關(guān)小珊，關(guān)銳梨，鐘華敏，鄧秋連，謝永強(qiáng)，周珍文

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒童院區(qū)檢驗(yàn)科　510120)

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·論著·

嗜麥芽窄食單胞菌產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶基因APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ的克隆與表達(dá)

關(guān)小珊，關(guān)銳梨，鐘華敏，鄧秋連，謝永強(qiáng)，周珍文△

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒童院區(qū)檢驗(yàn)科510120)

目的對嗜麥芽窄食單胞菌臨床分離株gzch810(SM gzch810)攜帶的產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶基因APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ進(jìn)行擴(kuò)增、測序及原核表達(dá)，為下一步功能試驗(yàn)的開展提供基礎(chǔ)材料。方法提取SM gzch810基因組染色體，PCR擴(kuò)增APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ全基因并克隆入pMD18-T載體進(jìn)行核苷酸序列分析；將APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ基因克隆至表達(dá)載體pGEX-4T-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，SDS-PAGE分析融合蛋白表達(dá)情況。結(jié)果以染色體DNA為模板，成功擴(kuò)增800 bp APH(3′′)-Ⅰ基因和550 bp AAC(2′)-Ⅰ基因；序列比對分析顯示其與相關(guān)報(bào)道序列核苷酸和氨基酸一致性分別達(dá)91%及95%；SM gzch810 APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ序列已登錄GenBank(登錄號：HQ315852和HQ315853)；SDS-PAGE顯示，融合基因表達(dá)的蛋白相對分子質(zhì)量分別約為56×103和46×103。結(jié)論從SM gzch810中成功克隆及表達(dá)了APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ基因，為下一步檢測上述兩種重組體大腸桿菌對相應(yīng)抗菌藥物的耐藥性及其功能評價做好準(zhǔn)備。

嗜麥芽窄食單胞菌；產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶基因；克??；原核表達(dá)

嗜麥芽窄食單胞菌(SM)為醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的重要病原菌之一，中國CHINET監(jiān)測網(wǎng)2013年度耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，該菌占所有革蘭陰性菌的3.96%，非發(fā)酵菌的10.82%[1]；國外文獻(xiàn)報(bào)道，SM引起肺部感染的歸因死亡率高達(dá)20%～30%[2]。SM耐藥機(jī)制復(fù)雜，對大多數(shù)抗菌藥物耐藥，是臨床抗感染治療中的一道難題，其中對β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制已有較多研究，但對氨基糖苷類藥物的耐藥研究則較少。本文從臨床兒童先天性心臟病患者血液分離菌株gzch810中PCR擴(kuò)增出APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ基因并將其在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，為下一步檢測上述兩種重組體大腸桿菌對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性及其功能評價做好準(zhǔn)備。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1SM gzch810分離株來源于2012年5月分離自本院CICU心臟病患者血液，患兒男性，日齡8 d。

1.1.2試劑與儀器pGEX-4T-1質(zhì)粒載體購自法國馬西亞公司；pMD18-T質(zhì)粒載體，Ex-Taq DNA聚合酶，EcoRⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶等購自Takara公司。IPTG、丙烯酰胺、Tris堿、甘氨酸等購自鼎國公司。德國Biometra公司PCR儀，英國Uvitec公司GAS7508-T20紫外凝膠成像分析系統(tǒng)，德國 Sorvall公司Micro 17R臺式高速冷凍離心機(jī)。

1.2方法

1.2.1染色體DNA的提取及擴(kuò)增根據(jù)GenBank提供的Smlt2336(YP001972129.1)和Smlt1669(YP001971501.1)序列，設(shè)計(jì)特異性引物兩對：APH(3′′)-Ⅰ P1：5′-CGC GAA TTC ATG AGC GAA CCC TAC CTG AG-3′，APH(3′′)-Ⅰ P2：5′-AAA CTC GAG TCA CTT CTC CGC CAG CGC CT-3′；AAC(2′)-Ⅰ P1：5′-CGC GAA TTC ATG GGC CTG GAC ACA CAT TCA-3′，AAC(2′)-Ⅰ P2：5′-AAA CTC GAG TCA GAC CGT TTC GCC CTG CA-3′，引物序列分別加入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以試劑盒提取的染色體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃ 5 min后,94 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 1.5 min，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸15 min。

1.2.2pMD18-T-APH(3′′)-Ⅰ/AAC(2′)-Ⅰ的構(gòu)建及序列分析PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T載體16 ℃連接2 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑取經(jīng)氨芐西林篩選的陽性菌落提取質(zhì)粒并經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定；將鑒定含目的基因的質(zhì)粒菌送Invitrogen公司進(jìn)行測序并將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對分析。

1.2.3pGEX-4T-1-APH(3′′)-Ⅰ/AAC(2′)-Ⅰ的構(gòu)建及表達(dá)純化PCR產(chǎn)物與pGEX-4T-1載體經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后連接過夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21；挑取經(jīng)氨芐篩選的陽性菌落提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定。將含有重組質(zhì)粒的BL21接種于含氨芐西林(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜后挑單菌落于含氨芐西林LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.4左右，加 IPTG至終濃度0.5 mmol/L，30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h，8 000 r/min 4 ℃離心15 min，收集菌體，SDS-PAGE電泳鑒定。

2　結(jié)　果

2.1pMD18-T-APH(3′′)-Ⅰ/AAC(2′)-Ⅰ重組質(zhì)粒的測序結(jié)果測序結(jié)果顯示，SM gzch810 APH(3′′)-Ⅰ基因全長813 bp；預(yù)測的相對分子質(zhì)量為30 113.43，等電點(diǎn)為5.85。其序列已登錄GenBank,登錄號為HQ315852，與SM K279a株氨基酸同源性達(dá)91%(圖1)。SM gzch810 AAC(2′)-Ⅰ基因全長549 bp；預(yù)測的相對分子質(zhì)量為2 0183.02，等電點(diǎn)為5.96。其序列已登錄GenBank,登錄號為HQ315853，與SM K279a株氨基酸同源性達(dá)95%(圖2)。

圖1　SM gzch810 APH(3′′)-Ⅰ與SM K279a株氨基酸同源性比較

2.2SDS-PAGE檢測Smqnr蛋白的表達(dá)重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可見GST和APH(3′′)-Ⅰ、AAC(2′)-Ⅰ的融合蛋白表達(dá)帶，相對分子質(zhì)量分別約為56×103和46×103，含空質(zhì)粒菌經(jīng)誘導(dǎo)后則在26×103位置上出現(xiàn)GST表達(dá)帶(圖3、4)。

圖2　SM gzch810 AAC(2′)-Ⅰ與SM K279a株氨基酸同源性比較

注：Lane1為預(yù)染蛋白marker；lane2為pGEX-4T-1-APH(3′′)-Ⅰ/BL21經(jīng)誘導(dǎo)；Lane3為pGEX-4T-1/BL21經(jīng)誘導(dǎo)。

圖3重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳結(jié)果

注：Lane1為預(yù)染蛋白 marker；lane2為pGEX-4T-1-AAC(2′)-Ⅰ/BL21 經(jīng)誘導(dǎo)；Lane3為pGEX-4T-1/BL21經(jīng)誘導(dǎo)。

圖4重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳結(jié)果

3　討　論

SM是醫(yī)院內(nèi)感染的重要致病菌之一，對氨基糖苷類藥物的耐藥機(jī)制主要有：(1)膜屏障的改變或主動外排作用使藥物的吸收減少；(2)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的改變；(3)氨基糖苷類修飾酶(AMEs)對藥物的修飾鈍化作用，其中以AMEs的作用為主要原因。常見的AMEs 按功能可分為磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)、乙酰轉(zhuǎn)移酶(AAC) 和核苷轉(zhuǎn)移酶(ANT) 3類，已在美國NCBI登錄的AMEs基因有30余種[3]，目前在臨床分離革蘭陰性桿菌中，最常見的有AAC(3)-Ⅰ、AAC(3)-Ⅱ、AAC(6′)-Ⅰb、AAC(6′)-Ⅱ、ANT(2′′)-Ⅰ、ANT(3′′)-Ⅰ[4-5]共6種，但在SM中除AAC(6′)-Ⅰz[6]、APH(3′)-Ⅱc[7]外，僅有少量檢出ANT(2′′)-Ⅰ、AAC(6′)-Ⅱ 和AAC(3) -Ⅰ/Ⅱ[8-9]的報(bào)道。此類酶作用于氨基糖苷類抗菌藥物特定的氨基或羥基，使抗菌藥物發(fā)生鈍化，降低或喪失對靶位核糖體的親和力而不能進(jìn)入下一階段發(fā)揮抗菌作用。由AMEs所致的耐藥性在不同的微生物或不同菌株之間有很大差異，取決于酶產(chǎn)生的數(shù)量、酶的催化活性和作用于何種抗菌藥物等因素；在眾多能產(chǎn)生足夠活性而使細(xì)菌達(dá)到耐藥標(biāo)準(zhǔn)的AMEs中，APHs能造成高水平耐藥[10]。

APH是一種利用ATP作為第二底物，且能磷酸化所有氨基糖苷類抗菌藥物的羥基酶。目前,臨床上分離到的APH有7種，其中APH(3′′)-Ⅰ的作用底物只有鏈霉素，修飾其3′′位羥基。本次實(shí)驗(yàn)檢出的APH(3′′)-Ⅰ基因經(jīng)核苷酸及氨基酸序列分析，與GenBank上登記注冊的Smlt 2336、Smlt 1923氨基酸同源性分別達(dá)到91%和89%，是國內(nèi)首次從臨床分離SM中檢出APH(3′′)-Ⅰ基因，該基因序列已登錄GenBank，登錄號為HQ315852。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在IPTG的誘導(dǎo)下，重組表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)出了相對分子質(zhì)量約56×103的融合蛋白，與核苷酸序列推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子量大小相符。

AAC 有4 種同工酶:AAC(1)、AAC(3)、AAC(2′)和AAC(6′)，主要以乙酰輔酶A作為乙?；墓w,分別作用于氨基糖苷類抗菌藥物的2-脫氧鏈霉胺環(huán)的1位和3 位、6-氨基己糖環(huán)的2′位和6′位。AAC(6′)和AAC(3)多數(shù)由轉(zhuǎn)座子、整合子和質(zhì)粒等可移動遺傳元件介導(dǎo)，在抗菌藥物的選擇壓力下能在微生物間迅速播散[11-12]，而目前所發(fā)現(xiàn)的AAC(2′)則均由染色體編碼。本次實(shí)驗(yàn)檢出的AAC(2′)-Ⅰ基因經(jīng)測序及同源性分析，與GenBank上登記注冊的Smlt 1669氨基酸同源性達(dá)95%，與從結(jié)核分枝桿菌中檢出的AAC(2′)-Ⅰc 同源性僅30%，推測其具種屬特異性，不同菌屬間不能傳播。

本實(shí)驗(yàn)從臨床分離株 gzch810 中經(jīng)PCR檢出兩種AMEs基因APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ，并對其進(jìn)行了克隆及表達(dá)，為下一步檢測上述兩種重組體大腸桿菌對相應(yīng)抗菌藥物的耐藥性及其功能評價做好準(zhǔn)備。

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Clone and expression of APH(3′′)-Ⅰand AAC(2′)-Ⅰ gene of Stenotrophomonas maltophilia

GUAN Xiaoshan,GUAN Ruili，ZHONG Huamin,DENG Qiulian,XIE Yongqiang,ZHOU Zhenwen△

(GuangzhouMunicipalWomenandChildren′sMedicalCenter,Guangzhou,Guangdong510120,China)

ObjectiveTo perform the amplification,sequencing and prokaryotic expression of APH(3′′)-Ⅰand AAC(2′)-Ⅰ genes from the clinically isolated gzch810 strain(SM gzch810)of Stenotrophomonas maltophilia to provide the basic materials for the next step functional test.MethodsThe SM gzch810 genome chromosome was extracted,the APH(3′′)-Ⅰ,AAC(2′)-Ⅰ whole genes were amplified by PCR and sequenced after being cloned into pMD18-T vector.The recombination were subcloned into pGEX-4T-1 vector and the expression of the recombinant APH(3′′)-Ⅰand AAC(2′)-Ⅰ were analyzed by SDS-PAGE.ResultsThe 800bp and 550bp DNA fragments of APH(3′′)-Ⅰ,AAC(2′)-Ⅰ gene were amplified from SM gzch810 by PCR and sequenced;the sequence comparison analysis showed that DNA and amino acid sequence identities of APH(3′′)-Ⅰand AAC(2′)-Ⅰ genes with other strains were 91% and 95% respectively.The sequence of APH(3′′)-Ⅰand AAC(2′)-Ⅰ of SM gzch810 were submitted to GenBank(accession number：HQ315852 and HQ315853);two major protein bands corresponding to the expected recombinant GST-TP fusion proteins (56×103and 46×103respectively) were identified by SDS-PAGE.ConclusionAPH(3′′)-Ⅰand AAC(2′)-Ⅰgene of SM gzch810 are successfully cloned and expressed,which lays a good foundation for further detecting corresponding antibiotic resistance and functional evaluation of above two kinds of recombinant E.coli.

Stenotrophomonas maltophilia;AMEs;clone;prokaryotic expression

2016-01-18修回日期：2016-05-05)

關(guān)小珊，女，主管技師，主要從事臨床微生物檢驗(yàn)工作?！?/p>

，E-mail：zhouzhenwen28@126.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.018

A

1673-4130(2016)15-2099-03