陳國勇，劉蕓，張群芳，黃吳鍵，林春麗

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院婦產(chǎn)科，福州　350025)

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零原核胚胎利用價值的探討

陳國勇，劉蕓*，張群芳，黃吳鍵，林春麗

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院婦產(chǎn)科，福州350025)

目的比較未見原核(0PN)與正常原核(2PN)來源優(yōu)質(zhì)囊胚的妊娠結(jié)局，探討0PN胚胎的利用價值。方法收集2013年1月至2014年12月在本中心行助孕治療、鮮胚移植失敗或取消移植后行凍融優(yōu)質(zhì)囊胚移植的784例患者為研究對象，以移植0PN來源凍融優(yōu)質(zhì)囊胚的患者為0PN組，移植2PN來源凍融優(yōu)質(zhì)囊胚的患者為2PN組，分析0PN、2PN卵裂胚的優(yōu)質(zhì)囊胚形成率，并比較兩組患者的胚胎種植率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率等。結(jié)果0PN卵裂胚的總優(yōu)質(zhì)囊胚形成率顯著低于2PN卵裂胚(37.17% vs. 44.49%)，但第3天卵裂球8細(xì)胞以上胚胎優(yōu)質(zhì)囊胚形成率0PN胚胎顯著高于2PN胚胎(67.45% vs. 57.16%)(P均<0.01)。囊胚移植后0PN組的種植率(71.15% vs. 53.74%)、臨床妊娠率(80.00% vs. 64.32%)、抱嬰率(68.00% vs. 55.71%)顯著高于2PN組(P均<0.05)；兩組出生嬰兒體重、身長、Apgar評分、畸形率等比較無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論0PN來源優(yōu)質(zhì)囊胚的利用價值值得關(guān)注。0PN胚胎可能只是在設(shè)定的觀察時間內(nèi)未觀察到原核，而并不一定是異常受精。對于無可利用優(yōu)質(zhì)胚胎的患者，臨床上可以將0PN胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚，然后進(jìn)行移植，以提高患者的胚胎利用率和臨床妊娠率。但因?yàn)?PN胚胎存在染色體異常的可能性仍較大，建議能結(jié)合遺傳學(xué)篩查技術(shù)，以獲得更確切的信息，指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

原核；細(xì)胞數(shù)；優(yōu)質(zhì)囊胚形成率；種植率；臨床妊娠率

【Abstract】

Objective： To compare the pregnancy outcome of high-quality blastocyst from two pronucleus (2PN) or zero pronucleus (0PN) embryos，and further analyze the value of zero pronucleus embryos.

Methods： A total of 784 patients with frozen-thawed transfer with high-quality blastocyst after fresh embryo transfer failure or cancel of transfer cycle in our center from Jan. 2013 to Dec. 2014 were enrolled for the study. The patients were divided into two groups according to the high-quality blastocyst derived from 0PN or 2PN embryos： the 0PN-derived group and the 2PN-derived group. The high-quality blastocyst rate，implantation rate，clinical pregnancy rate and miscarriage rate were compared between the two groups.

Results： In general，the high-quality blastocyst rate from 0PN-derived embryo was significantly lower than that from 2PN-derived embryo (37.17% vs. 44.49%，P<0.01)，but the rate of high-quality blastocyst with more than 8 cells derived from 0PN embryo on Day 3 was significantly higher than that from 2 PN embryo (67.45% vs.57.16%，P<0.01). The implantation rate (71.15% vs.53.74%)，clinical pregnancy rate (80.00% vs. 64.32%) and live birth rate (68.00% vs. 55.71%) in 0PN-derived embryo group were significantly higher than those in the 2PN-derived embryo group(allP<0.05). The birth weight，Apgar score，and malformation rate were not significantly different between the two groups (P>0.05).

Conclusions： It is worthy to utilize high-quality blastocyst derived from 0PN embryos. For patients without high quality embryos to use，their 0PN embryos can be cultured to blastocyst and then transplant，in order to improve the embryos utilization rate and clinical pregnancy rate.

(JReprodMed2016，25(8)：696-700)

輔助生殖助孕治療中，胚胎培養(yǎng)在原核觀察期就已經(jīng)表現(xiàn)出多樣性，多原核胚胎一般作為廢棄胚胎被銷毀，正常受精的2原核(2PN)胚胎則繼續(xù)培養(yǎng)，但未觀察到原核(0PN)、僅觀察到1原核(1PN)胚胎的利用情況仍然存在爭議[1]?，F(xiàn)就本中心0PN胚胎的利用情況進(jìn)行探討，以期為臨床應(yīng)用提供一定參考。

資料與方法

一、研究對象及分組

收集2013年1月至2014年12月在本中心行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕治療、有囊胚培養(yǎng)的1 583例患者(共7 765個胚胎)的臨床資料。選擇其中鮮胚移植失敗或取消移植，而后行解凍后優(yōu)質(zhì)囊胚移植的784例患者為研究對象。

分組情況：無2PN來源優(yōu)質(zhì)囊胚，行0PN來源優(yōu)質(zhì)囊胚解凍后移植的患者為0PN組；行2PN來源優(yōu)質(zhì)囊胚解凍后移植的患者為2PN組。本研究中0PN胚胎指授精后16～18 h觀察到明確2極體(2PB)、0PN但第3天(D3)有卵裂的胚胎。

二、研究方法

1. 控制性超促排卵：所有患者均采用改良長方案促排卵：于月經(jīng)D3開始使用達(dá)菲林(醋酸曲普瑞林，Triptorelin，3.75 mg/支，博福益普生，法國)約1.31 mg進(jìn)行垂體降調(diào)節(jié)，根據(jù)患者體重和卵巢情況，使用重組人卵泡刺激素(果納芬，Gonal-F，75 U/支，默克雪蘭諾，瑞士)和人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG，50 U/支，珠海麗珠)進(jìn)行促排和啟動，劑量150～225 U，根據(jù)卵泡發(fā)育情況調(diào)整用藥劑量。B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，觀察血清雌二醇(E2)、促黃體生成素(LH)、孕酮(P)水平，當(dāng)3個以上主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)18 mm時肌肉注射重組人絨毛膜促性腺激素(rHCG，默克雪蘭諾，德國)250 U和注射用HCG(珠海麗珠)2 000 U，36～38 h后陰道B超引導(dǎo)下行卵泡穿刺取卵。

2. IVF與胚胎處理：取卵后，在體視顯微鏡下分揀出卵冠丘復(fù)合物，置于覆蓋礦物油授精液(Vitrolife，瑞典)的四孔板上，置37℃、6%CO2、5% O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h，進(jìn)行短時授精。授精后4～6 h去除卵丘顆粒細(xì)胞，觀察第二極體產(chǎn)生情況判斷是否受精。受精情況達(dá)標(biāo)者換G1培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)進(jìn)行單胚胎培養(yǎng)，培養(yǎng)至次晨(授精后16～18 h)觀察原核、極體發(fā)生情況，以2PN(2PB)為正常受精。D3觀察胚胎后，挑選1～2個2PN來源的優(yōu)質(zhì)卵裂胚進(jìn)行移植或冷凍。其余卵裂胚除多原核胚胎遺棄外，均進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，換G2培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)繼續(xù)培養(yǎng)36～48 h，觀察囊胚生長情況，選擇質(zhì)量較好的囊胚進(jìn)行冷凍。G1、G2培養(yǎng)均為25 μl/滴，覆蓋礦物油，單獨(dú)培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境均為37℃、6%CO2、5% O2的培養(yǎng)箱。所有胚胎操作均統(tǒng)一由2名有經(jīng)驗(yàn)的胚胎操作者完成。

胚胎觀察時間：以2010年伊斯坦布爾胚胎共識評估時間點(diǎn)[2]評估胚胎：授精后(17±1)h觀察原核(D1)、(68±1)h觀察卵裂胚(D3)、[(116/140/164)±2]h觀察囊胚生長情況。

胚胎評估方法：以改良的形態(tài)學(xué)評估方法為標(biāo)準(zhǔn)：(1)卵裂胚評估參考Racowsky、Veeck等的卵裂胚評估辦法[3-4]，結(jié)合本中心實(shí)際操作進(jìn)行評估。I級：卵裂球大小均勻且碎片<10%；Ⅱ級：卵裂球大小輕度不均且碎片<20%，或卵裂球大小均勻且碎片10%～20%；Ⅲ級：卵裂球大小嚴(yán)重不均且碎片<50%，或卵裂球無大小嚴(yán)重不均、碎片20%～50%；Ⅳ級：碎片≥50%。(2)優(yōu)質(zhì)囊胚評估標(biāo)準(zhǔn)：按Gardner分級標(biāo)準(zhǔn)[5]對囊胚評分，根據(jù)囊胚的擴(kuò)張和孵出程度進(jìn)行分期，根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)和滋養(yǎng)層細(xì)胞(TE)評分進(jìn)行分級，本中心以4BB以上級別囊胚為優(yōu)質(zhì)囊胚。

囊胚的凍融及移植：囊胚冷凍均采用玻璃化冷凍法，使用實(shí)驗(yàn)室自制的玻璃化冷凍試劑。鮮胚移植失敗后，擇期行凍融囊胚移植。解凍囊胚，解凍后2 h進(jìn)行質(zhì)量評估：囊腔復(fù)膨充分，未見明顯的ICM、TE退化者視為復(fù)蘇成功。復(fù)蘇成功的囊胚換移植液直接進(jìn)行移植，移植管采用美國COOK移植管，移植液為G2與人血清白蛋白的混合液。

3. 觀察指標(biāo)：觀察兩組的種植率、妊娠率、流產(chǎn)率及抱嬰率；種植率=孕囊數(shù)/移植胚數(shù)；臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/移植患者例數(shù)；流產(chǎn)率=流產(chǎn)例數(shù)/妊娠例數(shù)；抱嬰率=獲得活產(chǎn)的患者例數(shù)/移植患者例數(shù)。

4. 簽署知情同意書：與無2PN來源優(yōu)質(zhì)囊胚的患者溝通，告知其具體情況及移植0PN來源囊胚可能存在的風(fēng)險，患者自愿接受0PN來源的優(yōu)質(zhì)囊胚解凍移植，簽署知情同意書，并建議患者成功妊娠后進(jìn)行必要的產(chǎn)前診斷與檢查。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

一、0PN來源和2PN來源優(yōu)質(zhì)囊胚形成情況比較

本研究共收集了869個0PN胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，共形成優(yōu)質(zhì)囊胚323個，優(yōu)質(zhì)囊胚形成率為37.17%；同時期收集2PN胚胎共6 896個，繼續(xù)囊胚培養(yǎng)后形成優(yōu)質(zhì)囊胚3 068個，優(yōu)質(zhì)囊胚形成率為44.45%。0PN來源優(yōu)質(zhì)囊胚形成率顯著低于2PN來源優(yōu)質(zhì)囊胚形成率(P<0.01)(表1)。

其中D3發(fā)育達(dá)8細(xì)胞以上的0PN胚胎298個，形成優(yōu)質(zhì)囊胚201個，優(yōu)質(zhì)囊胚形成率67.45%；D3發(fā)育達(dá)8細(xì)胞以上的2PN胚胎1 445個，形成優(yōu)質(zhì)囊胚826個，優(yōu)質(zhì)囊胚形成率57.16%。0PN組顯著高于2PN組(P<0.01)(表1)。

二、兩組患者一般情況比較

0PN和2PN兩組患者的平均年齡、移植日子宮內(nèi)膜、移植囊胚數(shù)等一般情況比較，均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

三、兩組患者的妊娠情況比較

有75例患者移植了解凍的0PN來源優(yōu)質(zhì)囊胚，共104個囊胚，最后60例患者獲得臨床妊娠，見孕囊74個，流產(chǎn)9例。2PN組709例患者移植解凍后的2PN來源優(yōu)質(zhì)囊胚，共1 044個囊胚，最后456例患者獲得臨床妊娠，見孕囊561個，流產(chǎn)61例。0PN組的種植率、臨床妊娠率、抱嬰率均顯著高于2PN組(P<0.05)(表3)。

表1　0PN來源和2PN來源優(yōu)質(zhì)囊胚形成情況比較(%)

注：與2PN卵裂胚比較，*P<0.01

表2　兩組患者一般情況比較(x-±s)

表3　兩組患者的妊娠情況比較(%)

注：與2PN組比較，*P<0.05，**P<0.01

四、兩組患者出生嬰兒隨訪情況比較

兩組出生嬰兒的出生孕周、體重、身長、Apgar評分、畸形率等比較，均無顯著性差異(P>0.05)(表4)。2PN組出生嬰兒中有7例合并先天性畸形：2例先心病，1例先心病合并左側(cè)斷掌，1例蠶豆病，1例輕度唇腭裂，1例先天性膈疝，1例雙足內(nèi)翻畸形；0PN組出生嬰兒中有1例先天畸形嬰兒，為左耳輕度畸形合并單腎畸形。

表4　兩組患者出生嬰兒情況比較 [(x-±s)，%]

討　　論

胚胎的評估選擇一直是輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域熱門的話題之一[2，6]，目前胚胎評價仍無嚴(yán)格統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，學(xué)者們在這個領(lǐng)域進(jìn)行了大量的相關(guān)研究，目前最常用的方法有形態(tài)學(xué)評估[3，6-7]，其他還有通過胚胎代謝產(chǎn)物檢測[8-9]、胚胎細(xì)胞活檢染色體檢查[10]、免疫或激素類物質(zhì)測定[11-12]，以及紅外光輔助分析優(yōu)選胚胎[13]、實(shí)時成像技術(shù)(time lapes)[14-15]等方法來評估胚胎質(zhì)量。胚胎形態(tài)學(xué)評價作為輔助生殖領(lǐng)域臨床常規(guī)的評估方法，在IVF-ET等助孕治療中得到了廣泛應(yīng)用，通常根據(jù)早期卵裂、D2或D3卵裂情況來綜合評價胚胎質(zhì)量，以選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，以期提高臨床妊娠率。

受精是精子進(jìn)入卵母細(xì)胞并與之融合的過程，精子的進(jìn)入誘導(dǎo)第二極體排出，精子來源的染色體解聚，形成雄原核，卵母細(xì)胞形成雌原核。在精子和卵母細(xì)胞共培養(yǎng)16～18 h間觀察(主要集中在約18 h)，可見雌原核和雄原核的視為正常受精。臨床實(shí)踐中有部分病例在精卵共培養(yǎng)16～18 h后進(jìn)行觀察時，未能見到原核但能觀察到2PB，繼續(xù)培養(yǎng)至D2、D3時仍可觀察到卵裂，即0PN胚胎，甚至再繼續(xù)培養(yǎng)后，這部分0PN胚胎可以繼續(xù)發(fā)育為囊胚[16-17]。分析其原因，有可能0PN來源胚胎其原核形成時間出現(xiàn)了提前或推遲，即原核出現(xiàn)時間并不在16～18 h范圍內(nèi)，因此在設(shè)定的觀察時間里未能觀察到原核，但繼續(xù)培養(yǎng)再觀察時可以觀察到卵裂。已有研究報道，這類0PN來源的囊胚移植后，也可正常發(fā)育甚至分娩正常新生兒[18-19]。

本研究結(jié)果顯示，在同一時期臨床及實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)條件均穩(wěn)定的情況下，0PN胚胎占受精胚胎總數(shù)(含0PN)的比例約為3%～5%，0PN胚胎繼續(xù)培養(yǎng)后可以發(fā)育至囊胚，雖然優(yōu)質(zhì)囊胚的形成率要低于正常受精的2PN胚胎，但仍大大提高了卵母細(xì)胞的整體利用率。

關(guān)于0PN胚胎的發(fā)育潛能，Wang等[20]、曾勇等[21]曾研究報道0PN胚胎不如正常受精胚胎。本研究結(jié)果顯示，0PN來源的優(yōu)質(zhì)囊胚形成率顯著低于2PN來源者(37.17% vs. 44.45%，P<0.05)，與前述研究結(jié)果[20-21]一致。但進(jìn)一步分析D3卵裂胚卵裂球數(shù)量≥8個的胚胎優(yōu)質(zhì)囊胚形成率，發(fā)現(xiàn)0PN來源的優(yōu)質(zhì)囊胚形成率顯著高于2PN來源者(67.45% vs. 57.16%，P<0.05)，提示發(fā)育速度較慢的0PN來源胚胎優(yōu)質(zhì)囊胚形成率相對較低，這與之前的研究報道[10，21]結(jié)果相近，之前Seli等[10]、曾勇等[21]提出發(fā)育速度慢的胚胎染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常的比例較大，相比正常胚胎發(fā)育潛能要低。推測發(fā)育潛能好的0PN胚胎可能其原核消失時間早于我們設(shè)定的觀察期，即胚胎發(fā)育速度提前，其發(fā)育潛能可能類似受精卵發(fā)生早期卵裂，是發(fā)育潛能較好的表現(xiàn)，但這尚需進(jìn)一步的研究探討。

0PN來源胚胎在D3胚胎移植時，一般不能被選擇移植，但對于可利用胚胎稀少的患者，又恐丟棄了有正常發(fā)育潛能的胚胎，因此，將這些胚胎進(jìn)一步培養(yǎng)至5～6 d囊胚階段，如果發(fā)育成優(yōu)質(zhì)囊胚，則認(rèn)為有進(jìn)一步使用的價值。本研究中有75例患者在簽署知情同意書后移植了0PN來源的優(yōu)質(zhì)囊胚，60例患者獲得妊娠，臨床妊娠率為80%，甚至高于2PN組患者的臨床妊娠率(P<0.01)，這可能與本研究納入患者數(shù)量較少，數(shù)據(jù)存在一定的偏倚有關(guān)，后期尚需收集更大樣本量進(jìn)行對照研究，以進(jìn)一步探討驗(yàn)證。本研究中0PN組流產(chǎn)率15%，隨訪出生嬰兒情況未見明顯差異，出生嬰兒62例中僅有1例有左耳畸形合并單腎畸形，畸形發(fā)生率與移植2PN來源優(yōu)質(zhì)囊胚的患者比較無顯著性差異(P>0.05)，提示部分0PN來源的優(yōu)質(zhì)囊胚亦可能具有良好的發(fā)育潛能。

綜上所述，臨床上對于無可利用優(yōu)質(zhì)胚胎的患者，可以選擇繼續(xù)培養(yǎng)0PN胚胎至囊胚期，選擇發(fā)育成優(yōu)質(zhì)囊胚的胚胎進(jìn)行移植，以提高患者的胚胎利用率和臨床妊娠率。但因?yàn)?PN胚胎存在染色體異常的可能性仍較大，臨床上胚胎移植前如能結(jié)合遺傳學(xué)篩查技術(shù)，將可獲得更確切的信息，指導(dǎo)臨床應(yīng)用。且本研究所納入樣本量較少，可能存在一定偏倚，后期需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量觀察，以得出更科學(xué)、可信的結(jié)論。

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[編輯：王慧萍]

Analysis of value of zero pronuclear embryos

CHEN Guo-yong，LIU Yun*，ZHANG Qun-fang，HUANG Wu-jian，LIN Chun-li

DepartmentofGynecology，F(xiàn)uzhouGeneralHospitalofNanjingCommand，F(xiàn)uzhou350025

Pronucleus；Cell number；High-quality blastocyst rate；Implantation rate；Clinical pregnancy rate

2015-12-30；

2016-01-19

南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金課題(12Z37)

陳國勇，男，廣東翁源人，本科，醫(yī)師，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*

，Email：liuyunfj@126.com)

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.08.006