孫菲菲，楊一山，秦惠珍，柴勝豐，付傳明，蔣 強(qiáng)，韋 霄**

(1.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林 541004；2.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541006；3.廣西雅長(zhǎng)蘭科植物國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理中心，廣西百色 533209)

兜蘭屬植物的花朵呈兜狀，獨(dú)具特色，花色艷麗且花期持久[1]，猶如精靈般存在，具有極高的觀賞價(jià)值。近年來，兜蘭在花卉市場(chǎng)上備受矚目，越來越多的人因其獨(dú)特的造型、較高的觀賞價(jià)值將其列為高檔花卉[2]。兜蘭屬植物種類較為豐富，據(jù)目前研究發(fā)現(xiàn)已有原生種96種，主要集中分布在中國(guó)西南部以及東南亞等地[3,4]。我國(guó)國(guó)產(chǎn)兜蘭大多分布于熱帶亞熱帶的高海拔(1 000 m 以上)地區(qū)，在廣西分布較多，一般生長(zhǎng)于石山、疏灌叢中或林緣地帶，喜溫暖濕潤(rùn)環(huán)境，不喜陽光直射、光照強(qiáng)的地帶，且兜蘭要求排水良好的土壤，靠其根部疏水防止根部腐爛。我國(guó)兜蘭屬植物種類較多，約有18種，其中約有9種分布于廣西，但因頻繁采挖、交易等導(dǎo)致兜蘭屬植物居群逐漸縮小，成為國(guó)家以及國(guó)際稀有物種。兜蘭屬所有物種均被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)[5]。2021年新頒布的《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)植物名錄》中，除了帶葉兜蘭和硬葉兜蘭被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)植物外，其余兜蘭屬植物均被列為國(guó)家Ⅰ級(jí)保護(hù)植物。

我國(guó)境內(nèi)分布的兜蘭一般生長(zhǎng)于石山縫隙[6,7]，由于近年來人類對(duì)森林的開采破壞了兜蘭賴以生存的環(huán)境，導(dǎo)致兜蘭植物居群縮小。為保護(hù)國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)物種兜蘭，研究其生存環(huán)境及生長(zhǎng)狀況具有重要意義。我國(guó)目前對(duì)兜蘭的研究主要在遺傳多樣性[8]、種群結(jié)構(gòu)[9]、居群分布[10]以及繁殖培育[11]等方面，對(duì)兜蘭光合生物學(xué)特性的研究報(bào)道較少。本研究對(duì)3種原產(chǎn)地原生種兜蘭植物進(jìn)行光合參數(shù)的相關(guān)研究，測(cè)定其光響應(yīng)曲線、CO2響應(yīng)曲線以及葉綠素含量等相關(guān)參數(shù)，為兜蘭植物引種栽培提供科學(xué)的方法，為大規(guī)模培育種植提供指導(dǎo)，從而實(shí)現(xiàn)蘭科植物資源的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)場(chǎng)地位于廣西雅長(zhǎng)蘭科植物國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)科普?qǐng)@內(nèi)。保護(hù)區(qū)地處桂西中亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫16.3℃，年平均日照數(shù)1 303.7-1 698.7 h，年平均降水量940.8-1 216.9 mm?？偟膩碚f，保護(hù)區(qū)常年氣候溫和，冬無嚴(yán)寒，夏無酷暑。帶葉兜蘭(Paphiopedilumhirsutissimum)、長(zhǎng)瓣兜蘭(P.dianthum)、硬葉兜蘭(P.micranthum)為遷地保護(hù)的成年植株，種植于科普?qǐng)@后山，長(zhǎng)勢(shì)良好。

1.2 方法

1.2.1 光響應(yīng)曲線的測(cè)定

選取長(zhǎng)勢(shì)最佳的硬葉兜蘭、帶葉兜蘭以及長(zhǎng)瓣兜蘭作為試驗(yàn)苗，每個(gè)物種測(cè)量3株重復(fù)，以兜蘭的成熟葉片為試驗(yàn)材料，在晴朗天氣的上午9:00-11:30，攜帶Li-6400便攜式光合儀(LI-COR,USA)測(cè)定這3種兜蘭屬植物的光響應(yīng)曲線數(shù)據(jù)。光響應(yīng)曲線數(shù)據(jù)的測(cè)定采用內(nèi)置紅藍(lán)光源，光合有效輻射(PAR)依次設(shè)置為1 600 μmol·m-2·s-1、1 400 μmol·m-2·s-1、1 200 μmol·m-2·s-1、1 000 μmol·m-2·s-1、800 μmol·m-2·s-1、600 μmol·m-2·s-1、400 μmol·m-2·s-1、200 μmol·m-2·s-1、150 μmol·m-2·s-1、100 μmol·m-2·s-1、80 μmol·m-2·s-1、60 μmol·m-2·s-1、40 μmol·m-2·s-1、20 μmol·m-2·s-1、0 μmol·m-2·s-1，其他環(huán)境測(cè)定條件控制為相對(duì)濕度65%、葉室溫度25℃、葉室CO2濃度400 μmol·mol-1。采用非直角雙曲線模型對(duì)凈光合速率(Pn)與光照強(qiáng)度(以下簡(jiǎn)稱“光強(qiáng)”)進(jìn)行擬合，用Pn-PAR做出光響應(yīng)曲線圖，其計(jì)算公式[12]如下：

Pn(I)=

(1)

式中，Pn為凈光合速率；I為光強(qiáng)(PAR)；θ為曲線的曲率；α為植物光合作用對(duì)光響應(yīng)曲線在I=0時(shí)的斜率，即光響應(yīng)曲線的初始斜率，也稱為初始量子效率；Pmax為最大凈光合速率；Rd為暗呼吸速率。

1.2.2 CO2響應(yīng)曲線的測(cè)定

在晴朗天氣的上午 9:00-11:30，攜帶 Li-6400便攜式光合儀(LI-COR,USA)測(cè)定這3種兜蘭屬植物的CO2響應(yīng)曲線數(shù)據(jù)。測(cè)定PAR設(shè)定為600 μmol·m-2·s-1，測(cè)定時(shí)葉室中CO2濃度設(shè)置順序?yàn)?0 μmol·mol-1、100 μmol·mol-1、150 μmol·mol-1、200 μmol·mol-1、300 μmol·mol-1、400 μmol·mol-1、600 μmol·mol-1、800 μmol·mol-1、1 000 μmol·mol-1、1 200 μmol·mol-1、1 400 μmol·mol-1、1 600 μmol·mol-1、2 000 μmol·mol-1，保證在每個(gè)CO2濃度下平衡時(shí)間不少于180 s，測(cè)得的數(shù)據(jù)采用M-M曲線模型擬合，用Pn-Ci做出CO2響應(yīng)曲線圖，其計(jì)算公式[13,14]如下：

(2)

式中，Pn為凈光合速率，Ci為胞間CO2濃度，Pmax為潛在最大凈光合速率，Rp為光呼吸速率，K為Michaelis-Menten常數(shù)。

1.2.3 葉綠素相對(duì)含量(SPAD值)的測(cè)定

采用葉綠素含量測(cè)定儀(SPAD-502，Japan)，選取生長(zhǎng)狀況較好的葉片，擦凈灰塵，選取不同位置，每個(gè)位置重復(fù)測(cè)量5次。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

通過SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用鄧肯檢驗(yàn)在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析，通過非直角雙曲線模型擬合光響應(yīng)曲線(Pn-PAR)，計(jì)算表觀量子效率(AQY)、最大凈光合速率(Pmax)、暗呼吸速率(Rd)；通過M-M曲線模型擬合CO2響應(yīng)曲線(Pn-Ci)[7,8]，計(jì)算最大凈光合速率(Pmax)、光呼吸速率(Rp)、初始羧化效率α。對(duì)200 μmol·m-2·s-1以下的光強(qiáng)采用線性回歸分析計(jì)算得出的斜率即為表觀量子效率(AQY)，Pn=0即得光補(bǔ)償點(diǎn)(LCP)，Pn=Pmax即得光飽和點(diǎn)(LSP)；同理對(duì)CO2響應(yīng)曲線前4點(diǎn)坐標(biāo)作線性回歸分析計(jì)算得出的斜率即為羧化效率(CE)，Pn=0即得CO2補(bǔ)償點(diǎn)(CCP)，Pn=Pmax即得CO2飽和點(diǎn)(CSP)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種兜蘭凈光合速率對(duì)光強(qiáng)的響應(yīng)特征

3種兜蘭屬植物葉片光響應(yīng)曲線如圖1所示。3種兜蘭變化趨勢(shì)大致相似，當(dāng)光強(qiáng)為0 μmol·m-2·s-1時(shí)，3種兜蘭的Pn值均小于0，反映出其在無光強(qiáng)時(shí)的呼吸作用。當(dāng)PAR在0-200 μmol·m-2·s-1時(shí)，凈光合速率陡然上升，幾乎呈線性增加變化趨勢(shì)；當(dāng)光強(qiáng)在200-800 μmol·m-2·s-1時(shí)，隨著PAR的增加，凈光合速率的增長(zhǎng)速度逐漸減慢；當(dāng)光強(qiáng)在1 000-1 800 μmol·m-2·s-1時(shí)，3種兜蘭屬植物的凈光合速率基本穩(wěn)定不變或少許升高。從圖1可以看出，硬葉兜蘭凈光合速率高于長(zhǎng)瓣兜蘭和帶葉兜蘭，帶葉兜蘭和長(zhǎng)瓣兜蘭凈光合速率較為接近。

圖1 3種兜蘭屬植物葉片光響應(yīng)曲線

如表1所示，3種兜蘭屬植物光響應(yīng)特征參數(shù)中除了暗呼吸速率(Rd)，硬葉兜蘭的最大凈光合速率(Pmax)、光補(bǔ)償點(diǎn)(LCP)、光飽和點(diǎn)(LSP)以及表觀量子效率(AQY)均為全組最高，且顯著高于其余兩種兜蘭(P<0.05)，暗呼吸速率(Rd)表現(xiàn)為長(zhǎng)瓣兜蘭(0.530 μmol·m-2·s-1)顯著高于硬葉兜蘭和帶葉兜蘭(分別為0.098 μmol·m-2·s-1和0.341 μmol·m-2·s-1)，說明長(zhǎng)瓣兜蘭在光強(qiáng)較弱時(shí)或無光強(qiáng)時(shí)消耗的有機(jī)物量較大。以上結(jié)果表明3種兜蘭光合生理特性雖略有差異，但均對(duì)弱光有較好的吸收，說明3種兜蘭適合種植于較蔭蔽的地方。

表1 3種兜蘭屬植物光響應(yīng)特征參數(shù)

2.2 3種兜蘭在不同光強(qiáng)下的光合參數(shù)分析

不同光強(qiáng)(PAR)與蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)之間的關(guān)系如圖2所示。從圖2(a)可以看出，隨著光強(qiáng)的增加，Tr雖有起伏但整體仍呈穩(wěn)定上升的趨勢(shì)，光照越強(qiáng)，Tr越大，且3種兜蘭Tr較為接近，在光強(qiáng)為0-200 μmol·m-2·s-1時(shí)，3種兜蘭的Tr均呈現(xiàn)上下波動(dòng)不穩(wěn)定的趨勢(shì)；當(dāng)PAR 在800-1 600 μmol·m-2·s-1時(shí)，Tr表現(xiàn)為長(zhǎng)瓣兜蘭>帶葉兜蘭>硬葉兜蘭。從圖2(b)可以看出，隨著光強(qiáng)的增加，Ci整體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。在光強(qiáng)為100 μmol·m-2·s-1左右時(shí)，3種兜蘭的Ci值迅速下降至最低，在光強(qiáng)為300-1 600 μmol·m-2·s-1時(shí)，Ci雖有升降但整體仍呈上升狀態(tài)，3種兜蘭的Ci變化趨勢(shì)也大致相似，無明顯差異。從圖2(c)可以看出，隨著光強(qiáng)的增加，3種兜蘭的Gs整體呈上升趨勢(shì)，且3種兜蘭趨勢(shì)一致。在0-400 μmol·m-2·s-1光照條件下，Gs表現(xiàn)為帶葉兜蘭>長(zhǎng)瓣兜蘭>硬葉兜蘭；在光強(qiáng)為700-1 400 μmol·m-2·s-1時(shí)，Gs大小為長(zhǎng)瓣兜蘭>帶葉兜蘭>硬葉兜蘭。以上結(jié)果表明3種兜蘭隨著光強(qiáng)變化，響應(yīng)特征參數(shù)變化趨勢(shì)較為一致，無顯著差異，表明3種兜蘭對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性較為相似。

圖2 3種兜蘭光響應(yīng)曲線下PAR與Tr (a)、Ci (b)、Gs (c)之間的關(guān)系

2.3 3種兜蘭光合參數(shù)相關(guān)性分析

由表2可知，硬葉兜蘭中PAR與Gs、Pn、Tr呈顯著正相關(guān)，Tr與Gs呈顯著正相關(guān)；長(zhǎng)瓣兜蘭中PAR與Gs、Pn、Tr呈顯著正相關(guān)，Tr與Pn、Gs呈顯著正相關(guān)，Pn與Gs呈顯著正相關(guān)；帶葉兜蘭中PAR與Gs、Pn、Tr呈顯著正相關(guān)，Tr與Gs呈顯著正相關(guān)，Pn與Ci呈顯著負(fù)相關(guān)。3種兜蘭屬植物的光響應(yīng)特征參數(shù)相關(guān)性較為類似，只有帶葉兜蘭的Pn與Ci呈顯著負(fù)相關(guān)，與其余2種相比具有差異性。長(zhǎng)瓣兜蘭的Pn與Gs呈顯著正相關(guān)，Yang等[15]與Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)兜蘭屬中Pn與Gs呈顯著正相關(guān)，且兜蘭植物的光合能力較低,與其葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)具有顯著相關(guān)性；研究還發(fā)現(xiàn)光合能力的高低與其保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體和特有的氣孔解剖結(jié)構(gòu)有關(guān)。

表2 3種兜蘭屬植物光響應(yīng)特征參數(shù)相關(guān)性分析

2.4 3種兜蘭凈光合速率對(duì)CO2濃度的響應(yīng)特征

3種兜蘭屬植物的凈光合速率對(duì)CO2濃度響應(yīng)曲線的變化趨勢(shì)基本一致(圖3)。當(dāng)Ci在50-200 μmol·mol-1時(shí)，Pn迅速上升，幾乎呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)；當(dāng)Ci達(dá)到500-1 000 μmol·mol-1時(shí)，Pn的增長(zhǎng)速率依舊較快，但明顯放緩；隨著Ci增加至1 000-2 000 μmol·mol-1，凈光合速率增長(zhǎng)速度逐漸減緩，可以預(yù)估在Ci大于2 000 μmol·mol-1時(shí)，其光合速率會(huì)逐漸穩(wěn)定。當(dāng)Ci在600-2 000 μmol·mol-1時(shí)，硬葉兜蘭的凈光合速率最大，其次是帶葉兜蘭，長(zhǎng)瓣兜蘭凈光合速率最小。硬葉兜蘭的凈光合速率之所以增加迅速，是因?yàn)槠淠艹浞掷肅O2使自身達(dá)到最大光合速率，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行充分累積，儲(chǔ)存能量，對(duì)CO2的吸收效果優(yōu)于帶葉兜蘭和長(zhǎng)瓣兜蘭。

圖3 3種兜蘭屬植物葉片CO2響應(yīng)曲線

如表3所示，3種兜蘭CO2響應(yīng)參數(shù)中硬葉兜蘭的最大凈光合速率(Pmax)、CO2補(bǔ)償點(diǎn)(CCP)、CO2飽和點(diǎn)(CSP)、羧化效率(CE)以及光呼吸速率(Rp)均為全組最高，且顯著高于其余兩種兜蘭(P<0.05)，說明硬葉兜蘭對(duì)CO2利用能力較強(qiáng)，能充分進(jìn)行光合作用，儲(chǔ)存物質(zhì)和能量，光合效果較好。長(zhǎng)瓣兜蘭和帶葉兜蘭的CO2響應(yīng)參數(shù)均較為接近。3種兜蘭的Rp值雖較為接近，但長(zhǎng)瓣兜蘭顯著低于硬葉兜蘭，說明長(zhǎng)瓣兜蘭在光下釋放CO2的速率小，呼吸作用較弱，硬葉兜蘭的光呼吸速率較大，呼吸作用較強(qiáng)，消耗物質(zhì)較多。以上結(jié)果表明3種兜蘭植物CO2響應(yīng)參數(shù)較為相似，對(duì)CO2有較高的利用度，能顯著提高植物光合能力，促進(jìn)植物內(nèi)部能量及物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。

表3 3種兜蘭屬植物光合作用對(duì)胞間CO2濃度響應(yīng)的特征參數(shù)

2.5 3種兜蘭SPAD值的比較

葉綠素是光合作用中最重要和最有效的色素，葉綠素的含量在一定程度上能反映植物同化物質(zhì)的能力，即對(duì)光利用能力的強(qiáng)弱，其高低是光合作用強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo)。在3種兜蘭中，硬葉兜蘭葉綠素含量最高，長(zhǎng)瓣兜蘭次之，帶葉兜蘭最低(表4)，且硬葉兜蘭和帶葉兜蘭間具有顯著差異(P<0.05)，這與其最大凈光合速率的差異一致。葉綠素含量測(cè)定結(jié)果說明硬葉兜蘭對(duì)光能的利用能力更強(qiáng)，帶葉兜蘭和長(zhǎng)瓣兜蘭的光合能力稍差。

表4 3種兜蘭葉綠素含量的比較

3 討論

本研究中，通過光響應(yīng)曲線可知不同光強(qiáng)下硬葉兜蘭凈光合速率(Pn)顯著高于帶葉兜蘭和長(zhǎng)瓣兜蘭，低于常見的C3植物(10-25 μmol·m-2·s-1)[17]，這與3種兜蘭是陰生植物的結(jié)論一致，說明這3種兜蘭適合培育于蔭蔽的環(huán)境下。通過CO2響應(yīng)曲線可以得出不同CO2濃度下的Pn值為硬葉兜蘭>帶葉兜蘭>長(zhǎng)瓣兜蘭，且在CO2響應(yīng)曲線下3種兜蘭的Pn值均較光響應(yīng)曲線下的Pn值顯著提高，說明CO2能促進(jìn)兜蘭植物進(jìn)行光合作用，可以適當(dāng)增加空氣中的CO2含量，促進(jìn)植物物質(zhì)積累，使其茁壯成長(zhǎng)。

3種兜蘭的光響應(yīng)參數(shù)最大凈光合速率(Pmax)、暗呼吸速率(Rd)、光飽和點(diǎn)(LSP)、光補(bǔ)償點(diǎn)(LCP)以及表觀量子效率(AQY)具有顯著差異。當(dāng)植物到達(dá)光飽和點(diǎn)后Pn值出現(xiàn)下降現(xiàn)象，飽和點(diǎn)的Pn值即為Pmax，這是由于植物隨光強(qiáng)的增大出現(xiàn)光抑制現(xiàn)象，表明在光強(qiáng)增大時(shí)植物對(duì)光強(qiáng)較敏感[18]，本研究發(fā)現(xiàn)硬葉兜蘭對(duì)光的適應(yīng)能力較強(qiáng)，Pmax較高，這與龍健等[19]對(duì)小葉兜蘭的研究結(jié)果類似。暗呼吸速率(Rd)的高低反映植物消耗有機(jī)物的能力，長(zhǎng)瓣兜蘭和帶葉兜蘭的暗呼吸效率較高，消耗有機(jī)物較多，可能會(huì)導(dǎo)致其積累較少。LSP和LCP反映植物在不同光強(qiáng)下的適應(yīng)能力，3種兜蘭中，硬葉兜蘭適應(yīng)光強(qiáng)的范圍較其他2種兜蘭寬，但總體而言，3種植物適應(yīng)光強(qiáng)的范圍均較為狹窄，具有顯著的陰生植物特征。AQY反映植物對(duì)弱光的利用能力，對(duì)弱光的利用能力越強(qiáng)，AQY值越大，本研究發(fā)現(xiàn)硬葉兜蘭對(duì)弱光的利用效果更好。

3種兜蘭的CO2響應(yīng)參數(shù)中，Pmax、光呼吸速率(Rp)、CO2飽和點(diǎn)(CSP)和CO2補(bǔ)償點(diǎn)(CCP)以及羧化效率(CE)具有顯著差異。Pmax最大的為硬葉兜蘭(5.334 μmol·m-2·s-1)，說明硬葉兜蘭對(duì)CO2的吸收利用能力較強(qiáng)。從CSP和CCP可以看出植物對(duì)CO2濃度的適應(yīng)范圍，硬葉兜蘭對(duì)高濃度CO2的適應(yīng)能力更強(qiáng)，而長(zhǎng)瓣兜蘭的適應(yīng)范圍較為狹窄。羧化效率(CE)的高低代表植物對(duì)CO2吸收能力的強(qiáng)弱，本研究中硬葉兜蘭對(duì)CO2的吸收能力更強(qiáng)，但3種兜蘭仍顯著低于一般C3植物的羧化效率(0.06-0.12 μmol·m-2·s-1)[20]。

植物生長(zhǎng)發(fā)育依靠光合作用，光合作用是它們賴以生存的方式和手段，其強(qiáng)弱不僅與外界環(huán)境因子(溫度、水分、光照以及CO2含量等)相關(guān)，還與其自身的葉綠素含量[21]相關(guān)。本研究中SPAD值表現(xiàn)為硬葉兜蘭(58.13)>長(zhǎng)瓣兜蘭(54.12)>帶葉兜蘭(51.88)，這與其Pmax的變化趨勢(shì)一致，說明葉綠素含量是影響兜蘭光合作用的重要因素。

4 結(jié)論

通過光合參數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，3種兜蘭在相同環(huán)境下光合生理特性較為相似，3種兜蘭對(duì)光強(qiáng)的利用范圍較為狹窄，其中硬葉兜蘭較帶葉兜蘭和長(zhǎng)瓣兜蘭對(duì)光強(qiáng)的適應(yīng)范圍寬，在弱光下有較好吸收，且在弱光下有更多的物質(zhì)積累，有利于其自身的生長(zhǎng)發(fā)育；光照較強(qiáng)會(huì)產(chǎn)生光抑制現(xiàn)象，阻礙光合作用，從而導(dǎo)致兜蘭生長(zhǎng)緩慢甚至死亡。因此，3種兜蘭植物應(yīng)培育在光照較弱的環(huán)境下，如林下遮陰棚中。葉綠素是影響光合作用的重要因素，SPAD值越大，光合作用效果越好，本研究中SPAD值排序?yàn)橛踩~兜蘭>長(zhǎng)瓣兜蘭>帶葉兜蘭；另外，增加空氣中CO2含量有利于提高兜蘭植物的光合能力，較為顯著地提高其Pn值，Pn值排序?yàn)橛踩~兜蘭>帶葉兜蘭>長(zhǎng)瓣兜蘭。在當(dāng)今生態(tài)環(huán)境破壞嚴(yán)重、適宜生境越來越少的背景下，兜蘭培育是保護(hù)兜蘭資源的重要途徑，本研究結(jié)果可為硬葉兜蘭、帶葉兜蘭和長(zhǎng)瓣兜蘭的引種栽培及保護(hù)提供參考，對(duì)兜蘭居群保護(hù)具有重要意義。