宣麗穎， 陶謝鑫， 趙雅君， 戈宏焱， 包麗紅， 王大鵬， 趙　明△

(1. 內(nèi)蒙古民族大學醫(yī)學院， 2. 內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院， 通遼 028000)

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黃芪總黃酮對柯薩奇B3病毒感染乳鼠心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及Calumenin蛋白和縫隙連接蛋白CX43的作用*

宣麗穎1， 陶謝鑫2， 趙雅君2， 戈宏焱2， 包麗紅1， 王大鵬2， 趙明2△

(1. 內(nèi)蒙古民族大學醫(yī)學院， 2. 內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院， 通遼 028000)

目的：研究黃芪總黃酮對柯薩奇B3病毒(CVB3)感染心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白(calumenin)及縫隙連接蛋白43(CX43)作用。方法：原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞分3組：對照組(正常細胞)、柯薩奇病毒感染組(正常細胞)、黃芪總黃酮組(正常細胞+黃芪總黃酮)?？滤_奇病毒感染組感染，黃芪總黃酮組感染同時給予黃芪總黃酮20 mg/L。采用免疫組化方法檢測培養(yǎng)乳鼠心肌細胞α-SMA蛋白， Western blot技術(shù)檢測各組心肌細胞Calumenin蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78，CX43表達。結(jié)果：①與對照組相比，柯薩奇病毒感染組心肌細胞GRP78表達增多(P<0.01)，calumenin蛋白及CX43表達減少(P<0.01)；與柯薩奇病毒感染組比較，黃芪總黃酮組心肌細胞GRP78表達減少(P<0.01)，Calumenin蛋白及CX43表達增多(P<0.01)。結(jié)論：CVB3可引發(fā)心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78表達增加進而發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并使Calumenin蛋白及CX43表達減少；黃芪總黃酮抑制CVB3感染心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78表達從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，同時使Calumenin蛋白及CX43表達增多，該實驗結(jié)果可能與其抗病毒性心肌炎并發(fā)心律失常作用密切相關(guān)。

柯薩奇B3病毒；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白；縫隙連接蛋白43；心肌細胞；乳鼠

病毒性心肌炎(viralmyocarditis,VMC)是由病毒(主要由柯薩奇病毒引起，另有腺病毒、腸道病毒、EB病毒、人皰疹病毒、細小病毒B19和巨細胞病毒等)侵犯心臟引起的心肌實質(zhì)或間質(zhì)的局限性或彌漫性病變[1]。心律失常是VMC常見臨床表現(xiàn)之一，常見心悸、胸悶、心前區(qū)疼痛、頭暈、乏力等癥狀，嚴重者出現(xiàn)暈厥甚至阿-斯綜合征，是造成VMC病人猝死的主要原因[2]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)在心肌等肌細胞內(nèi)稱肌漿網(wǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是跨膜蛋白及分泌蛋白合成所在的細胞器。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正確折疊蛋白質(zhì)功能異常，可能致誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)異常聚集及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性蛋白分泌增加，并且識別錯誤折疊蛋白，通過蛋白酶體將其降解，上述一系列反應(yīng)過程即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress，ERS)[3]。網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白(calumenin) 是一種位于哺乳動物心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)內(nèi)屬于CREC家族具有多個EF-hand 結(jié)構(gòu)的鈣離子(Ca2+)結(jié)合蛋白[4]，與Ryanodine(雷諾定)受體(RyR2)通道及Ca2+-ATPase( SERCA2a) 相互作用調(diào)節(jié)心肌細胞鈣釋放、鈣回攝與儲存，共同維持鈣循環(huán)穩(wěn)態(tài)[5]。文獻報道calumenin蛋白緩解心肌細胞ERS并減少ERS介導的心肌細胞凋亡數(shù)量[6]。

細胞間隙連接通訊在多種細胞行為的控制以及在維護組織和器官平衡起著重要作用。連接蛋白43(connexin 43,CX43)是心室縫隙連接的主要構(gòu)成成分，其分布及功能的改變對于縫隙連接的活性有重要影響[7]。然而參與調(diào)節(jié)縫隙連接調(diào)節(jié)機制還沒有被完全理解。那么，在病毒性心肌炎時心肌細胞calumenin蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及CX43表達關(guān)系是否存在相互調(diào)控目前還不得而知。

黃芪總黃酮(total flavonoids of astragalus,TFA)是從蒙古黃芪中分離的主要活性成分[8]。本課題組在實驗中發(fā)現(xiàn)TFA可顯著降低VMC小鼠心律失常發(fā)生率[9]，但作用機制尚未完全明確。本研究擬觀察柯薩奇B3病毒(coxsackievirus B3,CVB3)感染乳鼠心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78、calumenin蛋白及CX43表達及TFA對CVB3感染乳鼠心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78、網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白(calumenin)及縫隙連CX43作用。進而明確TFA抗VMC心律失常作用是否通過增加心肌細胞calumenin及CX43表達，抑制心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而實現(xiàn)的。

1　材料與方法

1.1動物藥品與儀器

1～3 d Balb/c新生乳鼠購置吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院動物中心,許可證號：scxk(吉)2011-0004; Calumenin antibody購于Bioss公司, GRP78 antibody，CX43 antibody，購于Boster公司，內(nèi)參抗體 β-actin購于wanleibio公司?？滤_奇B3病毒，Woodruf親心肌株由吉林大學農(nóng)牧學院提供。

1.2柯薩奇B3病毒感染心肌細胞模型制備

1.2.1病毒擴增Hela細胞用含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng), 在對數(shù)生長期接種病毒,每天觀察, 當90% 的細胞出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)后, 收集病毒液, 重復3次, 病毒懸液分裝于-80℃保存。用Reed-Mnench法測定病毒滴度。

1.2.2乳鼠心肌細胞的分離與培養(yǎng)將乳鼠心臟放入培養(yǎng)皿中，用PBS反復清洗。將清洗后的心臟組織剪碎至1～3 mm3小塊。加入0.1%Ⅱ型膠原酶以及0.1%胰蛋白酶混合液，37℃消化25 min。消化后將其移入15 ml離心管1 500 r/min離心7 min去上清。用PBS重懸沉淀，用吸管反復吹打后1 000 r/min離心5 min，用培養(yǎng)基重懸細胞，過200目篩網(wǎng)去除大塊組織。PBS清洗細胞兩次，1 000 r/min離心10 min，去上清，留沉淀。加入1 ml的培養(yǎng)基重懸細胞，進行細胞計數(shù)后放置到培養(yǎng)板中。成纖維細胞貼壁較快，2 h差速貼壁法可去除大量的成纖維細胞，上清懸液中為較純的心肌細胞。細胞放置在培養(yǎng)板后24 h不動，隨后每2天換一次液。培養(yǎng)細胞至密度為90%左右，PBS清洗2次。按實驗內(nèi)容將細胞接種于6孔板中，細胞濃度為5×104cells/ml，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。24 h后可進行轉(zhuǎn)染，細胞密度一般在70%為宜。

1.2.3免疫組織化學方法鑒定乳鼠培養(yǎng)心肌細胞為明確培養(yǎng)細胞為心肌細胞，對各組乳鼠培養(yǎng)心肌細胞進行免疫組化鑒定，經(jīng)下列實驗步驟(1)0.1%TritonX-100孵育；(2) 3%過氧化氫孵育；(3) 血清封閉；(4) 一抗孵育；(5)二抗孵育；(6)辣根酶標記；(7) DAB顯色；(8) 蘇木素復染；(9)鏡檢。

1.2.4柯薩奇B3病毒感染心肌細胞乳鼠心肌細胞按照細胞濃度為5×104cells/ml接種于6孔板，并將其置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，次日柯薩奇B3病毒感染組按每個心肌細胞感染100 PFU的CVB3病毒，黃芪總黃酮組按每個心肌細胞感染100 PFU的CVB3病毒，培養(yǎng)液加黃芪總黃酮20 mg/L，然后在37℃靜置于CO2培養(yǎng)箱中3 d。

1.3Western blot檢 測各組心肌細胞Calumenin蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78及CX43表達：

各組乳鼠心肌細胞經(jīng)下列實驗步驟：(1)蛋白質(zhì)抽提；(2)采用BCA法進行蛋白質(zhì)定量；(3)取15 μl的樣品進行SDS-PAGE；(4)轉(zhuǎn)印至PVDF膜；(5)封閉；(6)孵育一抗；(7)孵育二抗；(8)ECL底物發(fā)光；(9)圖像保存。普通抗體的封閉液、一抗孵育液、二抗孵育液為5%脫脂奶粉溶液。檢測各組心肌細胞calumenin蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78及CX43表達。

1.4統(tǒng)計學方法

2　結(jié)果

2.1各組乳鼠培養(yǎng)心肌細胞免疫組化

各組乳鼠培養(yǎng)心肌細胞經(jīng)免疫組化實驗，檢測出心肌細胞特有的ɑ-SMA蛋白，確定為心室肌細胞(圖1)。

Fig. 1Immunocytochemistry of culturing myocardial cell observed under microscope(×40)

A：Control group; B: Coxsackievirus B3 infection group; C: Total flavonoids of astragalus group

2.2各組心肌細胞Calumenin蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78及CX43表達

與對照組相比較，柯薩奇病毒感染組心肌細胞Calumenin蛋白表達顯著減少(P<0.01)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78表達顯著增加(P<0.01)，縫隙連接蛋白CX43表達顯著減少(P<0.01)；與柯薩奇病毒感染組比較，黃芪總黃酮組心肌細胞Calumenin蛋白表達顯著增加(P<0.01)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78表達顯著減少(P<0.01)，縫隙連接蛋白CX43表達顯著增加(P<0.01，圖2，表1)。

3　討論

本課題組在前期實驗中發(fā)現(xiàn)TFA可顯著降低柯薩奇B3病毒感染心肌細胞動作電位幅值(APA)，延長動作電位時程(APD)[10]；可顯著降低柯薩奇B3病毒感染心肌細胞鈉電流(ⅠNa)的幅值[11]；可顯著增加柯薩奇B3病毒感染心肌細胞內(nèi)向整流鉀電流(IK1) 的幅值[12]；近期研究發(fā)現(xiàn)TFA能明顯提高VMC小鼠急性期心肌組織CX43 mRNA及蛋白表達[13，14]；黃芪總黃酮延長病毒性心肌炎小鼠心室肌細胞L-型鈣通道關(guān)閉時間，減少開放時間抑制鈣電流減輕心肌細胞鈣超載[15]。上述實驗結(jié)果說明TFA對VMC并發(fā)心律失常具有保護性作用，可減少心律失常發(fā)生，并能部分解釋TFA減少VMC并發(fā)心律失常的作用機制，但TFA對VMC并發(fā)心律失常發(fā)揮作用的機制尚未完全闡明。

Fig. 2Expression change of endoplasmic reticulum chaperone GRP78, calumenin and CX43

A：Control group; B: Coxsackievirus B3 infection group; C: Total flavonoids of astragalus group; GRP 78: Glucose-regulated protein 78; CX43: Connecxin 43

Tab. 1Expression change of endoplasmic reticulum chaperone GRP78, calumenin and CX43

GroupGRP78CalumeninCX43A1628±1392864±2142027±187B1944±175**1433±108**1646±131**C2624±231##1221±106##2369±211##

A：Control group; B: Coxsackievirus B3 infection group; C: Total flavonoids of astragalus group; GRP 78: Glucose-regulated protein 78; CX43: Connecxin 43

**P<0.01vsA group;?##P<0.01vsB group

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白-78 ( glucose-regulated protein 78,GRP78) , 又稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白( binding immunog lobulin heavy chain protein, Bip) 發(fā)揮了關(guān)鍵作用。GRP78/Bip 屬于HSP70 家族, 可以結(jié)合未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì), 促進新生蛋白質(zhì)的正確折疊, 防止未折疊、錯誤折疊蛋白質(zhì)的聚集。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下, GRP78/Bip 的表達上調(diào)非常明顯, 因而GRP78/Bip 的誘導表達被廣泛用于ERS激活的標志[16]。 我們在前期實驗中還觀察病毒性心肌炎小鼠心肌細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[17]，同時黃芪總黃酮可抑制病毒性心肌炎小鼠心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，對心肌細胞具有保護作用[18,19]，文獻報道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導致心肌細胞縫隙連接蛋白表達減少及功能失調(diào)[20]。本實驗觀察到CVB3可引發(fā)原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，以及calumenin蛋白及CX43表達減少；黃芪總黃酮抑制CVB3感染心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，同時使calumenin蛋白及CX43表達增多，根據(jù)實驗結(jié)果我們推斷黃芪總黃酮抗病毒性心肌炎并發(fā)心律失常作用機制可能與其增加calumenin蛋白及CX43表達，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78表達緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。但仍有一些問題尚待明確，比如CVB3引發(fā)原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞是先發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，繼而calumenin蛋白及CX43表達減少；還是先出現(xiàn)calumenin蛋白表達減少，繼而發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及CX43表達減少。目前尚不清楚，需要在后續(xù)實驗中先沉默乳鼠心肌細胞calumenin蛋白，再感染CVB3，檢測各組心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，calumenin蛋白及CX43表達，從而明確這一發(fā)病機制。

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Effect of total flavonoids of astragalus on endoplasmic reticulum chaperone, calumenin and connecxin 43 in suckling mouse myocardium with myocarditis caused by coxsackievirus B3

XUAN Li-ying1, TAO Xie-xin2, ZHAO Ya-jun2, GE Hong-yan2, BAO Li-hong1, WANG Da-peng2， ZHAO Ming2△

(1. Medical College, The Inner-mongolia National University, 2. Affiliated Hospital of the Inner-mongolia National University, Tongliao 028000, China)

Objective: To investigate the effect of total flavonoids of astragalus on the expression of endoplasmic reticulum chaperone, calumenin and connecxin 43 (CX43) in suckling mouse myocardium with myocarditis caused by coxsackievirus B3(CVB3). Methods: The primary culture of suckling mouse myocardium cells were randomly divided into control group, CVB3 infected group and total flavonoids of astragalus group. Firstly, to confirm the identity of the suckling mouse myocardium, α-SMA was monitored by immunohistochemistry method. Then the protein expression changes of endoplasmic reticulum chaperone-glucose regulatory protein 78(GRP78), calumenin and CX43 were detected by Western blot. Results: ①Compared with that of the control group, the GRP78 expression level in CVB3 infected group was improved, the expression levels of calumenin and CX43 were all reduced. ②Compared with that of CVB3 infected group, GRP78 expression level was decreased, and the expression levels of calumenin and CX43 were increased in total flavonoids of astragalus group. Conclusion: CVB3 infection may cause endoplasmic reticulum stress of rat myocardium cells by increasing the expression of GRP78 and decreasing the expression of calumenin and CX43. On the other hand, total flavonoids of astragalus can reduce the expression of GRP78 and increase the expression of calumenin and CX43.The results of this experiment may be closely related to the effects of anti- arrhythmia with viral myocarditis caused by CVB3.

coxsackievirus B3;endoplasmic reticulum stress;calumenin;connecxin43；myocardium；suckling mouse

國家自然科學基金資助項目(81360587)

2015-05-25

2015-09-28

△Tel: 13474859991； Email: langzhe73@163.com

R331.3

A

1000-6834(2016)01-051-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.013