肖鴿飛，周　翔，周玉球，莊志成，趙艷玲，胡玲玲

(廣東省珠海市婦幼保健院　519001)

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血清炎性細(xì)胞因子與孤獨(dú)癥譜系障礙相關(guān)性的探討

肖鴿飛，周翔，周玉球，莊志成，趙艷玲，胡玲玲

(廣東省珠海市婦幼保健院519001)

目的研究炎性細(xì)胞因子與孤獨(dú)癥譜系障礙(ASD)的相關(guān)性，尋找診治該病的新的血清標(biāo)志物。方法采用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對(duì)20例ASD病例及20例健康對(duì)照兒童血清標(biāo)本的干擾素γ、白細(xì)胞介素、巨噬細(xì)胞炎性蛋白等40種炎性細(xì)胞因子進(jìn)行測(cè)定分析。結(jié)果ASD病例組的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，多種白細(xì)胞介素如IL-4、IL-5、IL-10、IL-11、IL-13、IL-17A，以及CXC類趨化因子9等細(xì)胞因子表達(dá)水平高于健康對(duì)照組(P<0.05)；而巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1β、血小板源生長(zhǎng)因子B亞基、CC類趨化因子5、金屬蛋白酶組織抑制劑1、金屬蛋白酶組織抑制劑2、腫瘤壞死因子受體Ⅱ等細(xì)胞因子表達(dá)水平低于健康對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論ASD兒童血清中巨噬細(xì)胞炎性蛋白等多種炎性細(xì)胞因子呈顯著性升高或降低，提示ASD的發(fā)病機(jī)制與免疫系統(tǒng)受炎性刺激有關(guān)。

孤獨(dú)癥譜系障礙；炎癥；細(xì)胞因子

孤獨(dú)癥譜系障礙(ASD)又稱自閉癥或孤獨(dú)癥，是兒童最常見的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病之一，且男性明顯高于女性，在全球各地兒童中患病率約為1%[1]，我國(guó)部分地區(qū)的ASD患病率為2.55/1 000[2]，至今尚沒(méi)有全國(guó)性的ASD流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)[3]。該病起病于嬰幼兒期，主要表現(xiàn)為不同程度的語(yǔ)言溝通障礙、社會(huì)交往障礙、重復(fù)刻板行為及狹隘的興趣等，多數(shù)患者伴有明顯的精神發(fā)育遲滯。因其較高的發(fā)病率和對(duì)家庭、學(xué)校、社會(huì)造成的不良影響已成為備受關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。本研究擬從免疫學(xué)角度來(lái)研究炎性細(xì)胞因子與兒童ASD發(fā)病的相關(guān)性，篩選出有實(shí)踐意義的生物標(biāo)志物，為進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)制、早期診斷和及早干預(yù)提供科學(xué)依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料

1.1.1病例納入標(biāo)準(zhǔn)用ASD行為評(píng)定量表(ABC量表)≥57分、兒童孤獨(dú)癥評(píng)定量表(CARS)≥30分作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》第5版(DSM-V)。

1.1.2病例排除標(biāo)準(zhǔn)排除患有嚴(yán)重的心、肝、腎等軀體疾病，兒童精神分裂癥，單純精神發(fā)育障礙、單純語(yǔ)言發(fā)育障礙，其他廣泛性發(fā)育障礙，聾啞，以及診斷不明確、伴有其他神經(jīng)系統(tǒng)器質(zhì)性疾病的兒童。

1.1.3分組病例組(A組)參照以上標(biāo)準(zhǔn)選取珠海市婦幼保健院2015年6～9月就診的ASD患兒20例，其中男15例、女5例，平均年齡(3.2±0.9)歲；健康對(duì)照組(B組)選取同期兒?？企w檢健康的同齡兒童20例，性別比例同A組，平均年齡(3.1±1.0)歲。兩組性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A組及B組抽血前3個(gè)月均未患感冒、肺炎、哮喘等炎性疾病。A組中再按病情輕重程度將病例分為輕-中度組(A1組)和重度組(A2組)，其中A1組ABC量表評(píng)分≥57分或CARS量表評(píng)分≥30分，A2組ABC量表評(píng)分≥67分且CARS量表評(píng)分≥36分。

1.2方法

1.2.1血清標(biāo)本的留取A組和B組每人各抽取靜脈血2～3 mL，離心分離血清置-80 ℃保存。

1.2.2檢測(cè)方法采用廣州瑞博奧生物科技有限公司的蛋白芯片產(chǎn)品，應(yīng)用蛋白抗體芯片定量技術(shù)檢測(cè)血清標(biāo)本中B淋巴細(xì)胞刺激趨化因子1(BLC)、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子(Eotaxin)-1、Eotaxin-2、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、C-C類趨化因子1(I-309)、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)、干擾素γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素(IL)-1α、IL-1β、IL-1 ra(IL-1 F3)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-7、IL-8(CXCL8)、IL-10、IL-11、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17A、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子1(M-CSF)、C-X-C類趨化因子9(MIG，CXCL9)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-α、MIP-1β、MIP-1 delta(CCL15)、血小板源生長(zhǎng)因子B亞基(PDGF-BB)、C-C類趨化因子5(RANTES，CCL5)、金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1、TIMP-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α、TNF-β、腫瘤壞死因子受體(TNF R)Ⅰ、TNF RⅡ等40種炎性細(xì)胞因子的水平，各因子在芯片上的位置排列見圖1。

圖1　Human Inflammation Array C3 (QAH-INF-3)檢測(cè)靶因子位置排列

2　結(jié)　果

2.1量表評(píng)分結(jié)果A組中有10例伴有不同程度的精神發(fā)育遲緩，其中3例同時(shí)伴發(fā)注意力缺陷多動(dòng)障礙(ADHD)。按ABC量表及CARS量表評(píng)估將A組病例分為A1組13例，ABC量表評(píng)分為(49.8±11.7)分，CARS量表評(píng)分為(29.2±2.3)分；A2組7例，ABC量表評(píng)分為(83.3±14.2)分，CARS量表評(píng)分為(43.6±5.2)分。

2.2炎性因子測(cè)定結(jié)果A組與B組標(biāo)本血清用QAH-INF-3芯片測(cè)定的圖譜分別如圖2與圖3，檢測(cè)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果見表1。其中A組的GM-CSF、IL-4、IL-5、IL-10、IL-11、IL-13、IL-17A、MIG等細(xì)胞因子水平較B組呈升高趨勢(shì)，MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TIMP-1、TIMP-2、TNF RⅡ等細(xì)胞因子水平較B組有所下降，而BLC、Eotaxin、G-CSF、I-309、ICAM-1、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-15、IL-16、MCP-1、MCSF、MIP-1d、TNF等細(xì)胞因子水平A、B兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例組中A1組與A2組的各炎性因子水平之間經(jīng)t檢驗(yàn)分析差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1　A、B兩組標(biāo)本有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的炎性因子濃度及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

續(xù)表1　A、B兩組標(biāo)本有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的炎性因子濃度及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

圖2　ASD疾病QAH-INF-3芯片測(cè)定的圖譜

圖3　健康對(duì)照兒童QAH-INF-3芯片測(cè)定的圖譜

2.3炎性因子與量表評(píng)分的相關(guān)性將A組中40種炎性因子的濃度分別與ABC量表、CARS量表的評(píng)分作Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，僅BLC、I-309、IL-12p40、RANTES和TIMP-2與ABC量表的評(píng)分有相關(guān)性，Pearson相關(guān)系數(shù)分別為-0.532、-0.558、-0.629、-0.625和-0.558(P<0.05)。

3　討　論

ASD是一組廣泛而嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙性疾病，迄今為止病因?qū)W機(jī)制仍不明確，可能受環(huán)境、遺傳等多重因素影響，目前從神經(jīng)免疫學(xué)角度認(rèn)識(shí)并探討ASD是其研究的新切入點(diǎn)[4]。細(xì)胞因子主要參與免疫活性的調(diào)解，也參與正常神經(jīng)發(fā)育和功能，其異常活動(dòng)可對(duì)多種神經(jīng)產(chǎn)生影響。雖然ASD屬神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙性疾病，所表現(xiàn)的內(nèi)表型與腦組織的功能密切相關(guān)，但因倫理學(xué)問(wèn)題取腦組織或腦脊液標(biāo)本分析其病理變化比較困難。英國(guó)的Taurines等[5]通過(guò)對(duì)伴/不伴ADHD的ASD患者血清中蛋白質(zhì)的性能分析和蛋白質(zhì)組學(xué)分析后認(rèn)為，外周血中變化的蛋白質(zhì)水平也可以為這類精神疾病尋找有用的生物標(biāo)志物。

國(guó)外有許多關(guān)于ASD細(xì)胞因子失衡的報(bào)道，部分因子與該病的嚴(yán)重程度有關(guān)[6]。本研究中ASD病情輕重程度與炎性因子水平之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于樣本量太少所致統(tǒng)計(jì)效力不足。目前，國(guó)內(nèi)也有對(duì)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)[7]、白細(xì)胞介素[8]等與ASD關(guān)系的研究，但未見有干擾素、單核細(xì)胞趨化蛋白、抗體、腫瘤壞死因子等其他炎性細(xì)胞因子與ASD相關(guān)性研究的報(bào)道。

美國(guó)Zerbo等[9]對(duì)84例ASD患兒、49例發(fā)育遲緩(DD)的非ASD兒童、159例健康兒的研究發(fā)現(xiàn)：在絕大多數(shù)新生兒標(biāo)本中沒(méi)有檢測(cè)到細(xì)胞因子，但與健康兒相比，ASD患兒MCP-1升高，而RANTES降低，并認(rèn)為，在生命的最初幾天測(cè)量免疫系統(tǒng)功能可能幫助早期識(shí)別神經(jīng)發(fā)育異常，揭示正常的神經(jīng)發(fā)育的生物機(jī)制。本研究中A、B兩組MCP-1水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但RANTES的檢測(cè)結(jié)果與該研究是一致的(P<0.05)，且A組MIP、TIMP水平均低于B組(P<0.01)。RANTES、MIP具有趨化中性粒細(xì)胞到炎癥組織的功能，是機(jī)體防御和清除入侵病原體等異物先天性免疫功能的一個(gè)重要方面，其低表達(dá)水平意味著機(jī)體對(duì)異物清除能力減弱，從而造成有關(guān)組織炎性損傷加重。尹蘋等[10]在其博士學(xué)位論文研究中也闡述，新生兒期炎癥刺激可能通過(guò)長(zhǎng)期啟動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞而將影響到其海馬依賴性行為損傷。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)的主要免疫細(xì)胞，而海馬是學(xué)習(xí)、記憶等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的重要部位，ASD患兒體內(nèi)多種炎性細(xì)胞因子異常表達(dá)，可能導(dǎo)致腦組織長(zhǎng)期處在炎癥刺激下，從而加重神經(jīng)損傷，進(jìn)而出現(xiàn)功能障礙。

Tonhajzerova等[11]在對(duì)ASD與炎性細(xì)胞因子的研究中檢測(cè)出患兒靜脈血漿中的IL-8水平比對(duì)照組顯著增加，且TNF-α、IL-1β等其他炎性細(xì)胞因子也存在改變。本研究中A組的IL-4、5、10、11、13、17A等多項(xiàng)白細(xì)胞介素因子也均有升高，尤其IL-17A結(jié)果較B組高出近一倍，提示ASD患兒免疫系統(tǒng)處于應(yīng)激狀態(tài)。由于IL-17A可以誘導(dǎo)很多炎性因子的表達(dá)，過(guò)高的IL-17A水平對(duì)于疾病的病理發(fā)展起到惡化作用。Tostes等[12]的研究結(jié)果表明，ASD患兒的血管活性腸肽(VIP)、IFN-γ和一氧化氮(NO)水平顯著升高，而神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)水平明顯低于對(duì)照組，在ASD患兒中NO與IFN-γ呈正相關(guān)。本研究中A組IFN-γ結(jié)果比B組有升高，但經(jīng)t檢驗(yàn)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與研究病例太少有關(guān)。

ASD的行為、認(rèn)知等內(nèi)表型及其伴隨癥狀與炎性因子是否具有相關(guān)性，年齡、性別與炎性因子的表達(dá)是否有關(guān)，都有待加大樣本量做進(jìn)一步的分析。總而言之，本研究中病例組的樣本量雖少，但檢測(cè)結(jié)果與其他學(xué)者的研究結(jié)果多能獲得一致，這為ASD患兒的早期診斷、早期干預(yù)提供了一個(gè)新的思路，為進(jìn)一步探索ASD的發(fā)病機(jī)制從神經(jīng)免疫學(xué)角度打開了一條新的途徑。

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Study on correlation between serum inflammatory cytokine with autism spectrum disorder

XIAO Gefei,ZHOU Xiang,ZHOU Yuqiu,ZHUANG Zhicheng,ZHAO Yanling,HU Lingling

(ZhuhaiMunicipalMaternityandChildHealthcareHospital，Zhuhai,Guangdong519001,China)

ObjectiveTo study the correlation between the inflammatory cytokines and autism spectrum disorder(ASD),and to search new serum markers for diagnosis and treatment of this disease.MethodsForty inflammatory cytokines such as interferon-γ,interleukins (IL),macrophage inflammatory protein in 20 cases of ASD and 20 healthy children as the healthy control group were detected by adopting the protein chip technology.ResultsThe granular-macrophage colony stimulating factor and expression levels of GM-CSF,IL-4,IL-5,IL-10,IL-11,IL-13,IL-17A and MIG in the ASD group were significant higher than those in the normal control group(P<0.05).while MIP-1α,MIP-1β,PDGF-BB,RATES,TIMP-1,TIMP-2 and TNF RII in the ASD group were significantly lower than those in the normal control group (P<0.05).ConclusionSerum inflammatory cytokines such as macrophage inflammatory protein,IL-11,and INF-r in the ASD children show significant increase or decrease,suggesting that the pathogenesis of ASD is associated with the immune system by inflammatory stimuli.

autism spectrum disorder;inflammation;cytokines

2016-03-29修回日期：2016-05-18)

肖鴿飛，女，副主任技師，主要研究方向?yàn)閮和睦硇袨榧膊〉倪z傳學(xué)診斷。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.031

A

1673-4130(2016)15-2131-04

·論著·