王 君， 田 強， 游 朗， 李玉延， 宋力雅， 馬 林,2*

(1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621010;2.四川省生物質資源利用與改性工程技術研究中心，四川綿陽 621010)

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不同基礎培養(yǎng)基對漏斗形馬勃菌絲體生長的影響

王 君1， 田 強1， 游 朗1， 李玉延1， 宋力雅1， 馬 林1,2*

(1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621010;2.四川省生物質資源利用與改性工程技術研究中心，四川綿陽 621010)

[目的]研究漏斗形馬勃在7種不同基礎培養(yǎng)基上的生長情況。[方法]采用7種基礎培養(yǎng)基進行試驗，通過液體和固體培養(yǎng)，以菌絲體生物量及菌落直徑為指標，確定漏斗形馬勃的最佳基礎培養(yǎng)基。[結果]最適合漏斗形馬勃生長的基礎培養(yǎng)基配方為玉米渣4%、蛋白胨0.3%、蔗糖2%、KH2PO41%、MgSO40.05%。在28 ℃和搖床轉速150 r/min條件下，液體培養(yǎng)5 d后的菌絲體干重為16.56 g/L。在28 ℃固體培養(yǎng)7 d，菌絲體鮮重和干重分別為16.47和2.27 g/L，菌落直徑為4.49 cm。[結論]該研究為漏斗形馬勃培養(yǎng)條件的進一步優(yōu)化奠定了基礎。

漏斗形馬勃；固體培養(yǎng)；液體培養(yǎng)；培養(yǎng)基；菌絲體；生長

中藥馬勃資源豐富、來源廣泛，分屬于擔子菌門不同科屬，常見種類包括脫皮馬勃、大禿馬勃、梨形馬勃、頭狀馬勃、硬皮馬勃等。馬勃類真菌主要含有多糖、蛋白質、氨基酸、多肽、脂肪酸以及甾體、萜類、生物堿、酰胺類化合物等次生代謝成分，具有抑菌、抗炎、清除自由基、抗腫瘤、止咳、止血等多種藥理作用[1-3]。

漏斗形馬勃(Lycoperdonexcipuliforme)為傘菌綱傘菌目蘑菇科真菌，其子實體中型，成熟后頂部開口，呈漏斗狀。夏秋季生長在闊葉樹林中地上及路邊[4]。馬勃主要以子實體為入藥部位，但由于對生長環(huán)境有一定的要求，雖分布廣泛，其野生成熟子實體很少，單靠采集野生子實體難以滿足需求。利用液體發(fā)酵人工培養(yǎng)，可以在短期內獲得大量的馬勃菌絲體。有關馬勃類真菌的液體培養(yǎng)已有一些報道，涉及碳源和氮源篩選、無機鹽添加、培養(yǎng)條件優(yōu)化等，這些研究采用了不同的基礎培養(yǎng)基，所獲得的菌絲體生物量具有較大的差異[5-8]。但目前尚無漏斗形馬勃人工培養(yǎng)的研究，該研究采用7種基礎培養(yǎng)基進行試驗，以菌絲體生物量及菌落直徑為指標，確定漏斗形馬勃的最佳基礎培養(yǎng)基，為進一步優(yōu)化漏斗形馬勃的培養(yǎng)條件奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料漏斗形馬勃(Lycoperdonexcipuliforme)由西南科技大學生命科學與工程學院賀新生教授提供，4 ℃保存于PDA培養(yǎng)基上。葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母膏、硫酸鎂、磷酸二氫鉀均為分析純試劑，土豆、玉米渣、黃豆粉購自綿陽當?shù)厥袌觥?/p>

1.2方法

1.2.1菌種活化。將4 ℃保存的漏斗形馬勃菌種取出，在無菌環(huán)境下接種在培養(yǎng)皿固體PDA培養(yǎng)基上。置于培養(yǎng)箱在28 ℃培養(yǎng)5 d。

1.2.2培養(yǎng)基組成。共采用7種基礎培養(yǎng)基(編號為I～VII)進行試驗。I號為培養(yǎng)真菌常用的PDA培養(yǎng)基，II～VII號培養(yǎng)基參考相關文獻。各培養(yǎng)基具體組成為：I馬鈴薯20%、葡萄糖2%[9]；II馬鈴薯20%、蛋白胨2%、KH2PO40.15%、MgSO40.05%[5]；III蛋白胨1%、酵母膏0.2%、MgSO41.5%、KH2PO42.0%[6]；IV玉米渣4%、蛋白胨0.3%、蔗糖2%、KH2PO41%、MgSO40.05%[7]；V葡萄糖3%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.15%、MgSO40.05%、黃豆粉1.5%[8]；VI馬鈴薯20%、黃豆粉1%、蛋白胨0.5%、蔗糖2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%[10]；VII葡萄糖1%、MgSO41.5%、KH2PO42.0%[6]。

1.2.3培養(yǎng)基配制。

1.2.3.1液體培養(yǎng)基配制。按照“1.2.2”培養(yǎng)基組成比例配制，pH均為自然。分裝后在121 ℃滅菌20 min。

1.2.3.2固體培養(yǎng)基配制。按照“1.2.2”培養(yǎng)基組成比例配制，并在每個培養(yǎng)基中按18 g/L加入瓊脂，121 ℃滅菌20 min后按20 mL裝量倒入90 mm培養(yǎng)皿固化。

1.2.4液體培養(yǎng)。在250 mL錐形瓶中裝量液體培養(yǎng)基100 mL，在無菌條件下，用直徑6 mm的打孔器取活化菌種的菌餅2塊，放入錐形瓶中，使其分散。置于恒溫搖床中振蕩，轉速為150 r/min，培養(yǎng)溫度為28 ℃，培養(yǎng)時間為5 d。每一培養(yǎng)基處理設5次重復。重復3次試驗。

1.2.5固體培養(yǎng)。培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基凝固后放置30 min，在無菌條件下，用直徑6 mm的打孔器取活化菌種的菌餅1塊，接種在培養(yǎng)皿中央。恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)7 d。每一培養(yǎng)基處理設5次重復。重復3次試驗。

1.2.6菌絲體生物量及固體培養(yǎng)菌落直徑測定。液體培養(yǎng)5 d后，將培養(yǎng)液用真空泵抽濾，收集菌絲體，用蒸餾水充分洗滌，置于培養(yǎng)皿烘干至恒重。固體培養(yǎng)7 d后，用游標卡尺在十字交叉的2個方向進行測量，以二者的平均值作為菌落直徑，菌絲體除去粘附在上面的瓊脂并用蒸餾水充分洗滌，用濾紙吸干水分，稱量鮮重。烘干至恒重測菌絲體干重。

1.3數(shù)據統(tǒng)計分析以每次試驗每個處理的5個重復計算平均值，將3次試驗的結果進行方差分析，不同處理間差異顯著性用LSR法進行多重比較。

2　結果與分析

2.1不同基礎培養(yǎng)基液體培養(yǎng)對菌絲體生物量的影響由表1可見，在培養(yǎng)條件(pH、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和轉速)相同的情況下，采用不同基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)所獲的菌絲體干重有較大差異。IV號培養(yǎng)基的菌絲體干重最大，為16.56 g/L，其次是V號培養(yǎng)基，菌絲體干重為10.25 g/L，其余培養(yǎng)基(I、II、III和VI)均在8 g/L以下，III號培養(yǎng)基的菌絲體干重最低，僅為2.17 g/L，而VII號培養(yǎng)基在接種后沒有觀察到菌絲體生長。對I～VI號6個處理試驗結果進行方差分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)值為28.21，大于F0.01=5.06，表明各處理間的差異達到極顯著。多重比較結果表明，IV號培養(yǎng)基的菌絲體干重極顯著高于其他5種培養(yǎng)基，V號與VI號培養(yǎng)基之間未達顯著差異，但顯著高于另外3種培養(yǎng)基。

表1不同基礎培養(yǎng)基液體培養(yǎng)的漏斗形馬勃菌絲體干重

Table 1Dry weight ofL.excipuliformemycelia in various basic media in liquid culture

培養(yǎng)基編號Numberofeachmedium菌絲體干重Dryweightofthemycelia∥g/L差異顯著性SignificanceofdifferenceP<0.05P<0.01I5.41±0.65cCII6.76±0.66cBIII2.17±1.01dCIV16.56±0.60aAV10.25±2.03bBVI7.52±3.01bBVII—

注：圖中不同大寫字母表示培養(yǎng)基之間的差異達極顯著水平(P<0.01)，不同小寫字母表示培養(yǎng)基之間的差異達顯著水平(P<0.05)。Note：Different capital letters and lowercase letters mean the differences between various media were extremely significant P<0.01) and significant (P<0.05) respectively.圖1　不同基礎培養(yǎng)基固體培養(yǎng)的漏斗形馬勃菌絲體生物量Fig.1　Mycelium biomass of L. excipuliforme in various basic media in solid culture

2.2不同基礎培養(yǎng)基固體培養(yǎng)對菌絲體生物量的影響從圖1可看出，在培養(yǎng)條件相同情況下，不同基礎培養(yǎng)基上所獲得的菌絲體鮮重及干重均有一定差異。從菌絲體鮮重看，IV號培養(yǎng)基最大，為16.47 g/L，其次是VI號培養(yǎng)基(14.83 g/L)，IV號和VI號之間無顯著差異，但均極顯著高于另4個培養(yǎng)基(I～III和V號)；鮮重最少的是I號培養(yǎng)基(7.20 g/L)。與液體培養(yǎng)時相似，漏斗形馬勃菌種接種與VII號固體培養(yǎng)基也未見生長。干重測定結果表明，IV號培養(yǎng)基達最大，為2.27 g/L，極顯著高于其他5個基礎培養(yǎng)基的菌絲體干重，III號培養(yǎng)基的菌絲體干重為1.77 g/L，極顯著高于I、II、V和VI號培養(yǎng)基，I號培養(yǎng)基的菌絲體干重僅為0.38 g/L。2.3不同基礎培養(yǎng)基固體培養(yǎng)的菌落直徑由表2可見，在培養(yǎng)溫度和時間相同的情況下，不同基礎培養(yǎng)基對漏斗形馬勃的生長有較大影響。菌落直徑最大的是IV號培養(yǎng)基，為4.49 cm，極顯著高于其他基礎培養(yǎng)基。VI號也有較大的菌落直徑(3.25 cm)，II、III和V號培養(yǎng)基的菌落直徑之間無顯著差異，菌落直徑最小的是I號基礎培養(yǎng)基(1.89 cm)。VII號培養(yǎng)基未觀察到菌絲體出現(xiàn)。

表2　漏斗形馬勃固體培養(yǎng)的菌落直徑

3　結論與討論

該研究表明，無論是液體培養(yǎng)還是固體培養(yǎng)，IV號培養(yǎng)基在菌絲體生物量上均達到最大值，液體培養(yǎng)的菌絲體干重為16.56 g/L，固體培養(yǎng)的菌絲體鮮重和干重分別為16.47和2.27 g/L。IV號培養(yǎng)基的氮源為蛋白胨(0.3%)，碳源為蔗糖(2%)，所添加的玉米渣(4%)含有蛋白質、淀粉、氨基酸等多種營養(yǎng)成分[11]，能夠滿足菌種生長的碳氮需求，配方中的KH2PO4(1%)和MgSO4(0.05%)也有利于菌種的生長。同樣采用IV號培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，王濤等[7]培養(yǎng)大禿馬勃的研究表明，不同碳源條件下的菌絲體干重為4.01～9.37 g/L，不同氮源條件下的菌絲體干重為4.93～9.04 g/L，菌絲體生物量總體低于該研究的結果，這可能與菌種、培養(yǎng)條件(溫度、轉速、培養(yǎng)時間等)及培養(yǎng)基主要成分的來源(如玉米渣品質)不同有關。采用V號培養(yǎng)基作基礎培養(yǎng)基也能獲得較好的效果(液體培養(yǎng)菌絲體干重為10.25 g/L)，但楊小方等[8]用該基礎培養(yǎng)基進行脫皮馬勃液體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)條件下所測得的菌絲體干重差異較大(5.3～28.0 g/L)，說明在基礎培養(yǎng)基上改變碳源和氮源、添加無機鹽的種類及比例、優(yōu)化組合不同條件等對結果均有很大影響。以III號培養(yǎng)基作基礎培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)僅獲得2.17 g/L的菌絲體干重，可能與配方中碳源比例不足有關。VII號培養(yǎng)基接種后未見生長，可能與缺乏氮源有關。

從固體培養(yǎng)的菌落直徑同樣可以看出，IV號培養(yǎng)基相比其他培養(yǎng)基生長更為快速，這與生物量測定所反映出的結果一致，但III號和VI號培養(yǎng)基的菌落直徑大小與其鮮重、干重并不成正比，可能與培養(yǎng)基不同導致菌絲體積累的干物質量不同有較大關系?？壮萚10]對馬勃464菌株進行固體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中采用不同碳源或不同氮源時，對菌絲體日均生長量具有較大影響。

在基礎培養(yǎng)基上，通過單因素試驗或正交試驗進行培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件優(yōu)化，可以大幅度提高菌絲體生物量[7-8]，因此，該研究篩選獲得的IV號培養(yǎng)基可以作為漏斗形馬勃的基礎培養(yǎng)基，有利于進一步開展最適碳氮源及最佳碳氮比篩選、無機鹽添加以及培養(yǎng)條件優(yōu)化等研究。

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Effects of Different Basic Media on the Mycelium Growth ofLycoperdonexcipuliforme

WANG Jun1，TIAN Qiang1，YOU Lang1，MA Lin1,2*et al

(1. School of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang，Sichuan 621010; 2. Engineering Research Center for Biomass Resource Utilization and Modification of Sichuan Province，Mianyang，Sichuan 621010)

[Objective] To study the mycelium growth ofLycoperdonexcipuliformein seven basic media. [Method] According to medium biomass and colony diameter as growth parameters，the optimal basic medium for the mycelium growth ofL.excipuliformewas selected from seven liquid and solid media with different constituents. [Result] The optimal basic medium for the mycelium growth ofL.excipuliformewas the IV medium composed of maize (4%)，peptone (0.3%)，sucrose (2%)，KH2PO4(1%) and MgSO4(0.05%). After the mycelia were cultured in the liquid medium at the rotational speed of 150 r/min at 28 ℃ for 5 d，their dry weight in the IV medium was 16.56 g/L. When the mycelia were cultured in solid medium at 28 ℃ for 7 d，their fresh weight and dry weight in the IV medium were 16.47 and 2.27 g/L respectively，and the colony diameter was 4.49 cm. [Conclusion] The study lays the foundation for the further optimization of culture conditions ofL.excipuliforme.

Lycoperdonexcipuliforme; Solid culture; Liquid culture; Culture medium; Mycelium; Growth

國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(201410619002)；西南科技大學大學生創(chuàng)新基金(CX15-040)；西南科技大學生命科學與工程學院大學生創(chuàng)新實踐項目(2014011)。

王君(1994- )，女，四川成都人，本科生，專業(yè)：制藥工程。*通訊作者，教授，博士，碩士生導師，從事天然產物研究。

2016-06-08

S 567.3

A

0517-6611(2016)19-114-03