李宗艷，管名媛，李　靜，李名揚

(1 西南林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院， 昆明 650224；2 西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院，重慶 400715)

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基于ISSR的硬葉兜蘭居群遺傳多樣性研究

李宗艷1，管名媛1，李靜1，李名揚2*

(1 西南林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院， 昆明 650224；2 西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院，重慶 400715)

利用ISSR標(biāo)記對7個硬葉兜蘭居群160個體擴增，10對引物共擴增出101個條帶，其中多態(tài)性條帶97個，種水平上的多態(tài)性條帶比率(PPB)達96.02%，香儂指數(shù)(I)為0.488 9，Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.332 4。居群水平的遺傳參數(shù)，多態(tài)性條帶比率(PPB)為 33.51%，香儂指數(shù)(I)為0.194 3，Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.133 2。總的遺傳多樣性(HT)為0.323 9，個體遺傳多樣性(Hs)達到0.133 2。 AMOVA結(jié)果揭示居群間遺傳分化大，居群間基因流Nm為0.349 2。居群間的Nei’s遺傳距離0.148 1～0.4385。基于UPGMA聚類，在遺傳距離為0.327時，7個居群聚為兩支, 第一支由古林箐和馬固、田壩、夾寒箐和楊柳井居群組成，第二支由斗咀和小壩子居群組成，聚類關(guān)系反映居群間遺傳分化與地理距離無顯著相關(guān)性。

硬葉兜蘭；遺傳多樣性；遺傳分化；遺傳距離；親緣關(guān)系

硬葉兜蘭(Paphiopedilummicranthum)分布于云南東南、貴州西南和北部、廣西西部的亞熱帶石灰?guī)r山區(qū)[1-2]，因其具有較高的觀賞價值，自20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)以來，種質(zhì)資源大量被采挖，被CITES列為一級保護植物，禁止貿(mào)易。

作為珍稀花卉，當(dāng)前主要開展了硬葉兜蘭繁殖、傳粉生物學(xué)、育種和遺傳多樣性等研究[3-9]。硬葉兜蘭主要依靠蜂類和食蚜蠅傳粉[3]，自然狀態(tài)下，硬葉兜蘭結(jié)實率和萌發(fā)率較低，人工授粉后種子萌發(fā)率最大可達32.4%[4]；因其具有較高的觀賞特性，硬葉兜蘭參與許多園藝栽培品種的雜交，如著名的魔鬼燈籠P.magicLantern(硬葉兜蘭×德氏兜蘭)[5]；硬葉兜蘭植株形態(tài)多樣，花器官變異較大，如花色、花瓣、中萼和合萼的分化系數(shù)較其它器官高[6]；李昂等[7]分析4個硬葉兜蘭居群遺傳多樣性，結(jié)果表明：其物種水平的遺傳多樣性高于居群水平，有20.3% 的遺傳多樣性來自于居群間的分化，居群間遺傳分化水平高于7個云南居群的SRAP數(shù)據(jù)的結(jié)果[8]；進一步的空間自相關(guān)研究表明：硬葉兜蘭群體中遺傳變異在空間上的分布呈斑塊狀，在短距離內(nèi)表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)，在較大距離內(nèi)表現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)[9]。

ISSR(inter simple sequence repeat) 稱為簡單重復(fù)序列區(qū)間擴增多態(tài)DNA ，實驗操作簡單快速[10]，自創(chuàng)建以來，在居群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析中顯示了突出的優(yōu)勢[11-13]。滇東南的石灰?guī)r地區(qū)極可能是兜蘭的起源中心和演化中心，亦是國內(nèi)硬葉兜蘭采集壓力最大的區(qū)域，采用ISSR技術(shù)對該地區(qū)居群遺傳多樣性進行分析，為其保護提供理論依據(jù)具有現(xiàn)實意義。

1　材料和方法

1.1材料收集

本研究材料采集選擇文山、馬關(guān)和麻栗坡3縣7個居群，每居群按隨機采樣原則，為避免無性克隆個體，每個單株取樣距離在2 m以上，7個居群共160個樣本(表2)，置于保溫箱中帶回實驗室于-70 ℃超低溫冰箱保存。

1. 2引物篩選和PCR擴增

采用改良的1.5×CTAB法提取硬葉兜蘭基因組總DNA，DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，稀釋為30 ng/μL在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實驗選用的ISSR引物是由加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)開發(fā)設(shè)計的77個引物，從中選取10對能穩(wěn)定擴增、產(chǎn)生條帶清晰豐富、多態(tài)性較好的引物組合進行遺傳多樣性的分析。優(yōu)化的PCR擴增反應(yīng)體系為：2.0 mmol/L MgCl2、dNTPs 0.40 mmol/L、模板質(zhì)量濃度為5.0 ng/μL、1.25 U/20μLTaqDNA聚合酶、引物質(zhì)量濃度0.35 μmol/L。ISSR-PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，48～52 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3數(shù)據(jù)處理

條帶統(tǒng)計時將具有相同遷移率的擴增片段，按照0/1編碼，應(yīng)用POPGENE 1.32軟件[14,15]進行多態(tài)位點百分率(PPB)、觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon信息指數(shù)(I)、群體總的遺傳多樣性(HT)、群體內(nèi)基因多樣性(Hs)、群體間的遺傳分化系數(shù)(Gst)、Nei’s遺傳距離(D)和基因流(Nm)計算。根據(jù)Nei’s遺傳距離，利用NTSYS-pc1.21[16]軟件對居群進行UPGMA居群間親緣關(guān)系分析。分子遺傳變異的方差分析(AMOVA)用GenALEX軟件計算[17]。

2　結(jié)果與分析

2.1引物篩選結(jié)果

采用優(yōu)化的ISSR-PCR擴增反應(yīng)體系，對77個ISSR引物擴增有產(chǎn)物的有42個，從中篩選出10個擴增穩(wěn)定性較高、多態(tài)性較好和條帶清晰的引物進行居群遺傳多樣性分析(表1)。引物擴增條帶最多為12條，為引物855、856和840，多數(shù)引物擴增條帶為8～10條，有6個引物擴增多態(tài)百分率達100%。

表1　不同引物的擴增效果

表2　基于ISSR數(shù)據(jù)的硬葉兜蘭7個居群的遺傳多樣性指數(shù)

注：Na.觀測等位基因數(shù)；Ne.有效等位基因數(shù)；H.Nei’s基因多度；I.Shannon’s 指數(shù);PPB. 多態(tài)性百分率

Note:Na. Observed number of alleles;Ne. Effective number of alleles;H. Nei gene diversity;I. Shannon’s information index;PPB. The percentage of polymorphic bands

表3　硬葉兜蘭7個居群的Nei’s遺傳一致度(對角線上方)和遺傳距離(對角線下方)

2.2硬葉兜蘭的遺傳多樣性

10個引物共擴增出101個條帶(表2)，其中多態(tài)性條帶97個，多態(tài)條帶比率達96.04%，每個引物平均擴增產(chǎn)生10.1個條帶。古林箐和馬固居群多態(tài)性百分率較高，分別為40.59%和36.63%，夾寒箐和楊柳井居群的多態(tài)性百分率最小，僅有28.71%。7個居群的有效等位基因數(shù)(Ne)在1.180 1～1.268 2之間；Nei’s基因多度(H)變幅為0.102 0～0.151 9，Shannon指數(shù)(I)值在0.151 6～0.224 1。小壩子和田壩居群的遺傳多樣性相差不大，夾寒箐居群內(nèi)的遺傳多樣性較低(PPB=28.71%;H=0.102 0；I=0.151 6)。古林箐居群的遺傳多樣性水平最高，Shannon指數(shù)(I)為0.224 1。在居群水平的Shannon指數(shù)和Nei’s基因多度為0.194 3和0.133 2，在物種水平的分別為0.488 9和0.324 4?？偟倪z傳多樣性(HT)為0.323 9， 居群內(nèi)的遺傳多樣性(Hs)為0.133 2。

2.3居群間遺傳距離與親緣關(guān)系

依據(jù)顯示的居群間的Nei’s遺傳距離(表3)，近距離居群的小壩子和楊柳井間的遺傳距離最大，為0.438 5, 而夾寒箐和楊柳井居群間有最小遺傳距離, 為0.148 1，7個居群間平均遺傳距離為0.299 2?；赨PGMA聚類(圖1)，在遺傳距離達0.327時，7個居群聚為兩支，第一支由兩個分支組成，第一分支由古林箐和馬固居群組成，第二分支由田壩、夾寒箐和楊柳井居群組成，第二支由斗咀和小壩子居群組成，結(jié)果證實了居群間遺傳距離與地理距離無顯著相關(guān)性。

圖1　硬葉兜蘭7個居群的親緣關(guān)系聚類Fig. 1　Dendrogram analysis showing relationships among seven populations

2.4硬葉兜蘭居群間的遺傳分化

群體間遺傳分化系數(shù)是是衡量遺傳多樣性的變異來源的指標(biāo)[18]，遺傳分化的高低表明居群間的變異和分化水平[19-20]。Gst、PhiPT是不同軟件計算的遺傳分化指數(shù)。

首先，7個居群間的遺傳分化系數(shù)(Gst)達0.588 8，揭示了居群間存在較高的遺傳分化水平。AMOVA揭示有39.60%的分子遺傳變異來源于居群間，這一結(jié)果稍高于黃家林等報道的結(jié)果[21]，小于與Gst的分化水平，與PhiPT值近相同。而居群間平均基因流(Nm)僅為0.349 2。

其次，同一地區(qū)間居群的遺傳分化系數(shù)(PhiPT)相差較大，文山小壩子與斗咀間的PhiPT值為0.304，斗咀與楊柳井的為0.430, 小壩子與楊柳井間的遺傳分化系數(shù)達0.492，平均遺傳分化系數(shù)達0.409；而馬關(guān)馬固和古林箐僅為0.319，古林箐與夾寒箐的PhiPT為0.472，馬固與夾寒箐之間為0.381。田壩居群與其余6個居群間PhiPT值在0.338～0.413之間， 與斗咀分化最小，與古林箐最大。7個居群兩兩間遺傳分化最小的為楊柳井和夾寒箐，達0.278；最大的為楊柳井和小壩子，達0.492。7個居群間平均PhiPT值為0.392。居群間PhiPT值反映出的遺傳分化程度與Nei’s距離關(guān)系是一致的。盡管楊柳井和斗咀居群為近緣居群，但居群兩兩間的平均遺傳分化系數(shù)卻較高，說明相同地區(qū)近距離居群間亦存在較高的遺傳分化，反映了居群間遺傳分化水平與地理距離無明顯相關(guān)性。

3　討　論

3.1硬葉兜蘭居群的遺傳多樣性

一般認(rèn)為，廣布種都比窄布種具有較高的遺傳多樣性，瀕危植物有較低的遺傳多樣性，遺傳多樣性越低的植物越瀕危[22-23]。但越來越多的研究表明，瀕危植物也有很高的遺傳多樣性。采用ISSR技術(shù)對珊瑚菜(Glehnialittoralis)、毛瓣金花茶(Camelliapubipetala) 瀕危種遺傳多樣性水平的檢測顯示，在種和居群水平都保持較高的遺傳多樣性，居群間遺傳分化也不高[24-25]。

采用ISSR技術(shù)檢測蘭科瀕危種的研究表明，流蘇石斛(Dendrobiumfimbriatum)在種水平的遺傳多樣性不低，但居群水平的遺傳多樣性較低[26]。本項目對7個硬葉兜蘭居群的ISSR檢測結(jié)果表現(xiàn)出物種水平的遺傳多樣性較高(PPB=96.04%，H=0.324 4，I=0.488 9)，居群水平的遺傳多樣性均高于上述種(PPB=33.51%，H=0.133 2，I=0.194 3)。物種總的遺傳多樣性(HT)為0.323 9，居群內(nèi)的遺傳多樣性僅為0.133 2。此結(jié)論與SRAP數(shù)據(jù)和李昂的初步檢測結(jié)論是一致的[8-9]，即硬葉兜蘭種水平遺傳多樣性遠高于居群水平，但與黃家林等報道的較高水平的居群遺傳多樣性(PPB=80.28%，H=0.284 7，I=0.423 6)結(jié)果有較大出入[21]。

珍稀瀕危物的遺傳多樣性與很多因素有關(guān)，如從祖先廣布種的物種中分化而來、分布范圍、生境條件、繁育系統(tǒng)等。Hamrick[22]認(rèn)為居群遺傳變異大小的主要影響因素依次為繁育系統(tǒng)、分布范圍和生活型，廣布、異交和靠動物傳播種子的物種往往具有較高的遺傳多樣性。硬葉兜蘭能保持種較高水平的遺傳多樣性與其異交、長命草本、種子傳播特性、分布生境的多樣密切相關(guān)。

3.2硬葉兜蘭居群的遺傳分化

一般認(rèn)為，PhiPT分化指數(shù)若在0～0.05之間說明居群間分化很弱，若在0.05～0.15之間說明居群間存在中等程度分化，若在0.15～0.25之間說明居群間分化大，若PhiPT大于0.25表明居群間分化極大[27]。7個硬葉兜蘭居群的分化指數(shù)(PhiPT)平均水平達0.392，充分說明硬葉兜蘭居群間分化大，與AMOVA結(jié)果近相同，低于基于Nei’s指數(shù)的Gst(0.588 8)，接近于相同地區(qū)鐵皮石斛居群間Gst(0.563 7)，遠高于硬葉兜蘭在云貴桂交界區(qū)的Gst水平[21]?；谟踩~兜蘭的ISSR分子標(biāo)記，利用不同的分析方法(PhiPT，AMOVA)所得的遺傳分化值基本一致。研究表明：異交類群的平均基因遺傳分化系數(shù)Gst為0.23，混交類群Gst為0.19，自交類群Gst為0.59[28]。硬葉兜蘭屬于異花傳粉植物，居群間的遺傳分化顯著。

物種的繁育系統(tǒng)是影響居群水平上的遺傳分化水平的重要因素，Avise[29]認(rèn)為由弱飛行能力的動物授粉和靠種子遷移的植物居群之間的遺傳分化顯著。硬葉兜蘭主要由蜂類傳粉[3]，其飛行距離有限，主要是進行居群內(nèi)開花植株之間的授粉，造成遺傳變異主要來源于居群內(nèi)，而居群間的花粉流是非常有限的；再者，由于硬葉兜蘭種子萌發(fā)特性具有強烈的生境選擇特點，易導(dǎo)致物種地理間斷性分布，造成居群間的地理距離較遠。一般認(rèn)為，地理隔離會引起近交，而近交繁殖方式將引起近交衰退和降低群體間的遺傳多樣性，同樣也會降低群體間基因交流，加劇群體間的分化[30-32]。居群遺傳學(xué)研究中，基因流根據(jù)Nm的大小劃分為高(≥1.0)、中(0.250～0.99)、低(0.0～0.249)三個等級水平[33]。若按此標(biāo)準(zhǔn)劃分，此次研究的硬葉兜蘭居群間基因流處于低水平，僅為0.349 2，相同的ISSR技術(shù)揭示的云南、貴州和廣西交界區(qū)域的硬葉兜蘭的基因流也僅有0.7201[21]。一般而言，在選擇作用不明顯時，只要有很少量的基因流便可有效地阻止群體分化[34]，可判斷基因流不是造成硬葉兜蘭居群間遺傳分化顯著的主要因素。

有越來越多的研究證明，遺傳變異主要是由選擇、突變、基因流和遺傳漂變等產(chǎn)生，而空間距離并不一定產(chǎn)生遺傳變異[35]。彼此相距很近的群體即使存在頻繁的基因流動，強有力的選擇作用也能使得群體間產(chǎn)生遺傳上的變異和分化。

有學(xué)者[35]認(rèn)為遺傳距離與地理距離之間缺乏顯著相關(guān)性意味著遺傳漂變在種群間的分化中起著不可忽視的作用。在人為干擾嚴(yán)重的硬葉兜蘭居群中，居群個體主要依賴無性克隆產(chǎn)生，導(dǎo)致居群中有效個體數(shù)量下降形成小居群，則更易加大發(fā)生遺傳漂變的機率；此次供試斗咀、小壩子和楊柳井居群為小居群，大概也增加了居群間的遺傳分化。再者，在人為干擾小的居群中，開花植株少和個體數(shù)量減少，易造成居群內(nèi)花粉流水平下降和結(jié)實率降低，居群內(nèi)遺傳多樣性水平下降和遺傳變異變小，而居群間的種子流有限則也加劇居群間的遺傳分化。

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(編輯:宋亞珍)

Genetic Diversity ofPaphiopedilummicranthumDetected by ISSR Data

LI Zongyan1, GUAN Mingyuan1, LI Jing1, LI Mingyang2*

(1 Landscape and Architecture Faculty, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 2 Horticulture and Landscape College, Southwest University, Chongqing 400715, China )

Paphiopedilummicranthumhas the high ornamental value known as slipper orchids, which was restrictedly distributed in karst limestone areas of southeast Yunnan, southwest Guizhou, northern and western Guanxi Province. This study focused on the genetic diversity of 7 populations from Southeast Yunnan detected by ISSR markers. 101 bands were generated from 160 individuals by 10 primers, among which 97 bands belonged to polymorphic and each primer amplified 10.1 bands. There was a higher genetic diversity index at species level (PPB=96.02%;I=0.488 9;H=0.332 4), but a lower genetic diversity index at population level (PPB=33.51%;I=0.194 3;H= 0.133 2). Total gene diversity reached 0.323 9 and gene diversity within populations attained to 0.133 2. Nei’s genetic differetation among populations (Gst)was 0.148 1-0.438 5. Gene flow (Nm) was 0.349 2. These indicated that there was a higher population differentiation among populations. Based on the UPGMA cluster dendrogram, the seven populations were classfied into two groups at genetic distance of 0.327. First group included Gulinqing, Magu, Tianba, Jiahanqing and Yangliujing; Second group was made up by Douzui and Xiaobazi populations. The cluster result indicated that there was no significant correlation between genetic distance and geographical distance.

Paphiopedilummicranthum; genetic diversity; genetic differentiation; genetic distance; blood relationship

1000-4025(2016)07-1351-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1351

2016-04-21;修改稿收到日期:2016-06-13

云南省高校優(yōu)勢特色生態(tài)學(xué)重點學(xué)科建設(shè)項目(05000511311)；云南省優(yōu)勢特色重點學(xué)科生物學(xué)一級學(xué)科建設(shè)項目(50097501)

李宗艷(1974- ), 女，博士, 副教授，從事瀕危植物保護研究。E-mail: lizyan74@sina.com

李名揚，男，博士，教授，從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail: limy@swu.edu.cn

Q746+.5

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