)純度較高，冬蟲夏草子座和蟲體的A260/A230數(shù)值為2.0左右，但古尼蟲草和亞香棒蟲草均小于2.0，說明DNA樣品可能被碳水化合物或有機(jī)溶劑污染.

電泳結(jié)果表明（圖1），冬蟲夏草蟲體和子座DNA提取較理想，稍有降解，出現(xiàn)彌散條帶.并且兩次提取的亞香棒蟲草在圖中顯示均有兩條異常的條帶，分析原因是被RNA污染.而古尼蟲草基因組降解嚴(yán)重，無明顯DNA條帶.

1冬蟲夏草蟲體；2冬蟲夏草子座；3，5亞香棒蟲草；4，6古尼蟲草；7 λHindⅢMarker圖1蟲草基因組電泳結(jié)果

2.2LAMP法反應(yīng)結(jié)果

LAMP反應(yīng)結(jié)束后，用2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示，可以清楚地分辨冬蟲夏草真?zhèn)?，即從圖片顯示，只有具有與引物相同序列的冬蟲夏草子座和蟲體才有條帶，古尼蟲草和亞香棒蟲草并無條帶，證明LAMP法檢測冬蟲夏草具有特異性.

1 Marker；2冬蟲夏草子座；3冬蟲夏草蟲體；4亞香棒蟲草；5古尼蟲草圖2LAMP反應(yīng)結(jié)果

2.3LAMP靈敏度檢測結(jié)果

LAMP靈敏度檢測結(jié)果如圖3，圖中顯示1～3泳道有條帶，說明當(dāng)冬蟲夏草的濃度稀釋到10-2時(shí)依然可以擴(kuò)增DNA，但是當(dāng)模板濃度稀釋到10-3時(shí)未出現(xiàn)任何條帶.由此可見LAMP反應(yīng)體系的靈敏度可以達(dá)到10-2，即檢出限為6.34 pg/mL.

1 D2000；2～10模板濃度稀釋到1～10-8圖3　LAMP靈敏度檢測

2.4用SYBR GreenⅠ的檢測結(jié)果

研究顯示LAMP反應(yīng)后若有核酸產(chǎn)物生成，那么就可以激發(fā)核酸染料SYBR GreenⅠ產(chǎn)生熒光，而從圖4顯示陽性管即冬蟲夏草子座和蟲體在紫外光下都有綠色熒光，說明冬蟲夏草子座和蟲體在LAMP反應(yīng)后目的基因被擴(kuò)增，即有核酸產(chǎn)生.陰性管古尼蟲草和亞香棒蟲草均無綠色熒光，說明無核酸擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生.

1冬蟲夏草蟲體；2冬蟲夏草子座；3亞香棒蟲草；4古尼蟲草；5空白對照圖4　SYBR GreenⅠ可視化檢測結(jié)果

1冬蟲夏草；2古尼蟲草；3亞香棒蟲草；4空白對照圖5　用CuSO4可視化檢測結(jié)果

2.5用CuSO4的檢測結(jié)果

從圖5顯示，陰性管即古尼蟲草和亞香棒蟲草均有藍(lán)色環(huán)狀沉淀，而冬蟲夏草無沉淀形成.

3　討論

Bst DNA聚合酶具有在等溫條件下數(shù)十分鐘內(nèi)可大量擴(kuò)增靶基因序列的特點(diǎn)，LAMP就是利用這個(gè)原理僅數(shù)十分鐘內(nèi)利用恒溫水浴鍋就可將靶基因擴(kuò)增數(shù)十倍，這樣就避免了傳統(tǒng)PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)的繁雜操作，而用LAMP法擴(kuò)增目標(biāo)基因簡單，用時(shí)短，整個(gè)反應(yīng)僅僅需要一個(gè)恒溫水浴鍋，更適用于基層臨床.并且本研究靈敏度達(dá)到了6.34 pg/mL的檢測限，即具有很高的靈敏度，與李奎等［10］研究結(jié)果相近.隨著LAMP的可視化檢測越來越簡便多樣，LAMP法將替代傳統(tǒng)PCR并逐漸被普遍推廣利用.

對產(chǎn)物的檢測，傳統(tǒng)的方法都是應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳法，即觀察反應(yīng)產(chǎn)物有沒有特征性梯形條帶，而本研究是在產(chǎn)物中加入指示劑和熒光染料，用肉眼或在紫外光下直接觀察，判定結(jié)果.因?yàn)長AMP反應(yīng)結(jié)束后大量的擴(kuò)增產(chǎn)物可與核酸染料SYBR GreenⅠ結(jié)合激發(fā)熒光，因?yàn)橛辛撕怂岬漠a(chǎn)生，所以才會激發(fā)產(chǎn)生熒光，使產(chǎn)物在紫外光下呈現(xiàn)綠色，所以用SYBR GreenⅠ檢測陽性管中在紫外光下呈綠色，陰性管無顏色，間接證明冬蟲夏草基因被指數(shù)擴(kuò)增.當(dāng)LAMP產(chǎn)物中仍存在大量dNTP時(shí)，則dNTP可與之后加入的CuSO4反應(yīng)生成沉淀［4］.而本研究用CuSO4檢測結(jié)果顯示，陰性管中先有藍(lán)色環(huán)狀沉淀，幾分鐘后即出現(xiàn)大片霧狀沉淀，表明古尼蟲草和亞香棒蟲草在LAMP后仍有大量dNTP沒有被消耗，間接說明反應(yīng)并無核酸產(chǎn)生，即目的基因沒有被擴(kuò)增.

上述兩種可視化檢測方法雖然結(jié)果精準(zhǔn)，操作簡便，但是LAMP產(chǎn)物是開管檢測，若是在LAMP靈敏度很高的情況下，開管檢測就極易檢測到環(huán)境中的反應(yīng)產(chǎn)物氣溶膠，而造成結(jié)果假陽性影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果［5］.而閉管檢測，就可以避免使反應(yīng)產(chǎn)物形成氣溶膠污染環(huán)境.故開管檢測也是本研究的一個(gè)弊端所在.

綜上所述，冬蟲夏草的可視化鑒定還需要進(jìn)一步尋找更加高效的檢測試劑，從而避免開管檢測.本研究不僅建立了冬蟲夏草的LAMP的檢測方法，而且實(shí)現(xiàn)了對反應(yīng)體系的優(yōu)化、特異性檢測和靈敏度檢測.更重要的是實(shí)現(xiàn)了冬蟲夏草的可視化檢測，結(jié)果顯示，可視化LAMP更適合在基層進(jìn)行冬蟲夏草的真?zhèn)闻卸?

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Visual Identification of Cordyceps Sinensis with LAMP

PENG Shuying，JIA Weimin，XIE Yuchun，LI Wen，WEI Le
（School of Life Science，Anhui Province Key Laboratory of Resources and Biology，Huaibei Normal University，235000，Huaibei，Anhui，China）

In order to establish a visual identification method of Cordyceps sinensis by loop-mediated isother?mal amplification method，we designed primer with csp2 gene of Cordyceps sinensis.We used the method of CTAB to extract DNA of Cordyceps sinensis，Cordyceps gunnii and Cordyceps hawkesiiwas，checked LAMP spe?cific to positive product at the basic of optimizing LAMP reaction system，then detected sensitivity with 10 fold dilution of DNA template.We added CuSO4into the product of LAMP directly，or added 1 μL LAMP product into diluted（1：3000）SYBR Green I solution.The results show that the optimum temperature is 65℃，and the best reaction time is 60 minutes.After adding 1μL LAMP product into SYBR Green I，the nega?tive tube showed in green fluorescence phenomenon under the UV light.After adding CuSO4，the negative tube showed in white precipitate ring phenomenon under the visible light.Therefore，this paper provides an identification method with visual LAMP for Cordyceps sinensis rapidly.

LAMP；Cordyceps sinensis（Brek）Sacc；visual detection

Q 949.95

A

2095-0691（2016）02-0031-05

2015-11-23

資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（ZYZWSW2014017）；安徽省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2010B195）

彭樹英（1977-），女，內(nèi)蒙古通遼市人，博士，副教授，主要從事發(fā)育遺傳學(xué)研究.