林聰宏，主性*，粟朝芝，李莉娜，吳仙，韓勇*

(1.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550025;2.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005)

貴州黑山羊瘤胃一株環(huán)狀芽孢桿菌的分離鑒定

林聰宏1，主性1*，粟朝芝2，李莉娜2，吳仙2，韓勇2*

(1.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550025;2.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005)

為了解貴州黑山羊瘤胃液內(nèi)芽孢桿菌的主要種類，采用亨蓋特滾管技術(shù)從裝有永久性瘤胃瘺管的貴州黑山羊瘤胃中進行菌株的分離培養(yǎng)，其中1株分離菌株經(jīng)過革蘭氏染色、形態(tài)觀察、16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，此菌株革蘭氏染色陽性，呈桿狀，末端鈍圓，在系統(tǒng)發(fā)育樹中與Bacillus circulans strain JSC SF51處在同一分支，鑒定為環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans Jordan)。這對開展貴州黑山羊瘤胃微生物區(qū)系及瘤胃營養(yǎng)調(diào)控等研究具有一定的參考價值。

貴州黑山羊;亨蓋特滾管技術(shù);環(huán)狀芽孢桿菌;分離;鑒定

貴州黑山羊是優(yōu)良的地方山羊品種，具有適應(yīng)力強、抗病力強、耐粗飼能力強和肉質(zhì)優(yōu)良等特點，作為貴州地方第二大山羊品種，是組成喀斯特地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的重要部分［1］。貴州黑山羊瘤胃微生物種類多且數(shù)量大，主要有細菌、真菌、原蟲和少量噬菌體等，各類微生物之間存在著競爭和協(xié)同的復(fù)雜關(guān)系，貴州黑山羊瘤胃細菌數(shù)量為109～1010cfu/mL，原蟲數(shù)量為105～106cfu/mL，真菌游動孢子數(shù)為103～105個/mL，噬菌體數(shù)量為107～109微粒/mL［2］。瘤胃中降解纖維素的細菌主要包括白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、溶纖維丁酸弧菌、芽孢桿菌及梭菌等［3］。環(huán)狀芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的一員，不僅具備促進腸內(nèi)菌群生態(tài)平衡的作用，還有抗逆性強、營養(yǎng)需求低和致病性低等特點，因此也是最理想益生菌類之一［4］。環(huán)狀芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物β－甘露聚糖酶能夠提高畜禽的抗病性能，改善動物健康狀況，恢復(fù)動物的生長性能，進而減小經(jīng)濟損失。將β－甘露聚糖酶添加入日糧中時，可去除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，促進營養(yǎng)的消化和吸收，并能降低畜禽在病菌感染時的死亡率［5］。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀芽孢桿菌中的胞外多糖即使在低濃度情況下都具備相當(dāng)高的活性［6］，利用這一特性，將胞外多糖的生物活性，如免疫活性、抗腫瘤和抗?jié)兊葢?yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域或成為可能。

本研究利用亨蓋特滾管技術(shù)［7］從貴州黑山羊瘤胃微生物中分離培養(yǎng)出1株環(huán)狀芽孢桿菌，為進一步了解貴州黑山羊瘤胃芽孢桿菌種類及微生物區(qū)系組成提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 瘤胃液采集:利用真空泵從已安裝永久瘤胃瘺管的貴州黑山羊瘤胃中抽取瘤胃液100 mL，用4層無菌紗布過濾，將濾液移入充有CO2的樣品瓶中，立即放入冰盒后迅速帶回實驗室進行分離。

1.1.2 培養(yǎng)基:參照《綿羊瘤胃主要纖維降解細菌的分離鑒定及不同氮源對其纖維降解能力的影響》中的配方進行培養(yǎng)基準備［8］，并進行微調(diào)整。其中:分離培養(yǎng)基配方將維生素混合液從配方中去除，揮發(fā)性脂肪酸混合液補充正丁酸1 mL，基礎(chǔ)培養(yǎng)液的瓊脂用量從15 g調(diào)整為20 g，培養(yǎng)液最終pH值調(diào)節(jié)到7.0;富集培養(yǎng)基進行滅菌前將pH值調(diào)節(jié)到7.0。

1.1.3PCR試劑:本課題所用dNTP、PMD18－T載體、Taq DNA聚合酶、瓊脂糖、膠回收試劑盒、DL2000 DNA Marker、質(zhì)粒提取試劑盒和天根細菌DNA提取試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司。細菌的16S rDNA通用引物由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株初篩:將瘤胃液樣品以400 r/min離心6 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中并2 000 r/min離心5 min，取沉淀無菌無氧重懸，梯度稀釋到10－6、10－7、10－8，用一次性注射器抽取各稀釋度0.5 mL到厭氧試管中做亨蓋特滾管培養(yǎng)［2］。滾管時管口朝上，管體傾斜30°，防止培養(yǎng)基凝固堵塞管口。滾管后37℃培養(yǎng)24 h，挑取菌落到富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。取0.5 mL富集培養(yǎng)液到厭氧試管再次滾管，培養(yǎng)后挑菌落進行革蘭氏染色，屬革蘭氏陽性桿菌的菌落則繼續(xù)分離純化，直到滾管中菌落形態(tài)、顏色和大小一致且革蘭氏染色鏡檢時沒有其他雜菌。

1.2.2 菌株富集:將已純化的單菌接種到富集培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與初篩一致，續(xù)傳3次。

1.2.3 菌株基因組DNA提取:準備經(jīng)過富集的細菌培養(yǎng)液3 mL，使用細菌基因組提取試劑盒進行菌株DNA的提取，具體步驟參見天根細菌基因組提取試劑盒說明書。

1.2.4 PCR擴增:采用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增。所用的引物序列為27F(5’－AGAGTTTGATCMTGGCTCAG－3’)和1492R(5’－TACGGYTACCTTGTTACGACTT－3’)。PCR反應(yīng)體系采用50 μL體系，包括5.0 μL 10×Ex Taq buffer、4.0 μL 2.5 mM dNTP Mix、10 p Primer 1和10 p Primer 2各1.0 μL、2.0 μL Template、0.5 μL 5 u Ex Taq和36.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件:95℃5 min;95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min 30 s，30 cycles;72℃10 min，4℃終止反應(yīng)。

1.2.5 16S rDNA序列測定:PCR產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行16S rDNA序列測定。

2 結(jié)果

2.1 分離純化結(jié)果與菌落形態(tài)經(jīng)過分離純化，得到1株革蘭氏染色鏡檢菌體呈末端鈍圓的紫色桿菌，菌株編號為2－2－2。在厭氧試管的分離培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h，菌落呈乳白色圓形或稍橢圓，扁平光滑。革蘭氏染色后鏡檢，菌體呈末端鈍圓的紫色桿菌狀。分離菌株在厭氧試管中的菌落形態(tài)見圖1。

圖1 厭氧試管中菌落照片

2.2 細菌基因組DNA提取和PCR產(chǎn)物檢測回收得到的DNA片段使用紫外分光光度計檢測得出DNA濃度為312.14 ng/μL，OD260/280為1.9，濃度和純度符合要求。PCR擴增產(chǎn)物中檢測到約1.4 kb DNA特異目標(biāo)帶，純化后完成測序，見圖2。

圖2 細菌的16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 16S rDNA序列測定分離菌株使用Sanger測序?qū)N序列進行測序，將測序結(jié)果進行拼接得到的16S rDNA序列見圖3。

圖3 菌株16S rDNA的拼接序列

2.4系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建將方法2.3中得到的菌株16S rDNA序列使用NCBI的nucleotide blast進行核酸序列的檢索，檢索使用blast程序，數(shù)據(jù)庫選擇Nucleotide collection(nt)，其他參數(shù)使用默認參數(shù)。對于檢索得到的序列結(jié)果，選擇Identity較高，E－value較低的序列下載其fasta格式。使用MEGA 6.0軟件中的MUSCLE多序列比對程序?qū)ι鲜鱿螺d的序列和本次實驗測序得到的序列(命名為2－2－2)進行多序列比對(Multiple sequence alignment，MSA)。然后使用多序列比對的結(jié)果構(gòu)建進化樹。進化樹的結(jié)果見圖4。

圖4 依據(jù)16S rRNA序列構(gòu)建的菌株2－2－2和同屬相關(guān)種的系統(tǒng)發(fā)育樹

在Blast的結(jié)果中，比對上的序列大部分是Bacillus circulans菌屬的細菌。在進化樹的結(jié)果中，序列之間的親緣性都很高，遺傳距離很近，這與Blast結(jié)果相符合。根據(jù)序列2－2－2在進化樹中的位置，實驗得到的序列與Bacillus circulans strain JSC SF51在同一分支上，可以判定本實驗測序中所得到的細菌16S rDNA的序列屬于環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans Jordan)。

3 小結(jié)

環(huán)狀芽孢桿菌對營養(yǎng)要求表現(xiàn)為廣譜，在土壤中大量存在，貴州黑山羊采食草料時將其帶入瘤胃中，進而在瘤胃內(nèi)生長繁殖。其適應(yīng)能力強，能夠形成抗逆性很強的芽孢結(jié)構(gòu)，當(dāng)環(huán)境條件適宜時重新萌發(fā)形成營養(yǎng)體細胞。本研究采用亨蓋特滾管技術(shù)從貴州黑山羊瘤胃液中分離得到1株環(huán)狀芽孢桿菌，經(jīng)16S rDNA序列測定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建分析，與Bacillus circulans strain JSC SF51在同一分支上，可以判定實驗測序中所得到的細菌16S rDNA的序列屬于Bacillus circulans Jordan。本研究對了解貴州黑山羊瘤胃微生物區(qū)系組成具有重要的意義，對開展貴州黑山羊瘤胃微循環(huán)、瘤胃營養(yǎng)調(diào)控等研究分析具有一定的參考價值。

［1］陳歷俊.盤縣“貴州黑山羊”養(yǎng)殖情況調(diào)查［J］.農(nóng)業(yè)工程，2014，4(3):167－168.

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［3］焦萬洪，李莉.牛瘤胃內(nèi)主要細菌結(jié)構(gòu)與功能探查［J］.中國畜禽種業(yè)，2016(2):84.

［4］張保全，朱年華.芽孢桿菌在畜牧業(yè)中應(yīng)用的研究進展［J］.江西畜牧獸醫(yī)雜志，2007(1):2－3.

［5］楊新建，段素云，王偉青，等.環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物在改善肉雞體重均勻度及健康狀況方面的應(yīng)用研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014(6):75－77.

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Isolation and Identification of A Bacillus Circulans Jordan in Guizhou Black Goat Rumen

Lin Conghong1，Zhu Xing1*，Su Chaozhi2，Li Lina2，Wu Xian2，Han Yong2*
(1.Guizhou University，Guiyang Guizhou 550025，China;2.Guizhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Guiyang Guizhou 550005，China)

The aim of this study was to isolate and identify a strain of Bacillus circulans Jordan isolated from the ruminal fluid of Guizhou black goat.By using the Hungate Roll Tube Technology，a strain was isolated from the ruminal fluid of Guizhou black goat which fitted with permanent rumen fistula.Based on the results of gram staining，morphologic observation，16S rDNA sequence analysis，and Phylogenetic tree construction，it was confirmed as Bacillus circulans Jordan.This strain was gram positive，the cell was in shape，and the end was blunt，and it was in the same branch with Bacillus circulans strain JSC SF51 in the phylogenetic tree.It was value of the study which Rumen microbiota，rumen nutrient regulation was analyzed in the ruminal fluid of Guizhou black goat.

Guizhou Black Goat;Hungate Roll Tube Technology;Bacillus Circulans Jordan;Isolation;Identification

S827.1

A

1007－1474(2016)03－0007－04

2016－03－29

國家自然科學(xué)基金“13C標(biāo)記LA對貴州黑山羊瘤胃CLA合成影響的生物機制研究”(31460618)

林聰宏(1990—)，男，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)臨床方面研究。

*通訊作者:(1)韓勇(1978—)，男，副研究員，博士，主要從事反芻動物營養(yǎng)方面研究。E－mail:hanyong7809@126.com。(2)主性(1972—)，男，副教授，博士，主要從事獸醫(yī)臨床方面研究。E－mail:zhuxin72@126.com