趙卓杰　胡雅茜　楊柳　羅卓荊

·實驗研究論著·

血清中骨質(zhì)疏松相關(guān)蛋白分子標(biāo)志物的篩選研究

趙卓杰胡雅茜楊柳羅卓荊

目的通過蛋白芯片篩選血清中反映早期絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生、發(fā)展的標(biāo)志性分子。方法3月齡雌性SD大鼠20只，隨機(jī)分為卵巢切除（ovariectomized，OVX）組和假手術(shù)（sham operation，Sham）組，每組10只，分別進(jìn)行卵巢去勢手術(shù)和假手術(shù)處理。術(shù)后2、4、6、8周對兩組大鼠進(jìn)行活體顯微CT掃描，測量股骨遠(yuǎn)端骨密度及相關(guān)松質(zhì)骨形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)；同時經(jīng)內(nèi)眥靜脈取血，利用蛋白芯片檢測血清中不同蛋白因子的含量。結(jié)果顯微CT檢測結(jié)果顯示OVX組大鼠骨密度（BMD）、相對骨體積（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）從第4周開始下降，骨小梁分離度（Tb.Sp）開始上升，Sham組未見明顯變化；到第8周各指標(biāo)在OVX組與Sham組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。蛋白芯片檢測結(jié)果顯示OVX組中干擾素?γ（IFN?γ）、β神經(jīng)生長因子（b?NGF）分別從術(shù)后4周和6周后開始升高，同Sham組比較均至第8周具有明顯差異（P＜0.05）。結(jié)論IFN?γ和b?NGF水平在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松早期開始增高，可考慮作為診斷早期絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的新型蛋白分子。

大鼠；骨質(zhì)疏松；早期診斷；干擾素γ；神經(jīng)生長因子類

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，以骨質(zhì)脆性增加為臨床表現(xiàn)的全身性骨代謝性疾病［1］。骨質(zhì)疏松可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類：原發(fā)性骨質(zhì)疏松是指不伴引起本病的其他疾患而發(fā)生的骨質(zhì)疏松，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和老年性骨質(zhì)疏松是原發(fā)性骨質(zhì)疏松的主要類型；繼發(fā)性骨質(zhì)疏松則是指由任何影響骨代謝的疾病、藥物或器官移植等引起的骨質(zhì)疏松。此外，按發(fā)生部位亦可分為局限性或泛發(fā)性骨質(zhì)疏松。骨質(zhì)疏松發(fā)病率位于中老年骨科常見病之首［2］，我國是骨質(zhì)疏松患者最多的國家，并且隨著人均預(yù)期壽命的延長，其發(fā)病率將不斷上升［3］。骨質(zhì)疏松不僅是嚴(yán)重危害我國人民健康的公共衛(wèi)生問題，其高昂的治療費用也給國家和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，加深對骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識，尋找影響其發(fā)病的關(guān)鍵因子，探索可能的早期干預(yù)靶點和干預(yù)方式，將成為骨質(zhì)疏松的研究熱點。

雙能X線骨吸收測量儀（DXA）測定骨密度（BMD）是目前臨床診斷骨質(zhì)疏松的金標(biāo)準(zhǔn)［4］，但此方法存在儀器攜帶困難、檢測費用高昂等缺點，其結(jié)果只能反映單位投影面積的骨礦鹽含量，無法提示骨基質(zhì)和骨組織的微結(jié)構(gòu)狀況，因而無法區(qū)分骨質(zhì)軟化、局部骨質(zhì)破壞和骨質(zhì)疏松；此外，用骨密度評價治療反應(yīng)的周期至少需要半年［5］。因此尋找便捷、經(jīng)濟(jì)的骨質(zhì)疏松檢測方法成為目前研究的熱點。

蛋白芯片技術(shù)是一種高通量、微型化和自動化的蛋白質(zhì)分型技術(shù)，其依據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，首先以生物素標(biāo)記樣本中的蛋白，然后加入捕獲抗體，再加入鏈親和素，通過掃描獲得熒光值，從而實現(xiàn)對相關(guān)蛋白的定量檢測［6］。利用蛋白組學(xué)技術(shù)環(huán)磷酰胺（CTX）和Ⅰ型膠原氨基端前肽（PINP）等可作為骨形成和骨吸收特異性標(biāo)記物的蛋白因子陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)［7］。近年來隨著蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了一些新的骨代謝特異性血清標(biāo)志物，如優(yōu)先定位于骨膜組織的蛋白骨膜素［8，9］、鞘氨醇-1-磷酸［10］、血清組織蛋白酶K［11］、DKK?1［12］、硬化蛋白［13］和FGF?23［14］，這些生物標(biāo)志物和絕經(jīng)后婦女、老年男性骨折風(fēng)險均有關(guān)聯(lián)。研究表明循環(huán)微小RNA也可以作為新的骨質(zhì)疏松生物標(biāo)志物［15］。但上述血清標(biāo)記物在骨質(zhì)疏松發(fā)生早期的變化尚未明確［2］。

本研究選擇的RayBiotech蛋白芯片已被應(yīng)用于臨床研究，Huang等［16］曾對卵巢癌人群及正常人群進(jìn)行血清檢測，篩選出6個區(qū)分卵巢癌患者和健康人群的生物標(biāo)志物；Ray等［17］則對阿爾茲海默病組和健康對照組進(jìn)行血清檢測，篩選出18個區(qū)分阿爾茲海默病和健康人群的蛋白分子。這都顯示利用該蛋白芯片可能篩選出對早期骨質(zhì)疏松診斷有效的生物標(biāo)志物。因此，本研究的目的是采用蛋白組學(xué)技術(shù)篩選絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病早期血清中含量發(fā)生顯著性變化的蛋白標(biāo)志物，為便捷、經(jīng)濟(jì)地診斷早期骨質(zhì)疏松癥提供新的可能。

材料與方法

一、實驗動物

清潔級3月齡健康雌性SD大鼠20只，體重平均為（293±20）g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。

二、實驗儀器

熒光掃描儀（Genepix4100A，Molecular Devices公司，美國）、顯微CT（Inveon，Siemens公司，德國）、離心機(jī)（55415D，Eppendorf）、-80℃冰箱（DW?86L386，海爾，青島）、電熱恒溫孵育箱（DPX?9052B?1，?，?，上海）。

三、試劑

樣品稀釋液、20×洗液Ⅰ、20×洗液Ⅱ、標(biāo)準(zhǔn)品混合物、檢測抗體混合物、Cy3?鏈酶親和素、玻片清洗干燥器、大鼠細(xì)胞因子定量抗體芯片（QAR?CYT?3），以上物品均由美國RayBiotech公司提供。

四、實驗步驟

（一）實驗動物分組

本研究的20只SD大鼠按隨機(jī)表法隨機(jī)分為卵巢切除（ovariectomized，OVX）組和假手術(shù)（sham op?eration，Sham）組，每組10只。所有大鼠均在室溫20℃～25℃、相對濕度60%～80%的清潔環(huán)境中，分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

（二）骨質(zhì)疏松模型建立

OVX組：2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，俯臥位固定，常規(guī)備皮、消毒，分別在腹背部肋緣下1 cm、脊柱兩側(cè)各1.5 cm交界處，切2個約1 cm切口，進(jìn)入腹腔，尋找并切除雙側(cè)卵巢。術(shù)后每只大鼠肌注青霉素40萬U/d、連續(xù)3 d，預(yù)防感染。Sham組：不切除雙側(cè)卵巢、僅切除卵巢周圍等體積的脂肪，其他處理與OVX組相同。

（三）血清樣本提取

對兩組大鼠于卵巢切除術(shù)后2、4、6、8周采用內(nèi)眥靜脈取血法取血1.5 ml存于EP管中，各批血液標(biāo)本在4℃冰箱內(nèi)靜置4 h后離心5 min（3 000 r/min），提取血清，保存于-80℃冰箱備用。

（四）顯微CT檢測

卵巢切除術(shù)后2、4、6、8周利用顯微CT掃描兩組活體大鼠股骨。掃描方法：對大鼠采用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，而后固定掃描。掃描結(jié)束后，選取股骨遠(yuǎn)端位置相同體積的感興趣區(qū)域（ROI）、設(shè)定骨的閾值（閾值=1 200），利用In?veon Research Workplace 2.2軟件（Inveon，Siemens公司，德國）進(jìn)行骨小梁的三維重建及相關(guān)結(jié)構(gòu)參數(shù)的計算。

（五）蛋白芯片檢測

①按照說明書中的方法梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；②抽取100 μl的樣品稀釋液作為陰性對照；③向芯片各孔中加入100 μl的樣品稀釋液，室溫震蕩孵育1 h以封閉定量抗體芯片；④抽去各孔中的緩沖液，并添加100 μl樣品，4℃震蕩孵育過夜；⑤按說明書中的方法對各孔進(jìn)行清洗，離心檢測抗體混合物小管，然后加入1.4 ml樣品稀釋液，混合均勻后快速離心；⑥各孔添加80 μl檢測抗體，室溫震蕩孵育2 h；⑦清洗各孔后，向各孔中添加80 μl Cy3?鏈霉親和素，室溫條件下避光、震蕩孵育1 h；⑧清洗各孔后，將芯片放置于芯片清洗管中，添加30 ml洗液Ⅰ，室溫震蕩15 min，棄去洗液Ⅰ，添加30 ml洗液Ⅱ，室溫震蕩5 min；⑨去除洗液，將芯片放置于芯片干燥管中，按1 000 r/min離心3 min；⑩利用熒光掃描儀獲取信號，QAR?CYT?3的數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件（SPSS公司，美國）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有計量數(shù)據(jù)均用表示。OVX組與Sham組間的骨密度、松質(zhì)骨形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)和蛋白芯片結(jié)果比較均采用單因素重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析；OVX組大鼠骨密度與陽性因子采用相關(guān)性分析。P＜0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　OVX組與Sham組大鼠各時間點股骨遠(yuǎn)端BMD值，mg/cm2）

表1　OVX組與Sham組大鼠各時間點股骨遠(yuǎn)端BMD值，mg/cm2）

注：與同時間點的Sham組比較*P＜0.05；組內(nèi)與第2周末比較△P＜0.05

組別OVX組Sham組n 10 10 2周末453.7±3.7 457.3±3.8 4周末396.3±4.0*△457.7±2.5 6周末385.0±2.0*△458.3±3.5 8周末335.7±4.1*△456.0±5.3

表2　OVX組與Sham組大鼠各時間點松質(zhì)骨形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)情況）

表2　OVX組與Sham組大鼠各時間點松質(zhì)骨形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)情況）

注：與同時間點的Sham組比較*P＜0.05；組內(nèi)與第2周末比較△P＜0.05

參數(shù)BV/TV（%）Tb.Th（mm）Tb.N（mm）Tb.Sp（mm）組別OVX組Sham組OVX組Sham組OVX組Sham組OVX組Sham組n 10 10 10 10 10 10 10 10 2周末0.372±0.034 0.393±0.029 0.121±0.012 0.119±0.005 3.483±0.181 3.163±0.136 0.205±0.022 0.192±0.016 4周末0.265±0.009*△0.381±0.010 0.085±0.022*0.129±0.005 3.180±0.187 3.233±0.163 0.246±0.034 0.189±0.014 6周末0.185±0.002*△0.376±0.023 0.062±0.001*△0.130±0.002 2.847±0.125*△3.240±0.101 0.282±0.010*△0.187±0.011 8周末0.083±0.039*△0.377±0.025 0.049±0.005*△0.128±0.008 1.657±0.607*△3.210±0.215 0.478±0.142*△0.199±0.011

結(jié)果

一、骨密度與松質(zhì)骨形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)檢測

卵巢切除后2、4、6、8周四個時間點對各組大鼠股骨進(jìn)行掃描，如表1所示，OVX組大鼠骨密度從第4周開始逐漸減少，BMD值為（396.3±4.0）mg/cm2，第8周明顯降低，BMD值為（335.7±4.1）mg/cm2（圖1）；Sham組未見明顯變化（圖2）。OVX組與Sham組相比骨密度下降差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.012，圖3）。另外，如表2所示，OVX組大鼠松質(zhì)骨形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)在相對骨體積（BV/TV）（P=0.000）、骨小梁厚度（Tb.Th）（P=0.001）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）（P= 0.014）較Sham組均有降低；OVX組大鼠骨小梁分離度（Tb.Sp）較Sham組明顯增高（P=0.037，圖4）。

二、蛋白芯片結(jié)果

蛋白芯片共檢測6個蛋白分子，包括干擾素γ （IFN?γ）、B神經(jīng)生長因子（b?NGF）、白細(xì)胞介素1b （IL?1b）、白細(xì)胞介素4（IL?4）、腫瘤壞死因子a（TN?Fa）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等。如表3所示，OVX組大鼠血清中b?NGF濃度從第6周開始升高，到第8周升高顯著，與Sham組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.014）；IFN?γ含量從第4周開始升高，到第8周升高顯著，與Sham組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.001，圖5）。所檢測其他蛋白分子含量未見明顯差異（P＞0.05，圖6）。

三、OVX組大鼠骨密度與陽性因子相關(guān)性分析

根據(jù)OVX組大鼠骨密度變化結(jié)果和IFN?γ、b?NGF變化結(jié)果做骨密度與IFN?γ、b?NGF的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)骨密度與IFN?γ（P=0.045）、b?NGF（P= 0.034）均可見顯著性相關(guān)（圖7）。

討論

本研究利用蛋白組學(xué)方法，檢測骨質(zhì)疏松模型大鼠及正常大鼠的血清學(xué)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)IFN?γ和b?NGF兩項指標(biāo)在實驗組與對照組中存在顯著差異。通過對四個時間點骨密度、松質(zhì)骨形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)和蛋白芯片的數(shù)據(jù)觀測發(fā)現(xiàn)，隨著時間的推移，OVX組大鼠骨密度、BV/TV、Tb.Th和Tb.N逐漸降低；Tb.SP逐漸增大；而血清中IFN?γ和b?NGF濃度分別在第4、6周開始升高；相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)OVX組大鼠骨密度變化趨勢與血清中IFN?γ和b?NGF濃度變化趨勢具有一定相關(guān)性。這表明IFN?γ和b?NGF可能與早期骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展有密切聯(lián)系。而IFN?γ和b?NGF含量在大鼠卵巢切除術(shù)后4周開始出現(xiàn)變化，這表明IFN?γ和b?NGF與其他因子相比在診斷早期骨質(zhì)疏松方面具有優(yōu)勢。

圖1　OVX組大鼠顯微CT片　a～d：術(shù)后2、4、6、8周矢狀面圖；e～h：術(shù)后2、4、6、8周橫截面圖；均可見骨小梁逐漸開始斷裂，排列逐漸稀疏，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性差，說明大鼠骨密度逐漸下降

IFN?γ由活化T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生。它具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤特性。有研究表明免疫衰老引起的雌激素含量改變可使IFN?γ含量改變［18］。而IFN?γ和TNF?α可以激活NF?κB通路，導(dǎo)致破骨細(xì)胞凋亡的減少和骨吸收增加［19］。通過全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)包括IFN?γ在內(nèi)的一些基因可能對成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞起重要作用；IFN?γ還在老年婦女中有助于骨表型和Ⅱ類MHC表達(dá)，從而在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過程中起作用［20］；有文獻(xiàn)報道其與脊柱關(guān)節(jié)病如骶髂關(guān)節(jié)炎、軸向不動和周邊關(guān)節(jié)病有關(guān)［21］。IFN?γ可能通過炎癥反應(yīng)參與骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展［22］。b?NGF是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一，對調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化、存活及損傷神經(jīng)的再生修復(fù)具有重要作用，并且參與維持神經(jīng)、免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)之間的平衡。針對b?NGF的研究工作自Levi?Montalcini和Humburg發(fā)現(xiàn)起至今已有50余年，多用于外周神經(jīng)損傷、周圍神經(jīng)病、視神經(jīng)損傷和阿爾茨海默病等疾病的治療［23］。免疫衰老引起的雌激素含量改變可使b?NGF含量改變［18］。b?NGF可能通過免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)參與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展。故IFN?γ和b?NGF既參與骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展，亦可由免疫衰老引起的雌激素含量改變而改變。

圖3OVX組與Sham組大鼠骨密度變化對比圖　可見OVX組大鼠骨密度隨時間變化而逐漸降低，到第8周骨密度降幅超過25%，而Sham組大鼠骨密度未見明顯變化

圖4　OVX組與Sham組大鼠松質(zhì)骨形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)變化對比圖　OVX組大鼠BV/TV（a）、Tb.Th（b）、Tb.N（c）從第4周開始明顯下降，而Sham組未見明顯變化；OVX組大鼠Tb.SP（d）從第4周開始增大，從第6周開始增大明顯，而Sham組未見明顯變化

圖5　陽性蛋白因子對比圖　OVX組IFN?γ（a）從第4周開始升高，到第8周顯著增高，Sham組未見明顯變化；OVX組b?NGF（b）從第6周開始升高，到第8周顯著增高，Sham組未見明顯

表3OVX組與Sham組大鼠各時間點血清IFN?γ、b?NGF情況

，pg/ml）

注：與同時間點的Sham組比較*P＜0.05；組內(nèi)與第2周末比較△P＜0.05

圖6　陰性蛋白因子對比圖　a為TNFa；b為VEGF；c為IL?1b；d為IL?4；上述4個因子在OVX組與Sham組之間未見明顯差異

圖7　OVX組大鼠骨密度與陽性因子相關(guān)性分析圖　a、b分為骨密度與b?NGF、IFN?γ相關(guān)性分析結(jié)果，可見骨密度與b?NGF、IFN?γ有一定負(fù)性相關(guān)性

本研究主要利用蛋白芯片技術(shù)，篩選血清中與早期骨質(zhì)疏松發(fā)病相關(guān)的蛋白因子。由于樣本量有限，檢測的血清生物學(xué)指標(biāo)較少，血清標(biāo)本反復(fù)凍融等原因，此次所檢測出的因子對臨床的指導(dǎo)意義還有待進(jìn)一步的研究驗證。下一步研究將增加所檢測的血清生物學(xué)指標(biāo)，擴(kuò)大樣本量，并通過骨質(zhì)疏松患者血清進(jìn)一步驗證所得因子，最終的目標(biāo)是制備出應(yīng)用于臨床診斷早期骨質(zhì)疏松的便捷、經(jīng)濟(jì)的蛋白芯片，為臨床診斷早期骨質(zhì)疏松癥提供一種新的思路和手段。

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Screening of osteoporosis?related protein markers in serum.

ZHAO Zhuojie，HU Yaqian，YANG Liu，LUO Zhuojing.Department of Orthopaedics，Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China

LUO Zhuojing，E?mail：zjluo@fmmu.edu.cn

ObjectiveTo screen the serum markers which can reflect the development of early stage of postmenopausal osteoporosis through protein chip.MethodsTwenty 3?month?old female SD rats were ran?domly divided into sham operation control group（Sham）and ovariectomy group（OVX），n=10 each.The bone mineral density（BMD）of distal femur and dynamic parameters of cancellous bone morphology of the two groups were measured by micro CT at the end of 2，4，6，8 weeks after operation.The blood of the two groups was taken from angular vein at the same time.The protein microarray was used to detect the concentration of 27 protein factors.ResultsMicro?CT examination showed that BMD，BV/TV，Tb.Th，Tb.Sp in OVX group began to de?crease and Tb.N began to increase at the end of 4 weeks，but there were no obvious changes in Sham group. There was significant difference between OVX and Sham groups by 8th weeks（P＜0.05）.Through the detection of protein chip we found that IFN?gamma in OVX group increased at 4th week and b?NGF increased at 6th week after operation，and there was significant difference between OVX and Sham groups by 8th weeks（P＜0.05）.ConclusionThe concentrations of IFN?gamma and b?NGF began to increase at the early stage of post?menopausal osteoporosis.Both of them are likely to be used as new type of molecular markers in the diagnosis of the early stage of postmenopausal osteoporosis.

Rats；Osteoporosis；Early diagnosis；Interferon?gamma；Nerve growth factors

10.3969/j.issn.1674?8573.2016.02.010

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2011CB964703）

710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科

羅卓荊，E?mail：zjluo@fmmu.edu.cn

（2015?11?03）