蔣朝暉，邱先艷，余紅嵐

(貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科　550002)

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骨髓細(xì)胞髓過(guò)氧化物酶染色質(zhì)控體系的建立

蔣朝暉，邱先艷，余紅嵐△

(貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科550002)

目的探討自制乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝正常外周靜脈血片作為骨髓細(xì)胞髓過(guò)氧化物酶(MPO)染色陽(yáng)性對(duì)照的可能性，初步建立MPO染色的質(zhì)控體系。方法選取EDTA抗凝的正常外周靜脈血制成200張血片，分為不固定組和固定組(95%乙醇固定)，每隔15 d各組取10張血片進(jìn)行MPO染色，觀察其陽(yáng)性率和積分變化。結(jié)果血片中MPO酶活性隨著時(shí)間推移而減弱，經(jīng)95%乙醇固定后，其陽(yáng)性率能維持90 d左右；而MPO陽(yáng)性積分一直隨時(shí)間推移而減低，且固定組與不固定組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論可選用自制EDTA-K2抗凝正常外周靜脈血片經(jīng)95%乙醇固定后作為MPO染色的陽(yáng)性對(duì)照，其有效期約為90 d。

骨髓細(xì)胞；髓過(guò)氧化物酶染色；外周靜脈血；陽(yáng)性對(duì)照；質(zhì)控體系

目前臨床主要依靠骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)(M)、細(xì)胞免疫學(xué)(I)、細(xì)胞遺傳學(xué)(C)和分子生物學(xué)(M)聯(lián)合方法(MICM分型)對(duì)白血病進(jìn)行診斷和分型[1]。但部分基層醫(yī)院受到設(shè)備及技術(shù)水平的限制，對(duì)于白血病的初步診斷還主要依靠形態(tài)學(xué)。由于白血病細(xì)胞的異質(zhì)性和多態(tài)性，加上閱片人員的經(jīng)驗(yàn)及水平差異，形態(tài)學(xué)判斷符合率較低(64%～77%)，但結(jié)合細(xì)胞化學(xué)染色后，其符合率能提高至86%左右[2-3]。常規(guī)或電鏡下的骨髓細(xì)胞髓過(guò)氧化物酶(MPO)染色對(duì)輔助判斷急性白血病形態(tài)學(xué)具有重要價(jià)值，能初步區(qū)分髓系與非髓系[4-5]。但在一些特殊病例中，比如MPO缺失患者[6]，或者個(gè)別急性淋巴細(xì)胞白血癥患者骨髓中原幼淋巴細(xì)胞異常增生會(huì)抑制其他系統(tǒng)發(fā)育，有時(shí)會(huì)很難見(jiàn)到成熟的粒細(xì)胞，即所謂的染色“內(nèi)對(duì)照”很難找到，此時(shí)很難判斷是真的陰性結(jié)果還是試劑失效或操作失誤，因此引入質(zhì)控物尤其是陽(yáng)性對(duì)照對(duì)結(jié)果判讀至關(guān)重要。由于MPO染色實(shí)驗(yàn)過(guò)程受到試劑有效期、環(huán)境溫度、細(xì)胞數(shù)量及孵育時(shí)間等因素影響，主觀性強(qiáng)，很難實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化?，F(xiàn)有報(bào)道多集中在MPO與疾病的相關(guān)性，而對(duì)于MPO染色實(shí)驗(yàn)本身質(zhì)量控制的報(bào)道少見(jiàn)，本研究擬利用自制抗凝外周血片作為陽(yáng)性對(duì)照，摸索其保存時(shí)間及保存條件，探討其作為MPO染色陽(yáng)性對(duì)照的可行性，初步建立MPO染色的質(zhì)控體系。

1　材料與方法

1.1材料所有標(biāo)本均來(lái)源于貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院門診患者；主要試劑：MPO染色試劑(聯(lián)苯胺法，珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1選取合適的靜脈血制成血片選取的陽(yáng)性對(duì)照血片細(xì)胞組成：白細(xì)胞9.2×109/L，中性粒細(xì)胞占60%、淋巴細(xì)胞占34%、單核細(xì)胞占5%、嗜酸性粒細(xì)胞占1%。制成血片200張，取一半用95%乙醇固定，即分為固定組與不固定組。

1.2.2MPO染色染色步驟嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：涂片干燥后，滴加聯(lián)苯胺液數(shù)滴(覆蓋血膜)，再滴加H2O2數(shù)滴(兩者比例1∶1)，室溫孵育5～10 min，蒸餾水沖洗2 min；甩干，瑞姬氏染液與磷酸鹽緩沖液1∶2混合染色3～5 min，流水沖洗，干后鏡檢。陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色、藍(lán)色至黑色顆粒。為了更準(zhǔn)確反映其陽(yáng)性程度，筆者參照中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色積分判讀標(biāo)準(zhǔn)對(duì)MPO陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行積分：(-)0分，細(xì)胞質(zhì)中無(wú)陽(yáng)性染色顆粒；(+)1分，細(xì)胞質(zhì)中含少量棕黃色顆粒；(++)2分，細(xì)胞質(zhì)中含中等量棕黃色顆粒、藍(lán)色或黑色顆粒；(+++)3分，細(xì)胞質(zhì)中含較多棕黃色、藍(lán)色或黑色顆粒；(++++)4分，細(xì)胞質(zhì)中或整個(gè)細(xì)胞覆蓋黑色顆粒。根據(jù)以上判讀標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞，記錄其陽(yáng)性率及積分。

1.2.3摸索血片的保存條件將制成的血涂片在相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境(室溫20 ℃，相對(duì)濕度40%)中遮光保存，每隔15 d各組取10張血片進(jìn)行MPO染色，比較其MPO陽(yáng)性率和積分的變化。

2　結(jié)　果

2.1固定組及不固定組外周血MPO染色陽(yáng)性率受時(shí)間影響情況不固定組MPO酶活性能維持60 d左右，60 d后陽(yáng)性率逐漸下降(P<0.05)；而經(jīng)95%乙醇固定后，其酶活性能維持更長(zhǎng)時(shí)間達(dá)90 d左右。見(jiàn)圖1。

2.2固定組及不固定組外周血MPO染色陽(yáng)性積分受時(shí)間影響情況固定組與不固定組MPO陽(yáng)性積分隨時(shí)間逐漸減低(P<0.05)，不固定組與固定組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1　固定組與不固定組MPO陽(yáng)性率比較

圖2　固定組與不固定組MPO陽(yáng)性積分比較

3　討　論

MPO是人體中中性粒細(xì)胞內(nèi)含量最多的一種蛋白質(zhì)，該酶是粒細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)之前在骨髓內(nèi)合成并存在于嗜天青顆粒中的一種血紅素蛋白酶，主要存在于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和某些巨噬細(xì)胞中[7-9]。MPO陰陽(yáng)性或者其陽(yáng)性強(qiáng)度對(duì)白血病的鑒別診斷具有重要價(jià)值，朱竑等[2]報(bào)道MPO的陽(yáng)性指數(shù)強(qiáng)弱順序?yàn)镸3>M2b>M2a>M6>M4>M1>M5>ALL。但目前MPO染色均由人工完成，聯(lián)苯胺工作液有效期很短需要現(xiàn)配，陽(yáng)性率會(huì)受到試劑有效期的影響；而陽(yáng)性強(qiáng)度又與細(xì)胞數(shù)量、染色時(shí)間及環(huán)境溫度息息相關(guān)；結(jié)果判讀主觀性強(qiáng)。因此，如果沒(méi)有質(zhì)控體系，很難保證MPO染色結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性。

由于關(guān)于MPO染色實(shí)驗(yàn)本身質(zhì)量控制的報(bào)道少見(jiàn)，本研究首次摸索了自制抗凝外周血片，探討其作為MPO染色陽(yáng)性對(duì)照的可行性，初步建立MPO染色的質(zhì)控體系。本研究對(duì)陽(yáng)性對(duì)照血片的保存條件和有效期進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：已知細(xì)胞組成的外周血(同時(shí)存在較多的中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)在20 ℃、40%濕度左右的環(huán)境中遮光保存，MPO酶活性隨著時(shí)間推移而減弱，經(jīng)95%乙醇固定后，其陽(yáng)性率能維持90 d左右；而MPO陽(yáng)性積分一直隨時(shí)間推移而減低，且固定組與不固定組沒(méi)有明顯差異。在隨后的工作中，將該質(zhì)控品應(yīng)用于標(biāo)本檢測(cè)，使用方便，也不存在試劑浪費(fèi)，較好地起到了質(zhì)控作用。

綜上所述，批量制作已知細(xì)胞成分的外周血片，經(jīng)95%乙醇固定后，可作為MPO染色的陽(yáng)性對(duì)照，其效期約為90 d。今后的研究將集中在選擇合適的固定劑或改變保存條件(低溫)能否延長(zhǎng)其效期；另外，由于中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶、特異性酯酶同樣存在于中性粒細(xì)胞中，同一份陽(yáng)性對(duì)照能否同時(shí)應(yīng)用于其他化學(xué)染色的實(shí)驗(yàn)中都有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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2016-04-13修回日期：2016-05-26)

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.041

A

1673-4130(2016)15-2155-03

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