周禮華，陳　沖，張　朋，王　力，吳學(xué)森

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

氯氰菊酯對(duì)小鼠小腦組織氧化損傷及核轉(zhuǎn)錄因子-E2相關(guān)因子2基因表達(dá)的影響

周禮華，陳沖，張朋，王力，吳學(xué)森

目的：研究氯氰菊酯對(duì)小鼠小腦組織氧化損傷及核轉(zhuǎn)錄因子-E2相關(guān)因子2(Nrf2)基因表達(dá)的影響。方法：以40只昆明小鼠為受試動(dòng)物，隨機(jī)分為4組，包括1個(gè)陰性對(duì)照組和3個(gè)氯氰菊酯染毒組，染毒組按5、10、20 mg/kg 3個(gè)劑量水平灌胃染毒小鼠3周，以小腦組織勻漿測(cè)定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)的含量；用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Nrf2在小腦組織細(xì)胞中的表達(dá)；用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)Nrf2基因表達(dá)。結(jié)果：隨著氯氰菊酯染毒劑量升高，小腦組織MDA含量逐漸增加，GSH-PX、T-SOD、CAT等酶學(xué)活性逐漸下降，染毒組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。免疫組織化學(xué)法顯示，隨著染毒劑量增加，小鼠小腦組織細(xì)胞核Nrf2陽性細(xì)胞表達(dá)增加，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，高劑量染毒組胞核陽性細(xì)胞表達(dá)均高于低劑量染毒組(P<0.01)。RT-PCR顯示，隨著染毒劑量增加，Nrf2條帶光密度值增加，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，高劑量染毒組基因表達(dá)均高于低劑量染毒組(P<0.01)。結(jié)論：CYP染毒造成小鼠小腦組織氧化損傷，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)中關(guān)鍵分子Nrf2由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，從而增強(qiáng)腦組織對(duì)抗氧化應(yīng)激的能力。

氯氰菊酯；氧化損傷；核轉(zhuǎn)錄因子-E2相關(guān)因子2；小鼠

氯氰菊酯(cypermethrin,CYP)屬于Ⅱ型除蟲菊酯類農(nóng)藥，長(zhǎng)期低劑量接觸該類農(nóng)藥，可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)、糖代謝紊亂甚至癌癥的發(fā)生[1-2]。腦組織是機(jī)體氧化代謝最活躍的器官，含有高濃度多不飽和脂肪酸，對(duì)脂質(zhì)過氧化作用高度敏感，其抗氧化能力卻低于其他主要器官，因此防御自由基損傷的能力較差。CYP可以跨過血腦屏障，選擇性地作用于腦組織，誘導(dǎo)該部位產(chǎn)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷、退行性變、凋亡或壞死[3-5]。核轉(zhuǎn)錄因子-E2 相關(guān)因子 2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2) 是氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子，生理狀態(tài)下與胞質(zhì)蛋白伴侶分子 Keap1結(jié)合，Nrf2的功能處于抑制狀態(tài)，當(dāng)受到內(nèi)外界自由基和化學(xué)物質(zhì)刺激時(shí)，Nrf2與Keap1解離而活化，活化的Nrf2由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)結(jié)合，同時(shí)激活下游抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，如血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)等抗氧化和解毒酶，從而保護(hù)機(jī)體免受相關(guān)物質(zhì)的侵害[6-8]。與大腦相比，小腦不飽和脂肪酸含量更高，更易受到自由基的侵襲。本研究擬通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量CYP染毒對(duì)小鼠小腦組織氧化應(yīng)激、Nrf2基因表達(dá)的影響，從而探討CYP的神經(jīng)毒作用機(jī)制，為合理選擇農(nóng)藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組選用安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康成年雄性昆明小鼠40只[合格證號(hào):SCXR(皖)]，體質(zhì)量為(30.59±2.64)g。動(dòng)物飼養(yǎng)溫度(24±2)℃，相對(duì)濕度(50±10)%，以商業(yè)鼠糧飼養(yǎng)小鼠，實(shí)驗(yàn)期間小鼠可自由進(jìn)食飲水。40只昆明小鼠隨機(jī)分成4組，包括1個(gè)陰性對(duì)照組和3個(gè)氯氰菊酯染毒組，每組10只。參考文獻(xiàn)[9]，染毒組的劑量確定為5、10、20 mg/kg 3個(gè)劑量水平，連續(xù)3周經(jīng)口灌胃染毒，每日灌胃前稱取小鼠體質(zhì)量，灌胃體積為0.01 mL·g-1·kg-1，灌胃6 d，休息1 d。

1.1.2主要試劑與儀器氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司,純度99%)，丙二醛(malonaldehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)、CAT、總蛋白定量測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Nrf2兔抗鼠多克隆抗體(anbobio公司)，RNA提取試劑(北京天根生化科技有限公司)，RT、PCR試劑盒(Ferments公司)。低溫離心機(jī)(德國 Eppendorf 公司)，生物倒置顯微鏡(日本Olympus 公司)，Synergy2型酶標(biāo)儀(美國Biotek 公司)，PCR 梯度擴(kuò)增儀(東勝龍公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1一般情況觀察實(shí)驗(yàn)期間，觀察各組小鼠神態(tài)、攝食及活動(dòng)情況，每天稱取體質(zhì)量，對(duì)體質(zhì)量變化進(jìn)行分析。

1.2.2氧化、抗氧化指標(biāo)檢測(cè)制備組織勻漿，按試劑盒說明書要求檢測(cè)MDA含量及T-SOD、GSH-Px、CAT活性，組織勻漿的蛋白含量采用總蛋白定量測(cè)試盒測(cè)定。

1.2.3免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Nrf2陽性細(xì)胞表達(dá)多聚甲醛固定小腦組織24 h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚約 4 μm，隔 5取1，每份標(biāo)本選取10張，免疫組織化學(xué)檢測(cè)小腦組織Nrf2蛋白表達(dá)。按照試劑盒說明進(jìn)行具體操作。細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核被染成棕黃色顆粒為Nrf2 陽性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選擇 5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞后取平均值。

1.2.4RT-PCR分析基因表達(dá)采用RNA提取試劑盒分組提取總RNA，取光密度值在1.8～2.0之間的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄步驟按試劑盒程序進(jìn)行，每組取cDNA 2 μL進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為50 μL。(1)Nrf2擴(kuò)增片段215 bp；引物序列正義5′-TTC CTC TGC TGC CAT TAG TCA GTC-5′、反義5′-GCT CTT CCA TTT CCG AGT CAC TG-3′；擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，57.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。(2)β-actin擴(kuò)增片段150 bp；引物序列正義5′-AGT GTG ACG TTG ACA TCC GTA-3′、反義5′-GCC AGA GCA GTA ATC TCC TTC T-3′；擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物行凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶光密度半定量分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1小鼠一般情況觀察對(duì)照組小鼠攝食正常、神態(tài)安詳、毛色具有光澤。染毒組小鼠精神欠佳、毛色晦暗，小鼠耳朵、尾巴和爪子出現(xiàn)不同程度的撕咬痕跡，尤其是高劑量組，傷痕最明顯。染毒前各組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，染毒結(jié)束后，各組小鼠體質(zhì)量均較染毒前增加(P<0.01)，各組小鼠體質(zhì)量增加程度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

2.2小鼠小腦組織T-SOD、GSH-Px、CAT和MDA含量比較染毒組小鼠小腦組織MDA含量均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，而3組CYP染毒小鼠小腦組織MDA含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨著染毒劑量增加，小鼠小腦組織T-SOD、GSH-Px、CAT活性逐漸降低，各染毒組與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表2)。

表1　4組小鼠染毒前后體質(zhì)量比較(ni=10；；g)

組內(nèi)配對(duì)t檢驗(yàn)：**P<0.01

2.34組小鼠小腦組織Nrf2陽性細(xì)胞表達(dá)比較Nrf2蛋白集中分布在小腦組織細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核表達(dá)較弱。CYP染毒后，細(xì)胞核Nrf2陽性細(xì)胞比例逐漸增加，細(xì)胞質(zhì)表達(dá)逐漸減少(見圖1)，CYP 10 mg/kg和20 mg/kg組細(xì)胞質(zhì)Nrf2陽性細(xì)胞表達(dá)均低于對(duì)照組(P<0.05～P<0.01)，而CYP 20 mg/kg組細(xì)胞質(zhì)Nrf2陽性細(xì)胞表達(dá)均低于CYP 5 mg/kg和10 mg/kg組(P<0.05)。CYP 10 mg/kg和20 mg/kg組胞核Nrf2陽性細(xì)胞表達(dá)均高于對(duì)照組與CYP 5 mg/kg組(P<0.05～P<0.01)，而CYP 20 mg/kg組細(xì)胞核Nrf2陽性細(xì)胞表達(dá)顯著高于CYP 10 mg/kg組(P<0.01)(見表3)。

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較**P<0.01；與CYP 5 mg/kg組比較△△P<0.01；與CYP 10 mg/kg組比較##P<0.01

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01；與CYP 5 mg/kg組比較△P<0.05，△△P<0.01；與CYP 10 mg/kg組比較#P<0.05，##P<0.01

2.44組小鼠小腦組織Nrf2 mRNA表達(dá)比較染毒后，CYP 5 mg/kg組Nrf2 mRNA表達(dá)與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CYP 10、20 mg/kg組條帶較對(duì)照組清晰(見圖2)，2組Nrf2 mRNA表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；同時(shí)，CYP 10、20 mg/kg組條帶光密度值亦均顯著高于CYP 5 mg/kg組(P<0.01)(見表4)。

3　討論

隨著CYP施用面積的增加，其毒性也逐漸受到重視。氧化應(yīng)激是CYP公認(rèn)的毒性機(jī)制，而Nrf2 能夠誘導(dǎo)基因?qū)寡趸瘧?yīng)激，活化機(jī)體自身的保護(hù)性反應(yīng)，甚至在外源性抗氧化物，如維生素C、維生素E

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較**P<0.01；與CYP 5 mg/kg組比較ΔΔP<0.01

缺乏的情況下，也能阻止各種氧化應(yīng)激相關(guān)的并發(fā)癥。Nrf2 通過與 ARE 相互作用調(diào)節(jié)編碼抗氧化蛋白，啟動(dòng)Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞組織的正常功能[10-12]。

本研究證實(shí)，CYP導(dǎo)致小腦組織產(chǎn)生更多的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，并使GSH-PX、T-SOD、CAT等酶學(xué)活性下降，最終導(dǎo)致抗氧化能力下降，且隨著染毒劑量增加對(duì)酶學(xué)活性的影響越大。免疫組織化學(xué)法顯示，染毒組細(xì)胞核Nrf2陽性細(xì)胞表達(dá)高于對(duì)照組，同時(shí)，陽性細(xì)胞表達(dá)與染毒劑量相關(guān)，高劑量染毒組Nrf2陽性細(xì)胞表達(dá)高于低劑量染毒組。RT-PCR顯示，染毒組Nrf2 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組，中、高劑量染毒組mRNA表達(dá)量與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)，中、高劑量染毒組與低劑量染毒組差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)，顯然，CYP對(duì)小鼠小腦組織的損傷具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。CYP染毒造成抗氧化應(yīng)激能力下降，機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激的同時(shí)，內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)被激活，導(dǎo)致Nrf2 與 Keap1 解離，Nrf2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核，誘導(dǎo)下游抗氧化靶基因表達(dá)，從而增強(qiáng)腦組織的抗氧化能力。文獻(xiàn)[13-17]報(bào)道，溴氰菊酯能夠影響Nrf2/ARE 轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，增加 Nrf2 基因及其下游基因 GCS 的轉(zhuǎn)錄水平，七氟烷可以通過激活 Nrf2 信號(hào)通路誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元 HO-1 mRNA 表達(dá)。可見下游基因的表達(dá)增強(qiáng)是由激活的 Nrf2 所介導(dǎo)，Nrf2通過抗氧化損傷作用而進(jìn)一步發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

CYP暴露可以降低機(jī)體抗氧化能力，誘導(dǎo)小腦組織氧化損傷，造成促氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，同時(shí)激活Nrf2，使Nrf2由胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)位，從而增強(qiáng)腦組織對(duì)抗氧化應(yīng)激的能力?？寡趸瘎┛赡芫哂蟹乐蜟YP中毒的效果，增強(qiáng)抗氧化酶的活性可能是防治CYP中毒的有效途徑。

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(本文編輯劉璐)

Effect of cypermethrin on the oxidative damage and mRNA expression of nuclear factor erythroid-2-related factor 2 in mice cerebellar tissue

ZHOU Li-hua,CHEN Chong,ZHANG Peng,WANG Li,WU Xue-sen

(DepartmentofPreventiveMedicine,BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233030,China)

Objective:To observe the effects of cypermethrin on the oxidative damage and gene expression of nuclear factor erythroid-2-related factor 2(Nrf 2) mRNA in mice cerebellar tissue.Methods:Forty male Kunming mice were randomly divided into one negative control group and three cypermethrin infection groups.Three cypermethrin infection groups were infected by 5,10 and 20 mg/kg of cypermethrin gavage,once daily for three weeks,respectively.The contents of MDA,GSH-Px,T-SOD and CAT and MDA were measured in cerebellar tissue.The mRNA and protein expressions of Nrf2 in cerebellar tissue were detected using reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and immunohistochemistry(IHC),respectively.Results:With the dose of cypermethrin increasing,the level of MDA increased,the levels of GSH-Px,T-SOD and CAT decreased in cerebellar tissue,and the differences of whose between the cypermethrin infection group and control group were statistically significant(P<0.01).The immunohistochemistry result showed that the positive expression of Nrf2 in nucleus increased in cerebellar tissue with the dose of cypermethrin increasing,the difference of which between the cypermethrin infection group and control group were statistically significant(P<0.01).The positive expression of Nrf2 in nucleus in high-dose cypermethrin infection group was higher than that in low-dose cypermethrin infection group(P<0.01).The RT-PCR results showed that the optical density value of Nrf2 increased in cerebellar tissue with the dose of cypermethrin increasing,the difference of which between the cypermethrin infection group and control group were statistically significant(P<0.01).The mRNA expression level of Nrf2 in high-dose cypermethrin infection group was higher than that in low-dose cypermethrin infection group(P<0.01).Conclusions:The cypermethrin infection can lead to the oxidative damage in cerebellar tissue and induce the translocation of Nrf2 from the cytoplasm to the nucleus,which can strength the antioxidative capacity of brain tissue.

cypermethrin;oxidative damage;nuclear factor-erythroid 2-related factor 2;mice

2016-04-26

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1508085QH188)；安徽省特色專業(yè)“預(yù)防醫(yī)學(xué)”項(xiàng)目(皖教高[2011]5號(hào))

單位] 蚌埠醫(yī)學(xué)院 預(yù)防醫(yī)學(xué)系，安徽 蚌埠 233030

[作者簡(jiǎn)介] 周禮華(1977-)，女，碩士，講師.

1000-2200(2016)07-0845-05

R 595.4

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.07.002