王春元,李　新,朱　茜,譚武兵,羅艷紅,何　玲

(吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南　吉首　416000)

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湘西土家藥羊蹄甲醇提取物體外抗氧化研究*

王春元,李新,朱茜,譚武兵,羅艷紅,何玲

(吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南吉首416000)

用醇提取湘西土家藥羊蹄甲活性成份并測定其體外抗氧化活性。采用DPPH法、LPO抑制法和超氧陰離子自由基清除法分別測定羊蹄甲醇提取物體外抗氧化活性。 結(jié)果表明：黃酮類提取物可有效地清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基。羊蹄甲醇提取物具有較強(qiáng)的體外抗氧化作用，其有效成分值得進(jìn)一步開發(fā)研究，并為以后的抗氧化研究提供參考依據(jù)。

土家藥；羊蹄甲；抗氧化

羊蹄甲是土家醫(yī)學(xué)名貴草藥，在《中華本草》一書中稱為雙腎藤，別名有夜關(guān)門、截葉鐵掃帚、馬蹄、羊蹄藤、豬腰藤、馬鞍藤、鷹爪風(fēng)。湘西土家族地區(qū)地處武陵山片區(qū)，藥物資源豐富，其中土家藥材羊蹄甲含多種藥用功效，具有補(bǔ)肝腎、益肺陰、散瘀消腫的作用，功能主治收斂固澀、解毒除濕、咳嗽、吐血、便血、遺尿、尿頻、白帶、子宮脫垂、痢疾、痹痛、疝氣、睪丸腫痛、濕疹、瘡癤腫痛等[1]。黃酮類化合物是一類重要的天然有機(jī)化合物，它能清除生物體內(nèi)的自由基, 具有抗氧化作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，從植物體中分離出來的黃酮類化合物有多種藥理作用：抗腦缺血、抗自由基、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、預(yù)防心腦血管疾病[3]。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前對羊蹄甲在本草學(xué)方面有所研究，但對湘西土家族特色藥物羊蹄甲其抗氧化性功能仍缺乏深入研究。故本實(shí)驗以湘西土家藥材羊蹄甲為研究對象，采用傳統(tǒng)技術(shù)和現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合的方法提取純化羊蹄甲抗氧化成份，采用DPPH法、LPO抑制法和超氧陰離子自由基清除法分別測定羊蹄甲醇提取物體外抗氧化活性，并對羊蹄甲黃酮成分在體外抗氧化作用進(jìn)行了初步研究，最終整理數(shù)據(jù)并用數(shù)學(xué)統(tǒng)計法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，得出羊蹄甲體外抗氧化性活性，為今后羊蹄甲中藥抗氧化成份的開發(fā)利用提供有價值的參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

羊蹄甲(采自湘西武陵山片區(qū))，60 ℃干燥后粉碎備用。

HPD-500型極性大孔樹脂；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、甲醇、無水乙醇、Tris-HCl、鄰苯三酚等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器

723型可見分光光度計(SP-723)；電子天平(AUY120)；干燥箱(HH.GF-1)；恒溫水浴鍋(SHH.W21)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52)；移液器；玻璃棒；燒杯；研缽；刻度試管；移液管；橡膠手套。

1.3實(shí)驗方法

1.3.1羊蹄甲黃酮的提取純化

準(zhǔn)確稱取樣品20.0 g 三份并放入錐形瓶中，以固液比 1:20加入 70%的乙醇溶液, 于KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器中1 h,超聲功率為200 W，提取溫度為70 ℃， 趁熱用 3 層紗布過濾, 濾渣用同樣方法進(jìn)行 2 次提取, 過濾, 合并3次抽濾所得濾液，并定容至200 mL容量瓶, 得到待測提取液，放入冰箱備用。將待測提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52)中去除酒精，用已預(yù)處理好的大孔樹脂吸附1 h，分離出的大孔樹脂以70%乙醇洗脫至近無色，此過程重復(fù)操作三次，得到純化的黃酮提取液。

1.3.2對羥自由基(·OH)清除能力的測定

根據(jù)文獻(xiàn)[5]方法，準(zhǔn)確配制一系列質(zhì)量濃度梯度(0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g/L)的待測溶液，取若干只試管編號，每只試管各加9 mmol/L FeSO4,9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL，最后加入12 mmol/L H2O22 mL啟動反應(yīng)，于37 ℃反應(yīng)30 min,以去離子水調(diào)零，在波長510 nm處測定樣品吸光度A1；以去離子水代替雙氧水重復(fù)上述操作，測得實(shí)驗本身的分光光度值A(chǔ)2;同樣，以水代替黃酮，測定分光光度值A(chǔ)0，按公式(1)計算各質(zhì)量濃度對羥自由基的清除率。維生素E為對照。

·OH清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(1)

式中：A0——自由基發(fā)生系統(tǒng)的吸光度

A1——待測吸光度值

A2——對照吸光度值

1.3.3對DPPH自由基清除能力的測定

根據(jù)文獻(xiàn)[6]方法，準(zhǔn)確稱取DPPH 0.02029 mg，用無水乙醇定容至100 mL，配成0.02% DPPH乙醇溶液，避光保存。準(zhǔn)確配制一系列質(zhì)量濃度梯度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L)的黃酮提純液。分別取各濃度待測提取液2 mL，加入DPPH乙醇溶液2 mL，混合均勻后避光靜置30 min，以溶劑為對照測定在517 nm處吸光度值A(chǔ)1。然后取各濃度提取液2 mL 與2 mL乙醇溶液混合后測在517 nm處的吸光度值A(chǔ)2。再測2 mL DPPH乙醇溶液與2 mL溶劑混合后在517 nm處的吸光度值A(chǔ)0。自由基的清除率按公式(2)計算。

DPPH清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(2)

式中：A0——自由基發(fā)生系統(tǒng)的吸光度

A1——待測吸光度值

A2——對照吸光度值

(3)

式中：A0——空白管吸光度值

A1——樣品管吸光度值

A2——待測管吸光度值

2　結(jié)果與討論

2.1羊蹄甲黃酮對·OH的清除能力

表1顯示了羊蹄甲黃酮對·OH自由基有較強(qiáng)的清除能力。由表1可知，在一定的濃度范圍內(nèi),隨著各物質(zhì)濃度的增加，對·OH自由基清除能力逐漸增強(qiáng)。黃酮濃度為24.4 mg/L時，對DPPH自由基抑制率達(dá)到18.62%。

表1　對·OH自由基的清除作用

2.2羊蹄甲黃酮對DPPH自由基的清除能力

表2顯示了羊蹄甲黃酮提取物有較強(qiáng)地清除DPPH自由基的能力。在一定的濃度范圍內(nèi),隨著各物質(zhì)濃度的增加，對DPPH自由基清除能力逐漸增強(qiáng)。黃酮濃度為24.4 mg/L時，對DPPH自由基抑制率達(dá)到41.74%。

表2　對DPPH自由基的清除作用

表3顯示了羊蹄甲黃酮提取物有較強(qiáng)地清除DPPH自由基的能力。在一定的濃度范圍內(nèi),隨著各物質(zhì)濃度的增加，對DPPH自由基清除能力逐漸增強(qiáng)。黃酮濃度為24.4 mg/L時，對DPPH自由基抑制率達(dá)到42.64%。

表3　對超氧陰離子·的清除作用

3　結(jié)　論

(1)本實(shí)驗通過醇提取和超聲波方法輔助，能有效提取并得到純化的羊蹄甲黃酮提取物；

(2)研究結(jié)果顯示，在一定黃酮劑量范圍內(nèi)，清除自由基能力與劑量存在量效關(guān)系,隨著添加黃酮量的增加，對自由基的清除能力也在逐漸增強(qiáng),大夜關(guān)門提取物中的黃酮類化合物對DPPH自由基、羥基自由基均有較強(qiáng)的清除能力，提示羊蹄甲黃酮是一種極具有潛力的天然抗氧化劑。

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[3]葉雪芳.植物黃酮類化合物的生物學(xué)功能及其在動物生產(chǎn)上的應(yīng)用研究[A]. 4th International Symposium on Animal Nutrition,Health and Feed Additive[C].2009：607-614.

[4]章文.HPLC法測定夜關(guān)門中牡荊苷的含量[J].藥品鑒定,2012,19(11)：49-50.

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Study on the Extraction of Tujia Medicine Bauhinia Aingredients and Antioxidant in Xiangxi*

WANG Chun-yuan, LI Xin, ZHU Qian, TAN Wu-bing, LUO Yan-hong, HE Ling

(Medical College of Jishou University, Hunan Jishou 416000, China)

Xiangxi Tujia medicine Bauhinia active ingredients were extracted and its antioxidant activity in vitro was determined. The DPPH method, LPO inhibition method and superoxide anion radical clearing method were used to determine the antioxidant activity in vitro of antioxidant. Results showed that the fruit extract antioxidant activity was from strong to weak followed by jujube, wild grapes, citrus, grapefruit, persimmon, kiwi, August melon, snow lotus fruit. Bauhinia has strong antioxidant effect, its effective component is worth for further research and development, and provides the reference to fruit antioxidant research.

Tujia medicine；Bauhinia；antioxidant

2015年吉首大學(xué)研究性學(xué)習(xí)與創(chuàng)新性實(shí)驗計劃項目(77號)；2015年湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目(201581號)。

王春元(1996-)，女，臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)。

何玲(1969-)，女，副教授，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)及實(shí)驗技術(shù)研究。

R931.7

A

1001-9677(2016)01-0071-03