葉紅玲， 劉 冬， 葉 明， 黃守敏

(1.安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林園藝系，安徽安慶 246003；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009)

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復(fù)合益生菌對(duì)昆明小鼠生長(zhǎng)性能和腸道酶活性的影響

葉紅玲1， 劉 冬1， 葉 明2， 黃守敏1

(1.安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林園藝系，安徽安慶 246003；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009)

[目的]探討飼料中添加復(fù)合益生菌對(duì)斷奶小鼠的安全性及其腸道酶活性的影響。[方法]以蠟樣芽孢桿菌B1-1、蠟樣芽孢桿菌JC128和乳酸桿菌SL1-5制備復(fù)合益生菌劑。以復(fù)合益生菌飼喂昆明小鼠，評(píng)價(jià)其安全性，并分析其對(duì)斷奶昆明小鼠生長(zhǎng)性能、腸道纖維素酶活和蛋白酶活力的影響。[結(jié)果]此3株菌株制備的復(fù)合益生菌安全的較好，能顯著提高昆明小鼠日增重。試驗(yàn)組的小鼠在飼喂含有復(fù)合益生菌制劑的添加劑后，其腸道內(nèi)的蛋白酶活和纖維素酶活都明顯高于對(duì)照組。[結(jié)論]復(fù)合益生菌能夠顯著提高昆明小鼠的生長(zhǎng)性能和腸道內(nèi)酶活力。

復(fù)合益生菌；生長(zhǎng)性能；蛋白酶；纖維素酶

Fuller[1]將益生菌定義為“活著的、對(duì)宿主有益的、能夠維持腸內(nèi)微生態(tài)平衡的微生物飼料添加劑”。Havenaar等[2]于1994年對(duì)益生菌的定義進(jìn)行了修訂：益生菌是含活菌和死菌，包括其組分和產(chǎn)物的微生物制品，經(jīng)口腔或其他黏膜途徑攝入，旨在改善粘膜表面微生物或酶的平衡，或者刺激特異性或非特異性免疫機(jī)制。目前益生菌是泛指對(duì)人和動(dòng)物機(jī)體有益的微生物，是一種通過(guò)改善腸道菌群平衡而對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生有益作用的活微生物飼料添加劑，包括乳酸菌、芽孢桿菌、雙歧桿菌、酵母菌等多種復(fù)合或單一培養(yǎng)物。

益生菌因其安全、高效、不產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)而具有巨大的潛能。益生菌主要通過(guò)以下途徑在動(dòng)物和人機(jī)體內(nèi)發(fā)揮其作用：①補(bǔ)充有益菌群，維持消化道菌群平衡，預(yù)防和治療菌群失調(diào)[3]；②直接產(chǎn)生氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，補(bǔ)充機(jī)體營(yíng)養(yǎng)成分，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)[4]；③協(xié)助機(jī)體消除毒素和有害代謝產(chǎn)物[5]；④提高機(jī)體免疫力；⑤產(chǎn)生多種有助于消化吸收的酶類(lèi)(如蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶等)，從而增加宿主總酶活性。將益生菌作為飼料添加劑，可以提高飼料利用率，降低成本，在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、減少糞便排放、改善生態(tài)環(huán)境和動(dòng)物疾病防治等方面效果明顯，在飼料領(lǐng)域受到極大關(guān)注[6]。此外，抗生素在飼料中的濫用會(huì)通過(guò)食物鏈傳遞間接被人體吸收，抗生素的毒性反應(yīng)對(duì)腎臟和肝臟等臟器有損害，同時(shí)還會(huì)造成耐藥菌株不斷產(chǎn)生[7]。有研究人員以蠟樣芽孢桿菌作為益生菌替代飼料，飼喂斷奶仔豬能夠提高其體重，促進(jìn)飼料轉(zhuǎn)化率，降低斷奶仔豬的腹瀉率和死亡率，因此已被廣泛用作畜牧場(chǎng)的飼料添加劑[8]。乳酸桿菌在國(guó)際上被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品及飼料中，沒(méi)有明顯的副作用。此外，乳酸桿菌的毒性也可能依附在芽孢桿菌和乳酸桿菌這些菌株中。因此，在畜禽生產(chǎn)中添加益生菌作為飼料添加劑前，使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究菌株的安全性是很有必要的[9]。隨著人民生活水平和消費(fèi)水平的提高，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力壓力的增加以及對(duì)濫用抗生素危害認(rèn)識(shí)的深入，益生菌制劑受到越來(lái)越多的關(guān)注，其在飼料和功能食品領(lǐng)域必將具有十分廣闊的發(fā)展空間[10]。筆者使用蠟樣芽孢桿菌B1-1、蠟樣芽孢桿菌JC128和乳酸桿菌SL1-5益生菌進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其安全性，分析其對(duì)昆明小鼠生長(zhǎng)性能、腸道纖維素酶活性和蛋白酶活性的影響。

1　材料與方法

1.1菌株和培養(yǎng)基纖維素酶產(chǎn)生菌B1-1和蛋白酶產(chǎn)生菌JC128 使用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，乳酸桿菌SL1-5 在MRS液體培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)24 h后達(dá)到穩(wěn)定期。制備含有蠟樣芽孢桿菌B1-1、蠟樣芽孢桿菌JC128和乳酸桿菌SL1-5的培養(yǎng)物，且近似濃度達(dá)到1×108CFU/mL或1×109CFU/mL。使用LB和MRS培養(yǎng)基檢測(cè)活菌數(shù)。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物及其飼養(yǎng)管理40只健康的斷奶昆明小鼠，雌雄各半，體重為13～15 g(平均體重為14 g)，分成4籠，每籠10只小鼠。使用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室飼料飼喂小鼠，自由飲水。在試驗(yàn)期間維持光照和黑暗按照常態(tài)旋回，控制溫度在(22±2)℃，濕度(55±2)%。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)在試驗(yàn)條件下馴化小鼠24 h。每天補(bǔ)充飲用水，并更換飼料。毒物學(xué)研究持續(xù)10 d，而促生長(zhǎng)試驗(yàn)持續(xù)14 d。盡管每天記錄每只小鼠的體重，在試驗(yàn)?zāi)┢谝惨粜挠^察小鼠毛發(fā)的光澤。在試驗(yàn)結(jié)束前，所有的小鼠都使用頸部脫臼致死。

1.4亞急性毒性試驗(yàn)將40只小鼠隨意分成4組，每組10只小鼠，并在試驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)每只小鼠進(jìn)行稱(chēng)重。試驗(yàn)組Ⅰ小鼠飲用無(wú)菌蒸餾水，試驗(yàn)組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的小鼠分別飲用濃度1×108CFU/mL 或1×109CFU/mL的菌株B1-1、JC128和SL1-5的菌懸液，通過(guò)針管(長(zhǎng)5 cm，直徑3 mm)灌胃，每天3次，持續(xù)10 d ( 3×108CFU/d或3×109CFU/d) 。每天記錄試驗(yàn)小鼠的生長(zhǎng)和死亡情況，觀察每只小鼠臟器的肉眼病理學(xué)特征。取小鼠的脾和肝，并精確稱(chēng)重。

1.5復(fù)合益生菌制劑蠟樣芽孢桿菌B1-1、蠟樣芽孢桿菌JC128在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，乳酸桿菌SL1-5在MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，37 ℃下培養(yǎng)24 h，以獲得穩(wěn)定期。離心分離后獲得菌株，使用無(wú)菌水洗滌2次，懸浮1次。乳酸桿菌SL1-5的接種物濃度約1×108CFU/mL或1×109CFU/mL。

通過(guò)口腔灌胃的方法，每天給小鼠飼喂?jié)舛葹?×108CFU/mL或1×109CFU/mL復(fù)合益生菌制劑，持續(xù)14 d。試驗(yàn)動(dòng)物飼喂標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室飼料，自由飲水。對(duì)照組動(dòng)物飲用無(wú)菌的蒸餾水。

1.6生長(zhǎng)性能評(píng)價(jià)每天使用電子天平(Sartorius BP2100)稱(chēng)量試驗(yàn)動(dòng)物的體重。增重為每只小鼠的最終體重減去最初體重的平均值。比生長(zhǎng)速率(SGR)反映小鼠的生長(zhǎng)速率。每天每籠飼料攝取(FI)及水?dāng)z取可以表示為每個(gè)動(dòng)物在整個(gè)時(shí)期分配飼料或水消耗除去動(dòng)物的數(shù)目。消耗指數(shù)等于FI與WG的比值。

1.7腸道酶活力的測(cè)定剝離出各個(gè)片段粗糙的腸混合物于4 ℃下保存。分離腸的樣品用冷蒸餾水漂洗。蛋白酶活力的測(cè)定參照Lowry等[11]的方法，采用福林-酚法；纖維素酶活力的測(cè)定依據(jù)Lungisa等[12]和Zhou等[13]的方法。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan’s多重比較和ANOVA方差分析。P<0.05表示差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1亞急性毒性試驗(yàn)整個(gè)試驗(yàn)期間，試驗(yàn)動(dòng)物沒(méi)有腹瀉、疾病或死亡。在試驗(yàn)期末，所有飼喂細(xì)菌的小鼠都活著且是健康的。然而，處理組和對(duì)照組試驗(yàn)動(dòng)物的毛發(fā)光澤沒(méi)有明顯的差異。處理組小鼠毛發(fā)光滑且潔白。從圖1可以看出，飼喂不同細(xì)菌和水對(duì)小鼠的肝重/體重、脾重/體重、脾重/肝重沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。

圖1　益生菌對(duì)小鼠的肝重/體重、脾重/體重和脾重/肝重的影響Fig. 1　Effects of compound probiotics on the liver weight/body weight, spleen weight/body weight and spleen weight/liver weight of mice

2.2生長(zhǎng)性能從圖2可以看出，飼喂復(fù)合益生菌制劑的小鼠體增重比對(duì)照組明顯增加?？紤]到試驗(yàn)結(jié)果，在后來(lái)的試驗(yàn)中選擇大麥飼料和清潔的復(fù)合益生菌。

圖2　復(fù)合益生菌制劑對(duì)小鼠體增重的影響Fig. 2　Effects of by adding compound probiotics on the weight gain of mice

使用最佳劑量(108CFU復(fù)合益生菌制劑)來(lái)研究小鼠的生長(zhǎng)性能。從圖3可以看出，飼喂復(fù)合益生菌劑的小鼠體增重較僅攝取水有較大提高。試驗(yàn)期內(nèi)，處理組飼喂復(fù)合益生菌制劑的小鼠體增重較對(duì)照組提高了28%。未經(jīng)處理小鼠的消耗指數(shù)達(dá)到2.64，而飼喂復(fù)合益生菌制劑處理組小鼠的消耗指數(shù)達(dá)到1.2。由此可見(jiàn)，飼喂復(fù)合益生菌制劑和水的小鼠體增重沒(méi)有顯著差異。飼喂復(fù)合益生菌制劑和水的小鼠的消耗指數(shù)也沒(méi)有顯著差異。

圖3　復(fù)合益生菌制劑對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響Fig. 3　Effects of compound probiotics preparations on growth performance of mice

2.3腸道酶活性由表1可知，B1-1菌株對(duì)小鼠腸道內(nèi)的纖維素酶活有一定的促進(jìn)效果，JC128菌株對(duì)蛋白酶活有一定的促進(jìn)效果。B1-1和JC128菌株混合飼喂，纖維素酶活和蛋白酶活的升高幅度最大，與對(duì)照組相比小鼠CMC酶、FPA酶和蛋白酶活性分別升高了48.70%、30.15%和30.23%。此外，B1-1菌株還具有蛋白酶活性，JC128菌株具有纖維素酶活性，且并非單純的加減作用。究其原因，可能是因?yàn)?種菌存在協(xié)同效應(yīng)，B1-1菌株豐富的代謝產(chǎn)物刺激JC128菌株生長(zhǎng)，JC128菌株生長(zhǎng)耗氧創(chuàng)造適宜B1-1菌株生長(zhǎng)的厭氧環(huán)境，從而2菌種均大量生長(zhǎng)，酶活較高。

表1　芽孢桿菌對(duì)小鼠腸道酶活性的影響±SD,n=10)

注：*表示與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)。

Note: * indicated significant differences compared with the control (P<0.05); and ** indicated extremely significant differences compared with the control (P<0.01).

3　結(jié)論

由蠟樣芽孢桿菌B1-1、蠟樣芽孢桿菌JC128和乳酸桿菌SL1-5制備的復(fù)合益生菌安全性較好，且對(duì)小鼠的生長(zhǎng)性能有促進(jìn)作用。該研究結(jié)果表明飼喂108CFU益生菌細(xì)胞可以顯著提高小鼠的體重。此外，復(fù)合益生菌制劑能夠顯著提高小鼠的消化能力、飼料利用率和腸道內(nèi)酶活力。

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Effects of Compound Probiotics on Growth Performance and Intestinal Protease Activity in Konmin Mice

YE Hong-ling1,LIU Dong1，YE Ming2et al

(1. Department of Garden and Horticulture, Anqing Vocational and Technical College, Anqing, Anhui 246003; 2. College of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology,Hefei,Anhui 230009)

[Objective] To research the effects of adding compound probiotics in feed on the growth performance and intestinal protease activity in post-weaning Konmin mice. [Method] Three probiotic strains (BacilluscereusB1-1,BacilluscereusJC10-8 andLactobacillusSL1-5) were prepared for compound probiotics. Konmin mice were fed by the compound probiotics so as to evaluate its safety. Effects of compound probiotics on the growth performance,protease activity and cellulase activity of post-weaning Konmin mice were researched. [Result] These strains were secure,and significantly increased the daily body weight gain of Konmin mice. After adding compound probiotics in mice feed in test group,the protease activity and cellulase activity were significantly higher than those in control group. [Conclusion] Compound probiotics greatly enhances the growth performances and intestinal enzyme activities in Konmin mice.

Compound probiotics; Growth performance; Protease; Cellulase

安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2014A148)；安徽省重大教學(xué)改革研究項(xiàng)目(2015zdjy181)。

葉紅玲(1981- )，女，安徽安慶人，工程師，碩士，從事農(nóng)業(yè)微生物研究。

2016-05-25

S 865.1

A

0517-6611(2016)19-173-03