史海躍，陳慧，王華，江偉杰，胡巨偉

(寧波市婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，寧波　315012)

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·臨床實(shí)踐·

睪丸精子冷凍復(fù)蘇對(duì)ICSI助孕結(jié)局的影響

史海躍*，陳慧，王華，江偉杰，胡巨偉

(寧波市婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，寧波315012)

目的探討睪丸精子冷凍復(fù)蘇對(duì)ICSI助孕結(jié)局的影響。方法回顧性分析2010年1月至2014年9月因梗阻性無(wú)精子癥在本院采用睪丸精子行ICSI助孕的214個(gè)周期的臨床資料，其中107個(gè)周期采用冷凍復(fù)蘇的睪丸精子(凍精復(fù)蘇組)，另外107個(gè)周期采用新鮮睪丸精子(新鮮精子組)。比較兩組中女方的一般資料、受精率、卵裂率、可利用胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率，以及臨床妊娠率。結(jié)果本研究中，107個(gè)周期凍存睪丸精子復(fù)蘇均獲成功；凍精復(fù)蘇組與新鮮精子組行ICSI助孕后的受精率[(76.91±18.24)% vs. (75.35±20.62)%]、卵裂率[(94.69±5.29)% vs. (95.37±4.48)%]、可利用胚胎數(shù)[(4.67±2.52) vs. (4.20±2.75)個(gè)]、優(yōu)質(zhì)胚胎率[(64.47±26.08)% vs. (60.34±27.39)%]及臨床妊娠率(52.24% vs. 50.63%)比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論睪丸精子冷凍復(fù)蘇對(duì)ICSI助孕結(jié)局并無(wú)顯著影響。

睪丸精子；冷凍復(fù)蘇；卵胞漿內(nèi)單精子注射；妊娠結(jié)局

梗阻性無(wú)精子癥是由于輸精管道的梗阻使精子的運(yùn)輸發(fā)生障礙而產(chǎn)生的無(wú)精子癥，在男性不育中的發(fā)生率約為1%。既往，這部分男性的生育需求基本不可能實(shí)現(xiàn)。直到1993年，Craft 等[1]帶來(lái)了福音，首次利用睪丸精子行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)助孕獲得了成功。3年后Hovatta等[2]和Gil-Salom[3]等更是將無(wú)精子癥的助孕治療向前推動(dòng)了一大步，分別報(bào)道了用凍融睪丸精子行ICSI助孕獲得成功妊娠。但是，睪丸精子經(jīng)冷凍復(fù)蘇處理后是否會(huì)影響ICSI的助孕結(jié)局尚存在爭(zhēng)議?，F(xiàn)將本中心近幾年睪丸精子冷凍復(fù)蘇后行ICSI的助孕結(jié)局總結(jié)分析如下。

一、資料與方法

1. 研究對(duì)象及分組：選取2010年1月至2014年9月在我院生殖中心因男方梗阻性無(wú)精子癥行ICSI助孕者，共214個(gè)周期，其中采用冷凍復(fù)蘇睪丸精子行ICSI助孕107個(gè)周期(凍精復(fù)蘇組)，采用新鮮睪丸精子行ICSI助孕107個(gè)周期(新鮮精子組)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：第1周期行ICSI治療、長(zhǎng)方案超排卵、夫婦雙方染色體核型分析均正常者。排除標(biāo)準(zhǔn)：女方子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、子宮畸形、卵巢功能衰竭等。

梗阻性無(wú)精子癥確診依據(jù)：至少3次射出精液離心沉淀后未見(jiàn)精子，診斷性睪丸活檢可見(jiàn)成熟精子。

2. 睪丸穿刺取精：常規(guī)消毒鋪巾，利多卡因局部麻醉，用帶側(cè)孔的睪丸穿刺針經(jīng)皮睪丸穿刺，稍拔出針芯，擠壓睪丸，再插入針芯，然后連穿刺針一起拔出，從穿刺針側(cè)孔挑出睪丸組織，置于含10%人血清白蛋白(SSS，Irvine，美國(guó))的人輸卵管培養(yǎng)液(HTF，Irvine，美國(guó))中，用2只1 ml注射器針頭劃破曲細(xì)精管，倒置顯微鏡下觀察，吹打混勻后直接離心處理。

3. 精子冷凍：精子冷凍保護(hù)劑(Quinn’s，美國(guó))置室溫平衡30 min；將經(jīng)處理后含有精子的懸液與精子冷凍保護(hù)劑以1∶1比例混勻，移入精子保存管進(jìn)行分裝，室溫平衡10 min；懸吊于液氮罐內(nèi)距液氮面5 cm，10 min后將精子保存管放入液氮長(zhǎng)期保存。

4. 精子復(fù)蘇：從液氮中取出保存精液的冷凍管，在室溫中放置30 min；加入等量含10% SSS的HTF培養(yǎng)液，混勻后進(jìn)行洗滌離心；最后在沉淀物中加入含10% SSS的HTF培養(yǎng)液混勻待用。

5. 卵母細(xì)胞獲取、ICSI及胚胎移植：超促排卵均采用黃體中期啟動(dòng)的長(zhǎng)方案，當(dāng)直徑≥20 mm的卵泡≥2個(gè)時(shí)，注射HCG 10 000 U，36 h后行陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵術(shù)。取卵后4～6 h 選取成熟卵母細(xì)胞(MII期)行ICSI操作。取卵后第3天選擇最優(yōu)的1～3枚胚胎移植。

6. 判斷指標(biāo)：正常受精：ICSI后16～17 h觀察受精情況，以雙原核為正常受精；卵裂率：ICSI后40～41 h觀察卵裂情況，并計(jì)算卵裂球比例；優(yōu)質(zhì)胚胎：以卵裂球大小均勻，細(xì)胞飽滿，碎片<5%的I級(jí)胚胎和碎片≤20%的Ⅱ級(jí)胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎；可利用胚胎：所有移植及冷凍的胚胎；臨床妊娠：移植后14 d查血β-HCG，確定是否生化妊娠，若為陽(yáng)性，2周后B超檢查提示宮腔內(nèi)或?qū)m外見(jiàn)孕囊及胎心搏動(dòng)者為臨床妊娠。

二、結(jié)果

1. 凍存睪丸精子的復(fù)蘇結(jié)果：107個(gè)周期凍存睪丸精子復(fù)蘇均獲成功，所有周期均找到了足夠數(shù)量的活動(dòng)精子完成ICSI。其中96個(gè)周期在行ICSI過(guò)程中較為容易地找到了足夠數(shù)量的活動(dòng)精子，找精時(shí)間為1～3 min/條；另11個(gè)周期因活動(dòng)精子形態(tài)差或精子活力差(尾巴偶爾微微擺動(dòng))或活動(dòng)精子數(shù)量少(顯微鏡下多個(gè)高倍視野見(jiàn)1～2條尾巴活動(dòng)精子)而導(dǎo)致在行ICSI過(guò)程中找精困難，找精時(shí)間>3 min/條。

2. 兩組女方一般情況比較：凍精復(fù)蘇組與新鮮精子組比較，兩組女方年齡、不育年限、促排卵天數(shù)(Gn天數(shù))、促排卵藥物劑量(Gn總量)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

3. 兩組胚胎發(fā)育情況及妊娠結(jié)局比較：凍精復(fù)蘇組107個(gè)周期，其中取卵周期行胚胎移植67個(gè)周期，其余40個(gè)周期行全胚冷凍；新鮮精子組107個(gè)周期，取卵周期行胚胎移植79個(gè)周期，其余28個(gè)周期行全胚冷凍。兩組的受精率、卵裂率、可利用胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表1　兩組女方一般情況比較 (x-±s)

表2　兩組的胚胎發(fā)育情況及妊娠結(jié)局比較 [(x-±s)，%]

三、討論

梗阻性無(wú)精子癥給男性患者的身心均帶來(lái)了極大的痛苦。近年來(lái)，這類患者能夠通過(guò)睪丸或附睪穿刺抽吸術(shù)獲得極少量睪丸或附睪精子，然后通過(guò)ICSI方式進(jìn)行助孕。但是這些精子數(shù)量有限且來(lái)之不易，前一次手術(shù)取精成功，下一次手術(shù)取精也存在失敗的風(fēng)險(xiǎn)[4]。如果將這些患者試驗(yàn)性睪丸穿刺或受精當(dāng)天剩余精子冷凍保存，可以有效避免下個(gè)周期因?yàn)榫尤狈o(wú)法進(jìn)行人工授精造成的卵母細(xì)胞浪費(fèi)，為取卵當(dāng)日成功受精提供了一定的保障，同時(shí)還能減少反復(fù)穿刺取精給患者帶來(lái)的身體及精神上的壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

精子凍存的歷史最早可追溯至1776年，當(dāng)時(shí)就曾有專家嘗試將精子冷藏于雪中[5]。由于高流動(dòng)性的細(xì)胞膜以及低含水量(大約50%)等自身特點(diǎn)，精子似乎對(duì)發(fā)生冷凍損傷不敏感。但是，由于凍存期間的冷休克、滲透壓改變、細(xì)胞內(nèi)冰晶形成及氧化應(yīng)激等原因[6-11]，冷凍保存會(huì)對(duì)精子的質(zhì)膜、頂體、DNA完整性及其動(dòng)力、活力等產(chǎn)生影響[12-18]，這可能導(dǎo)致其冷凍復(fù)蘇后喪失了自身部分功能甚至是受孕能力。因此，有學(xué)者對(duì)使用凍存精子行ICSI助孕存在兩點(diǎn)疑慮：一是精子冷凍復(fù)蘇后活動(dòng)率及存活率如何？二是復(fù)蘇精子行ICSI助孕后結(jié)局如何？本中心對(duì)試驗(yàn)性睪丸穿刺后發(fā)現(xiàn)活動(dòng)精子的患者行常規(guī)睪丸精子冷凍。經(jīng)驗(yàn)顯示只要冷凍方案及技術(shù)成熟可靠，復(fù)蘇后基本能獲得足夠量的可利用精子。本研究復(fù)蘇凍存的睪丸精子107個(gè)周期均獲成功，所有周期均找到了足夠數(shù)量的活動(dòng)精子完成ICSI操作。Levron等[19]也認(rèn)為只要取出的睪丸組織中精子數(shù)量足夠，精子冷凍就可行。

同時(shí)，本研究中凍精復(fù)蘇組與新鮮精子組的女方年齡、不育年限、促排卵天數(shù)(Gn天數(shù))、促排卵藥物劑量(Gn總量)比較均無(wú)顯著性差異，行ICSI助孕后受精率、卵裂率、可利用胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率，以及臨床妊娠率比較亦無(wú)顯著性差異(P均>0.05)。提示睪丸精子冷凍對(duì)ICSI助孕結(jié)局并無(wú)顯著影響，與之前的文獻(xiàn)[19-22]觀點(diǎn)一致。

綜上所述，本研究結(jié)果提示睪丸精子冷凍復(fù)蘇對(duì)ICSI助孕結(jié)局并無(wú)顯著影響，睪丸精子冷凍保存對(duì)于梗阻性無(wú)精子癥男性生育能力的保存具有積極意義。

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[編輯：郭永]

2015-12-26；

2016-03-01

史海躍，男，浙江寧海人，碩士，主治醫(yī)師，泌尿外科及男科專業(yè).(*

)

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.08.012