高志奎，劉　冉，尹立紅，浦躍樸

miR-338基因簇與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的病例對(duì)照研究

高志奎，劉冉*，尹立紅，浦躍樸

（東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210009）

目的： 探討miR-338基因簇在食管癌組織中的表達(dá)模式及其與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。方法：選取86例經(jīng)病理確診的食管癌患者，分別提取食管癌和癌旁組織總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p與hsa-miR-657的表達(dá)，應(yīng)用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析癌和癌旁組織中miRNA表達(dá)差異，Pearson相關(guān)分析檢驗(yàn)基因簇各miRNA表達(dá)的相關(guān)性，logistic回歸分析miRNA異常表達(dá)對(duì)食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響。結(jié)果：hsa-miR-338-3p與hsa-miR-338-5p在食管癌組織中的表達(dá)均較癌旁組織降低(P均＜0.05)，hsa-miR-657在食管癌和癌旁組織中表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，hsa-miR-338-3p與hsa-miR-338-5p表達(dá)顯著相關(guān)(r=0.754，P＜0.05)，hsa-miR-338-5p的低表達(dá)增加了食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.264，P＜0.05)，可能是食管癌的危險(xiǎn)因素。結(jié)論：miR-338 基因簇可能抑制了食管癌的發(fā)生，hsa-miR-338-5p可能成為食管癌診斷的潛在標(biāo)志物。

miR-338；基因簇；食管癌；生物標(biāo)志物

【ABSTRACT】OBJECTIVE: T o i nvestigate t he e xpression l evel o f m iR-338 c luster i n e sophageal c arcinoma a nd i dentifythe relationship between miR-338 cluster and esophageal carcinoma. METHODS：A total of 86 cases of patients withconfirmed esophageal carcinoma were selected，real time RT-PCR were performed to detect the expression of hsa-miR-338-3p，hsa-miR-338-5p and hsa-miR-657. We used paired t-test to analyze the expression of miRNA in tumor and adjacentnon-tumor tissues，Pearson correlation analysis to examine the correlation of the expression of each miRNA and logisticregression a nalysis t o a nalyze t he e ffect o f a bnormal e xpression o f m iRNAs o n t he r isk o f e sophageal c ancer. R ESULTS：hsamiR-338-3p and hsa-miR-338-5p were downregulated in tumor tissues compared with adjacent non-tumor tissues(P＜0.05)，and no statical difference was found of the expression of hsa-miR-657 between the two tissues (P＞0.05). Theexpression of hsa-miR-338-3p and hsa-miR-338-5p were significantly correlated (r=0.754，P＜0.05)，and low expressionof hsa-miR-338-5p was the risk factor for esophageal carcinoma (OR=1.264，P＜0.05). CONCLUSION：miR-338 clustermay play an important role in the formation process of esophageal carcinoma. In addition hsa-miR-338-5p may represent themiR-338 c luster t o b e a u seful b iomarker f or d iagnosis.

【KEY WORDS】miR-338；cluster；esophageal carcinoma；biomarker

microRNA(miRNA)是一類可參與內(nèi)源性靶基因調(diào)節(jié)的非編碼RNA，長(zhǎng)度約為22～28個(gè)核苷酸[1]，已有大量研究證實(shí)其異常表達(dá)可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，影響其發(fā)展和預(yù)后[2-3]。miRNA在其啟動(dòng)子和操縱子的作用下進(jìn)行表達(dá)，通常多個(gè)miRNA基因在染色體上聚集排列形成基因簇[4]。

由于位置的特殊性，一些成簇分布的miRNA受到共同的調(diào)控并以多順?lè)醋拥男问睫D(zhuǎn)錄[5]。其編碼產(chǎn)物在功能上可能會(huì)存在某種協(xié)同或者拮抗作用。有研究證實(shí)，一些miRNA基因簇在功能上比單個(gè)miRNA具有更高效的作用[6]。目前研究較多的miR-17-92、miR-143-145基因簇在多種動(dòng)物、組織中影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，基因簇編碼的各成熟miRNA發(fā)揮了一種協(xié)同作用[7-10]。

我們前期的食管癌miRNA芯片結(jié)果顯示miR-338-3p在癌組織中表達(dá)下調(diào)[11]，miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.mirbase.org/)資料顯示miR-338基因簇是一個(gè)在動(dòng)物中高度保守的基因簇，hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-657編碼基因共同參與組成miR-338基因簇。上述3個(gè)miRNA的編碼基因均位于AATK基因內(nèi)含子區(qū)，基因簇長(zhǎng)度為673 bp，miR-338 基因簇可能在相同的啟動(dòng)子和調(diào)控子的作用下表達(dá)，在食管癌的發(fā)生發(fā)展中共同發(fā)揮重要作用。

有關(guān)miR-338基因簇的研究多局限于組成基因簇的單一成熟miRNA，本研究旨在通過(guò)檢測(cè)miR-338基因簇編碼的各miRNA在食管癌和癌旁組織中的表達(dá)，進(jìn)而分析該基因簇的表達(dá)與食管癌發(fā)病的關(guān)系并初步探討miR-338基因簇的表達(dá)模式。

1　材料與方法

1.1人體組織樣本及一般資料

選取淮安市第一人民醫(yī)院2009—2011年86例術(shù)后病理診斷食管癌患者。其中男性54例(62.8%)，女性32例(37.2%)，患者平均年齡(61.13±7.56)歲。收集外科手術(shù)切除的食管癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，將組織剪至0.5 cm3大小，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑和設(shè)備

Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，SYBR Green Mix 購(gòu)自Toyobo公司；MMLV購(gòu)自Promega公司；dNTP 購(gòu)自天根公司；核糖核酸酶抑制劑購(gòu)自Thermo公司；Bulge-LoopTMmiRNA引物購(gòu)自銳博公司。

梯度基因擴(kuò)增儀、低溫高速離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司；Step one-Plus熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

使用Trizol提取組織總RNA，real time PCR測(cè)定成熟miRNA的表達(dá)，RiboBio Bulge-LoopTM引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR。

呼倫忙給他賠不是，說(shuō)老人不懂規(guī)矩，還望多多擔(dān)當(dāng)包涵，并保證這樣的事情不會(huì)再一次發(fā)生。對(duì)方倒是客氣，說(shuō)沒(méi)事沒(méi)事，只需補(bǔ)栽幾棵草也不麻煩。如果這草坪他自己說(shuō)了能算，就讓老人種上幾棵豆角。誰(shuí)家沒(méi)有老人呢？只要能哄老人開(kāi)心，草坪全部鏟光了都沒(méi)有關(guān)系。只是草坪是大家的，如果鄰居們紛紛效仿，這草坪豈不成了菜園子？呼倫說(shuō)那是那是。點(diǎn)頭哈腰地將物業(yè)管理人員送走，轉(zhuǎn)身剛想發(fā)作，見(jiàn)丈母娘正可憐巴巴地盯著自己，一副低頭認(rèn)罪聽(tīng)候處理的樣子，也就不忍心再動(dòng)干戈，忙擺擺手說(shuō)沒(méi)事沒(méi)事，一頭扎進(jìn)書(shū)房，把自己包得像一只過(guò)冬的狗熊。

1.3.1逆轉(zhuǎn)錄取RNA模版0.5 μg，RT引物工作液1 μL，加無(wú)核酸酶水5.5 μ L，70 ? C 加 熱10 m in，立即置于冰上2 min；隨后加入5×RT Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，200 U/μL MMLV 0.25 μL，40 U/μL 核糖核酸酶抑制劑0.25 μL，無(wú)酶水3 μL，置于PCR儀，42℃、1 h ，70 ℃ 、10 m in，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于定量PCR。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR?Green PCR Master mix 4.5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.4 μL，無(wú)酶水3.7 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)熱5 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s；40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)72 ℃收集熒光。熔解曲線：60～95 ℃每升溫0.3 ℃ 收集熒光。

PCR產(chǎn)物的定量校正：選取U6為內(nèi)參，同一樣本miRNA與U6的CT值 相減，得到該樣本miRNA的相對(duì)表達(dá)量?CT值 。?CT值 越大，表明實(shí)際表達(dá)量越低。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析使用SAS 9.2完成，癌組織和癌旁組織中miRNA表達(dá)水平差異的分析采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)方法，各miRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析方法，miRNA異常表達(dá)與食管癌患病關(guān)系的分析采用logistic回歸分析方法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1miR-338基因簇成熟miRNA的表達(dá)

對(duì)癌組織和癌旁組織中成熟miRNA的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)(見(jiàn)表1)，與癌旁組織相比，食管癌組織中hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p顯著低表達(dá)，其表達(dá)量(2-??CT)分別是癌旁組織的0.621和0.506，hsa-miR-657在兩種組織中的表達(dá)差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　食管癌中miR-338基因簇的相對(duì)表達(dá)

對(duì)hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p和hsa-miR-657的相對(duì)表達(dá)量?CT進(jìn) 行Pearson相關(guān)分析(見(jiàn)圖1)，結(jié)果顯示3組miRNA相互之間表達(dá)的相關(guān)性均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。hsa-miR-338-3p與hsa-miR-338-5p表達(dá)高度相關(guān) (r=0.754，P＜0.05)；hsa-miR-657與hsamiR-338-3p的相關(guān)系數(shù)為0.653，與hsa-mi-338-5p的相關(guān)系數(shù)為0.500。

圖1　miRNA表達(dá)的相關(guān)性分析

2.3miRNA表達(dá)與食管癌患病風(fēng)險(xiǎn)

為了評(píng)估m(xù)iRNA異常表達(dá)與食管癌患病之間的關(guān)系，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行1∶1配對(duì)條件logistic回歸分析(見(jiàn)表2)。結(jié)果顯示hsa-miR-657的表達(dá)未引起食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的改變，hsa-miR-338-5p、hsa-miR-338-3p表達(dá)的降低會(huì)增加食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

表2　miRNA異常表達(dá)與食管癌患病風(fēng)險(xiǎn)的條件logistic回歸分析

對(duì)hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p進(jìn)行多因素logistic回歸分析(見(jiàn)表3)，最終hsa-miR-338-5p進(jìn)入方程，hsa-miR-338-5p低表達(dá)會(huì)引起食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高(OR=1.264，P＜0.05)。

表3　miR-338基因簇與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的條件logistic回歸分析

3　討論

有研究表明miR-338-3p在多種癌組織和細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)并發(fā)揮重要作用。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，miR-338-3p可以抑制Smoothened蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的侵襲和遷移能力[12]。在胃癌細(xì)胞中，miR-338-3p可直接作用于ZEB2和MACC1，抑制上皮間質(zhì)化過(guò)程[13]。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-338-3p可以抑制食管癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和集落形成，在裸鼠中過(guò)表達(dá)miR-338-3p，種植腫瘤的生長(zhǎng)受到抑制，本研究顯示miR-338-3p在人食管癌中顯著低表達(dá)(t=2.983，P＜0.05)，miR-338-3p可能在人食管癌的形成中發(fā)揮了抑制作用。

有研究發(fā)現(xiàn)miR-338-5p在結(jié)直腸癌組織和血漿中異常表達(dá)，肝癌患者血漿中miR-338-5p與AFP表達(dá)負(fù)相關(guān)，miR-338-5p可能成為結(jié)直腸癌和肝癌的早期診斷標(biāo)志物[15-16]。對(duì)移植腎臟組織研究發(fā)現(xiàn)，miR-338-5p表達(dá)與移植患者的生存顯著相關(guān)，miR-338-5p可以作用于TRAF3，引起B(yǎng)AFF信號(hào)的改變，從而引起移植腎臟后免疫反應(yīng)的改變[17]。與多種癌組織中低表達(dá)趨勢(shì)相一致，本研究發(fā)現(xiàn)miR-338-5p在人食管癌中顯著低表達(dá)(t=4.309，P＜0.05)，其可能成為食管癌的診斷標(biāo)志物。

Yan等[18]研究發(fā)現(xiàn)早期喉癌中miR-657異常表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析表明miR-657可以較好的區(qū)分早期喉癌和正常黏膜組織，其可能成為早期喉癌的診斷標(biāo)志物。miR-657可以結(jié)合IGF2R的3'UTR區(qū)并參與調(diào)節(jié)Hep-G2細(xì)胞中IGF2R的表達(dá)，Lv等[19]分析認(rèn)為其與2型糖尿病AACA序列的插入和缺失相關(guān)。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中miR-657高表達(dá)，在免疫缺陷小鼠中過(guò)表達(dá)miR-657可見(jiàn)肝癌細(xì)胞的增殖以及克隆形成能力增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-657可以作用于TLE1，通過(guò)NF-kappa B信號(hào)通路促進(jìn)肝癌的形成。本研究并未發(fā)現(xiàn)食管癌和癌旁組織中miR-657的表達(dá)存在顯著差異，推測(cè)可能是miR-657的組織、時(shí)間特異性表達(dá)所致。

我們應(yīng)用Pearson相關(guān)對(duì)miR-338基因簇各miRNA的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，hsa-miR-338-3p、hsamiR-338-5p、hsa-miR-657在表達(dá)上高度相關(guān)(P＜0.05)，來(lái)自于同一前體的hsa-miR-338-3p與hsa-miR-338-5p相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.754，位置上緊密排列的miR-338基因簇表達(dá)miRNA的過(guò)程可能受到某些共同的調(diào)控。多因素logistic分析顯示hsa-miR-338-5p的低表達(dá)是食管癌的危險(xiǎn)因素(OR=1.264，P＜0.05)，hsa-miR-338-3p并未進(jìn)入最終方程，考慮是由于兩者之間表達(dá)高度相關(guān)所致。

綜上，miR-338基因簇可能作為一個(gè)整體，參與了復(fù)雜的分子信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同影響了食管癌的發(fā)生發(fā)展，hsa-miR-338-5p可能在該通路的調(diào)控中發(fā)揮了主要作用，其可能代表miR-338基因簇成為食管癌診斷的標(biāo)志物。miR-338基因簇調(diào)控食管癌的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的研究。

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A case-control study on the risk of esophageal carcinoma and miR-338 cluster

GAO Zhikui，LIU Ran*，YIN Lihong，PU Yuepu
(Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering of Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu, China)

R730.2

A

1004-616X(2016)02-0107-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.005

2015-11-17；

2016-01-04

國(guó)家自然科學(xué)基金(81172747，81573108，81573191)

作者信息： 高志奎，E-mail：gaozhikuijy@163.com。*

，劉冉，E-mail：ranliu@seu.edu.cn