陳鴻鵠，吳圓圓，占　利，梅玲玲

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甲型副傷寒沙門(mén)氏菌cdtB亞基的原核表達(dá)及對(duì)巨噬細(xì)胞IL-6、IL-8、TNF-α分泌的影響

陳鴻鵠1，吳圓圓2，占利1，梅玲玲1

目的研究甲型副傷寒沙門(mén)氏菌感染過(guò)程中，cdtB對(duì)宿主巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子的影響。NF-κB信號(hào)通路阻斷劑對(duì)cdtB誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響。方法對(duì)甲型副傷寒沙門(mén)氏菌cdtB亞基進(jìn)行原核表達(dá)，制備并模型純化重組蛋白，建立其刺激人THP-1巨噬細(xì)胞模型，ELISA檢測(cè)THP-1分泌IL-6，IL-8和TNF-α等細(xì)胞因子。在共培養(yǎng)體系中加入NF-κB 信號(hào)通路阻斷劑，ELISA檢測(cè)THP-1分泌IL-6，IL-8和TNF-α等細(xì)胞因子。結(jié)果成功構(gòu)建甲型副傷寒沙門(mén)氏菌cdtB原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)并純化重組cdtB蛋白，與空白對(duì)照相比，受到cdtB刺激的THP-1細(xì)胞上清中的IL-6，IL-8和TNF-α濃度顯著上升，而在THP-1細(xì)胞培養(yǎng)基中加入NF-κB信號(hào)通路阻斷劑SN50可以顯著抑制重組cdtB誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、TNF-α分泌。結(jié)論甲型副傷寒沙門(mén)氏菌cdtB能夠通過(guò)NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-8和TNF-α，在甲型副傷寒相關(guān)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮促進(jìn)作用。

甲型副傷寒沙門(mén)氏菌； cdtB；細(xì)胞因子；巨噬細(xì)胞

甲型副傷寒沙門(mén)氏菌(SalmonellaparatyphiA)引起的甲型副傷寒是常見(jiàn)的腸道傳染病，被列為國(guó)家重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的13種傳染病之一。近年來(lái)，傷寒和副傷寒的總發(fā)病率一直保持穩(wěn)定，但是其中甲副傷寒的發(fā)病比例顯著增高[1-2]。 可見(jiàn)，甲型副傷寒沙門(mén)氏菌已替代傷寒沙門(mén)氏菌成為優(yōu)勢(shì)致病菌。在感染急性期，傷寒和甲副傷寒病人血清中炎癥因子IL-6，IL-8和TNF-α顯著升高[3]。但是，甲型副傷寒沙門(mén)氏菌或甲型副傷寒沙門(mén)氏菌的組分如何導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生炎癥的機(jī)理還有待闡明。

細(xì)胞致死性腫脹毒素(cytolethal distending toxin, CDT)是首先發(fā)現(xiàn)于空腸彎曲桿菌的一種外毒素，重組的空腸彎曲桿菌CDT具有類DNA酶的作用，能損傷巨噬細(xì)胞DNA，而使得細(xì)胞周期停滯，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞腫脹、凋亡。CDT由cdtA、 cdtB和cdtC 3種多肽組成，其中，cdtB引起染色體DNA降解，cdtA和cdtC運(yùn)送cdtB進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)。 傷寒沙門(mén)氏菌只表達(dá)cdtB，不表達(dá)cdtA和cdtC，由于傷寒沙門(mén)氏菌可以被巨噬細(xì)胞內(nèi)吞到胞內(nèi)，傷寒沙門(mén)氏菌可以直接在胞內(nèi)致死宿主細(xì)胞[4]。伴放線桿菌CDT可以直接介導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子[5]。巨噬細(xì)胞是病原菌引發(fā)的炎癥反應(yīng)的核心，通過(guò)抗原提呈和釋放炎癥細(xì)胞因子激活宿主固有免疫系統(tǒng)，巨噬細(xì)胞在宿主控制和清除沙門(mén)氏菌感染的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[6]。甲型副傷寒沙門(mén)氏菌攜帶編碼cdtB的基因cdtB(GenBank accession No.: NC_006511.1)，不攜帶cdtA和cdtC。本研究對(duì)甲型副傷寒沙門(mén)氏菌cdtB亞基進(jìn)行原核表達(dá)，制備并模型純化了重組蛋白并建立其刺激人THP-1巨噬細(xì)胞模型。利用ELISA等檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌水平，從細(xì)胞水平上研究甲副傷寒沙門(mén)氏菌cdtB亞基對(duì)巨噬細(xì)胞分泌IL-6，IL-8和TNF-α的影響。

1　材料與方法

1.1菌株來(lái)源和培養(yǎng)甲型副傷寒沙門(mén)菌參考標(biāo)準(zhǔn)株(CMCC 50001)由本實(shí)驗(yàn)室保存，采用營(yíng)養(yǎng)肉湯(Oxoid)培養(yǎng)。

1.2cdtB基因原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及鑒定采用細(xì)菌基因組DNA制備試劑盒(Axygen)提取甲型副傷寒沙門(mén)菌CMCC 50001株基因組DNA，分光光度法測(cè)定其濃度。PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)cdtB基因(GenBank accession No. NC_006511.1)，引物序列如下：上游 5′-CGC CAT ATG (NdeI) AAAAAACCTGTTTTTTTCCT-3′，下游 5′-CGC CTC GAG (XhoI) ACAGCTTCGTGCCAAAAAGG-3′。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。采用1 μg/mL溴乙錠預(yù)染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，采用T-A克隆試劑盒(TaKaRa)cdtB基因擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pMDl9-T形成重組質(zhì)粒pMDl9-TcdtB，委托上海Invitrogen公司測(cè)序。pMDl9-TcdtB和表達(dá)載體pET42a(Novagen)分別用NdeI(TaKaRa)和XhoI(TaKaRa)雙酶切，瓊脂糖電泳分離酶切片段后切膠回收目的片段。在T4 DNA連接酶(TaKaRa)作用下，將cdtB基因片段與線性化pET42a連接后轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21DE3 (Novagen)形成E．coliBL21DE3pET42a-cdtB表達(dá)重組cdtB。用10%分離膠的SDS-PAGE聯(lián)合Bio-Rad凝膠圖像分析系統(tǒng)檢查重組cdtB的表達(dá)情況，Ni-NTA親和層析柱(BioColor)提純重組cdtB。

1.3去除重組cdtB中的LPS為了避免大腸桿菌表達(dá)得到的重組cdtB中可能出現(xiàn)的大腸桿菌LPS污染，本研究通過(guò)Detoxi-Gel內(nèi)毒素去除膠(Thermo Scientific, USA)去除重組cdtB中的LPS。為了檢測(cè)LPS是否完全去除，我們利用鱟試劑檢測(cè)重組cdtB，重組cdtB稀釋到不同濃度，各取100 μL加入等量鱟試劑，37 ℃孵育1 h。倒置試管，內(nèi)容物凝固不能從管壁滑落為陽(yáng)性結(jié)果；內(nèi)容物從管壁滑落為陰性結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中，無(wú)熱原水作為陰性對(duì)照，大腸桿菌LPS (Invivogen, USA)作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4人單核分化巨噬細(xì)胞THP-1的分化與培養(yǎng)THP-1細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中(1×106細(xì)胞/孔，2 mL每孔)，于37 ℃、 5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜使成單層細(xì)胞。THP-1細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)前加入終濃度為50 ng/mL佛波酯(PMA)刺激分化48 h，使之分化為巨噬細(xì)胞。

1.5重組cdtB蛋白刺激人單核分化巨噬細(xì)胞THP-1在經(jīng)過(guò)PMA處理的THP-1(105/mL)的培養(yǎng)基中分別加入終濃度為0.1，1和10 μg/mL的重組cdtB，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集上清，ELISA(ebioscience)檢測(cè)上清中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度。本實(shí)驗(yàn)中，不外加重組cdtB的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清作為空白對(duì)照。

1.6NF-κB信號(hào)通路阻斷研究 為了研究NF-κB信號(hào)通路阻斷對(duì)重組cdtB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-6、IL-8、TNF-α分泌的影響，20 μmol/L NF-κB信號(hào)通路阻斷劑SN50 (Tocris Bioscience, USA) 加入經(jīng)過(guò)PMA預(yù)處理的THP-1細(xì)胞(2×10/孔)培養(yǎng)基中，1 h后用1 μg/mL重組cdtB刺激THP-1細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集上清，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IL-6、IL-8和TNF-α的濃度。本實(shí)驗(yàn)中，不外加NF-κB信號(hào)通路阻斷劑SN50和重組cdtB的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清作為空白對(duì)照，重組cdtB刺激的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定甲型副傷寒沙門(mén)菌CMCC 50001株基因組DNA中可以擴(kuò)增出預(yù)期大小的cdtB基因片段(圖1)。測(cè)序及序列分析結(jié)果顯示，與GenBank中甲型副傷寒沙門(mén)菌ATCC26695株cdtB基因核苷酸和氨基酸序列相似性分別為97.62%和99.82%。

M: DNA marker; Lane 1: Blank control; Lane 2: Amplification fragments of cdtB gene from S.para CMCC 50001 strains.圖1　甲型副傷寒桿菌CMCC 50001株cdtB基因PCR結(jié)果Fig.1　PCR result of cdtB gene from S.para CMCC 50001 strains

2.2重組cdtB的表達(dá)及提純效果在IPTG誘導(dǎo)下，E．coliBL21DE3pET42a-cdtB能夠高效表達(dá)重組cdtB，該重組蛋白以可溶的形式存在。利用Ni-NTA親和層析法提純重組cdtB蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組cdtB蛋白在膠上表現(xiàn)為單一的蛋白條帶(圖2)。

M: protein marker; Lane 1: Blank control (wild-type pET42a). Lane 2 and 3: The expressed and purified SPA-rCdtB protein, respectively.圖2　甲型副傷寒桿菌CMCC 50001株重組CdtB表達(dá)和提純效果Fig.2　Effects of rCdtB expression and purification effects of S.para CMCC 50001 strains

2.3重組cdtB對(duì)巨噬細(xì)胞IL-6、IL-8、TNF-α分泌的影為了研究重組cdtB對(duì)巨噬細(xì)胞的促炎作用，我們用不同濃度的重組cdtB(0.1 μg/mL，1 μg/mL和10 μg/mL)刺激THP-1細(xì)胞。24 h后，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IL-6、IL-8和TNF-α。結(jié)果顯示，與沒(méi)有受到重組cdtB刺激的對(duì)照組相比，受到cdtB刺激的THP-1細(xì)胞上清中IL-6，IL-8和TNF-α濃度上升，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)(t=4.13，P<0.05)。不同刺激時(shí)間(h)對(duì)上清中IL-6，IL-8和TNF-α濃度影響的研究結(jié)果顯示，上清中的IL-6濃度在6～12 h間顯著上升(t=4.38，P<0.05)，約在24～48 h時(shí)到達(dá)峰值。IL-8的分泌在2～6 h開(kāi)始顯著升高(t=6.07,P<0.05)，約在24～48 h時(shí)到達(dá)峰值。TNF-α的表達(dá)在2～6 h間顯著上升(t=3.78，P<0.05)，約在12～24 h時(shí)到達(dá)峰值(圖3)。

圖3　不同濃度重組CdtB對(duì)THP-1細(xì)胞因子分泌的影響Fig.3　Ability of rcdtB proteins to induce IL-6, IL-8 and TNF-α in THP-1 cells

2.4NF-κB信號(hào)通路阻斷對(duì)重組cdtB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-6、IL-8、TNF-α分泌的影響在THP-1細(xì)胞培養(yǎng)基中加入NF-α信號(hào)通路阻斷劑SN50，1 h后用重組cdtB刺激THP-1細(xì)胞，24 h后，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IL-6、IL-8和TNF-α。結(jié)果顯示，與沒(méi)有加入NF-κB信號(hào)通路阻斷劑的陽(yáng)性對(duì)照組相比，在THP-1細(xì)胞培養(yǎng)基中加入NF-κB信號(hào)通路阻斷劑SN50可以顯著抑制重組cdtB誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、TNF-α分泌(t=2.41，P<0.05)(圖4)。

圖4　NF-κB信號(hào)通路阻斷對(duì)重組cdtB誘導(dǎo)THP-1分泌細(xì)胞因子的影響Fig.4　Influence of NF-κB signaling pathways inhibitor in rcdtB inducing IL-6, IL-8 and TNF-α

3　討　論

宿主對(duì)抗傷寒或甲型副傷寒沙門(mén)氏菌感染的特點(diǎn)是釋放促炎細(xì)胞因子，LPS被認(rèn)為是傷寒和甲型副傷寒沙門(mén)氏菌的主要促炎組分。但是大多數(shù)傷寒病人血清中不能檢測(cè)到內(nèi)毒素的存在，同時(shí)，傷寒沙門(mén)氏菌LPS耐受的動(dòng)物模型在受到傷寒沙門(mén)氏菌攻擊時(shí)，還是表現(xiàn)傷寒熱的癥狀，說(shuō)明傷寒和甲型副傷寒沙門(mén)氏菌LPS不是唯一促炎組分。傷寒和甲型副傷寒沙門(mén)氏菌的其他組分，如鞭毛蛋白，菌毛等也能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞分泌促炎因子[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，甲型副傷寒沙門(mén)氏菌重組cdtB能促使巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-8和TNF-α，通過(guò)使用Detoxi-Gel內(nèi)毒素去除膠處理重組cdtB，這些促炎細(xì)胞因子的釋放可以排除LPS污染的可能性。TNF-α是早期反應(yīng)的促炎細(xì)胞因子，IL-6和IL-8是炎癥反應(yīng)中重要的趨化因子，可以趨化和激活多種特異和非特異性的免疫細(xì)胞，從而激活宿主固有免疫系統(tǒng)[9-10]。這與以往的李鐵民報(bào)道的傷寒沙門(mén)氏菌能使人巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的結(jié)果是一致的[11]。

NF-κB信號(hào)通路是調(diào)控促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)的主要信號(hào)通路，NF-κB信號(hào)通路通過(guò)級(jí)聯(lián)信號(hào)放大和NF-rd3的表達(dá)，可以輔助促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[12]。本研究通過(guò)NF-κB信號(hào)通路阻斷劑，證明甲型副傷寒沙門(mén)氏菌重組cdtB主要通過(guò)NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-8和TNF-α。但是，NF-κB信號(hào)通路阻斷劑不能完全阻斷甲型副傷寒沙門(mén)氏菌重組cdtB誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-8和TNF-α，這結(jié)果說(shuō)明，甲型副傷寒沙門(mén)氏菌重組cdtB可能還通過(guò)其他信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子。

我們的研究結(jié)果證明，甲型副傷寒沙門(mén)氏菌致死性腫脹毒素能夠通過(guò)NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-8和TNF-α，在甲型副傷寒相關(guān)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了促進(jìn)作用。

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Cloning and expression of recombinantSalmonellaparatyphiA cytolethal distending toxin proteins and its effect on cytokine production by human monocyte-derived macrophages

CHEN Hong-hu1, WU Yuan-yuan2, ZHAN Li1, MEI Ling-ling1

(1.DepartmentofMicrobiology,ZhejiangProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Hangzhou310051,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,theChildren'sHospital,ZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310003,China)

To investigate the role ofSalmonellaparatyphiA cytolethal distending toxin (CDT) in pro-inflammatory cytokines induction in macrophages, we cloned and expressed cdtB, a subunit of CDT fromSalmonellaparatyphi(S.paratyphi) A inEscherichiacoli, and purified the recombinant cdtB proteins (SPA-rcdtB) to homogeneity by Ni-NTA affinity chromatography. By co-cultured SPA-rcdtB with human monocyte-derived macrophages (THP-1) and detected IL-6, IL-8 and TNF-α in supernatant by ELISA, we determined if SPA-rcdtB were able to induce human monocyte-derived macrophages to produce cytokines. In addition, NF-κB inhibitor SN50 was used to research the effect of NF-κB signaling pathways in SPA-rcdtB induced macrophage IL-6, IL-8 and TNF-α secretion. In this study, we proved that the cdtb gene segment amplified fromS.paratyphiA CMCC 50001 strains showed high nucleotide and amino acid sequence identities (97.62% and 99.82%) compared withcdtbgene in the GenBank (GenBank accession No. NC_006511.1). And the SPA-rcdtB were able to induce the synthesis by THP-1 of interleukin-6, IL-8 and TNF-α, and the IL-6, IL-8 and TNF-α induction by SPA-rCdtB was significantly suppressed by NF-κB inhibitor. This result indicated that SPA-rcdtB plays a promoting role inflammatory response associated with SPA infection.

SalmonellaparatyphiA; cytolethal distending toxin; cytokines; macrophages.

Supported by the grants from the Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Provention (No. 2013-11)

Mei Ling-ling, Email: llmei@cdc.zj.cn

梅玲玲，Email：llmei@cdc.zj.cn

1. 浙江省疾病預(yù)防控制中心微生物所，杭州310051；2. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)中心，杭州310003

R378.2

A

1002-2694(2016)06-0535-04

2015-11-13；

2016-03-30

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.006

浙江省疾病預(yù)防控制中心青年科技項(xiàng)目(No.2013-11)資助