蔡文臣，郝小惠，沈陽麗，孟晨雪，田潔，郭志義

(華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心，河北唐山063000)

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SNP位點(diǎn)rs6983267相關(guān)非編碼RNA G/U對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性的影響

蔡文臣，郝小惠，沈陽麗，孟晨雪，田潔，郭志義

(華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心，河北唐山063000)

目的 探討染色體8q24區(qū)域中單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn) rs6983267相關(guān)非編碼RNA G/U對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性的影響。方法 運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析SNP rs6983267位點(diǎn)的非編碼RNA；收集KM12C和KM12SM細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，片段回收后用Tsp45Ⅰ進(jìn)行酶切，對(duì)酶切(酶切組)和不做酶切(對(duì)照組)的模板做PCR擴(kuò)增分析。通過限制性內(nèi)切酶-PCR方法檢測兩組SNP rs6983267位點(diǎn)的非編碼RNA G/U相對(duì)表達(dá)量；KM12C和KM12SM細(xì)胞分別進(jìn)行pGL3-Gs-LUC(pGL3-Gs-LUC組)、pGL3-Ts-LUC(pGL3-Ts-LUC組)和pGL3-Basic-LUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因方法檢測兩組KM12C和KM12SM細(xì)胞中rs6983267非編碼RNA啟動(dòng)子活性。結(jié)果 ENCODE數(shù)據(jù)庫顯示，染色體8q24區(qū)域SNP rs6983267位點(diǎn)附近存在非編碼基因。KM12C細(xì)胞中酶切組、對(duì)照組SNP rs6983267位點(diǎn)相關(guān)非編碼RNA G/U為0.80±0.10、5.60±1.30，KM12SM細(xì)胞中分別為0.71±0.09、1.43±0.11。與對(duì)照組比較，KM12C細(xì)胞中酶切組SNP rs6983267位點(diǎn)相關(guān)非編碼RNA G/U差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05),KM12SM細(xì)胞中升高(P<0.05)。KM12C細(xì)胞中，pGL3-Gs-LUC組、pGL3-Ts-LUC組rs6983267位點(diǎn)相關(guān)G型與T型非編碼RNA啟動(dòng)子相對(duì)活性分別為0.81±0.14、0.82±0.25，KM12SM細(xì)胞中分別為1.00±0.26、1.85±0.58。在KM12SM細(xì)胞中，兩組比較，P<0.05；在KM12C細(xì)胞中，兩組比較，P﹥0.05。結(jié)論 SNP rs6983267位點(diǎn)相關(guān)非編碼RNA G/U可能與結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移活性相關(guān)。

結(jié)腸腫瘤；腫瘤轉(zhuǎn)移；單核苷酸多態(tài)性；rs6983267；非編碼基因

結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在所有惡性腫瘤中占第3位[1]。近年，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率也在不斷升高，目前已高達(dá)31/10萬。全基因組關(guān)聯(lián)分析研究表明，位于8q24染色體上的SNP 位點(diǎn)rs6983267與結(jié)腸癌的發(fā)生高度相關(guān)[2]。染色體8q24區(qū)為基因沙漠區(qū)，大范圍缺少蛋白質(zhì)編碼基因。有研究報(bào)道，SNP rs6983267可以作為增強(qiáng)子[3～5]，也可以作為非編碼基因發(fā)揮作用，如CCAT2。長鏈非編碼RNA (LncRNA)一般指轉(zhuǎn)錄長度大于200 nt的非編碼RNA[6,7]。大量研究表明，LncRNA參與了許多真核細(xì)胞內(nèi)生物活動(dòng),其異常表達(dá)還與許多人類疾病如腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。2013年5月～2015年12月，我們探討了8q24 染色體上的SNP位點(diǎn)rs6983267的LncRNA基因表達(dá)與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞系KM12C和KM12SM由本實(shí)驗(yàn)室保存；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自Promega公司；T載體試劑盒由天根生化科技有限公司提供；引物由北京博邁德生物技術(shù)有限公司合成；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑為Invitrogen的Lipofectamine?2000；設(shè)計(jì)的非編碼基因序列的檢測以及啟動(dòng)子擴(kuò)增引物，上游引物：5′ATACCCTCATCGTCCTTTGAGC3′,下游引物：5′GGGTTCCTGCCCTTTGATT3′。

1.2 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒構(gòu)建 用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增長度為153 bp的非編碼基因啟動(dòng)子片段、T載體克隆，通過sacⅠ和NcoⅠ雙酶切后與pGL3-Basic連接，然后酶切鑒定陽性克隆，測序確認(rèn)。分別命名為pGL3-Ts-LUC及pGL3-Gs-LUC。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 KM12C和KM12SM兩種細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃含 5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染依照說明書進(jìn)行，待細(xì)胞長滿進(jìn)行轉(zhuǎn)染前鋪板，轉(zhuǎn)染前1 h將完全培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，然后將質(zhì)粒pGL3-Ts-LUC、pGL3-Gs-LUC和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?2000分別進(jìn)行稀釋，將稀釋后的兩種溶液混合，15 min后將混合液轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，24 h后換成完全培養(yǎng)基。

1.4 染色體8q24區(qū)的非編碼基因分析 采用生物信息方法通過ENCODE數(shù)據(jù)庫(http://genome.ucsc.edu/ENCODE/)比對(duì)(BLAT)分析。

1.5 KM12細(xì)胞系中SNP rs6983267位點(diǎn)相關(guān)非編碼RNA G/U相對(duì)表達(dá)的檢測 采用限制性內(nèi)切酶-PCR法。利用rs6983267位點(diǎn)具有Tsp45Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)來區(qū)分G/T差別(即為T時(shí)，具有Tsp45Ⅰ位點(diǎn)，為G時(shí)候，位點(diǎn)消失)：首先收集KM12C和KM12SM細(xì)胞，通過TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，然后通過RQ-DNAse消化去除基因組DNA污染，隨機(jī)引物法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，片段回收，之后用Tsp45Ⅰ進(jìn)行酶切，用上述引物對(duì)酶切(酶切組)和不做酶切(對(duì)照組)的模板做PCR擴(kuò)增分析。

1.6 KM12細(xì)胞系中rs6983267非編碼RNA啟動(dòng)子活性的檢測 采用雙熒光素酶報(bào)告基因法。對(duì)KM12C和KM12SM細(xì)胞分別進(jìn)行pGL3-Gs-LUC(pGL3-Gs-LUC組)、pGL3-Ts-LUC(pGL3-Ts-LUC組)和pGL3-Basic-LUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，24 h后除去培養(yǎng)細(xì)胞中的培養(yǎng)基，用 1×PBS 清洗培養(yǎng)細(xì)胞后裂解細(xì)胞，室溫15 min后，收集細(xì)胞裂解液，將其轉(zhuǎn)入96孔檢測板中，置于微孔板儀檢測，讀取數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 染色體8q24區(qū)的非編碼基因 通過ENCODE數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)染色體8q24rs6983267位點(diǎn)上存在多個(gè)非編碼RNA表達(dá)(GM78細(xì)胞)。

2.2 不同細(xì)胞中兩組SNPrs6983267位點(diǎn)相關(guān)非編碼RNAG/U相對(duì)表達(dá)比較KM12SM細(xì)胞中酶切組、對(duì)照組SNPrs6983267位點(diǎn)相關(guān)非編碼RNAG/U分別為0.71±0.09、1.43±0.11，KM12C細(xì)胞中分別為0.80±0.1、5.60±1.30。與對(duì)照組比較，KM12C細(xì)胞中SNPrs6983267位點(diǎn)相關(guān)非編碼RNAG/U差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，KM12SM細(xì)胞中升高(P<0.05)。

2.3KM12細(xì)胞系中rs6983267非編碼RNA啟動(dòng)子活性KM12C細(xì)胞中，pGL3-Gs-LUC組、pGL3-Ts-LUC組rs6983267位點(diǎn)相關(guān)G型與T型非編碼RNA啟動(dòng)子相對(duì)活性分別為0.81±0.14、0.82±0.25，KM12SM細(xì)胞中分別為1.00±0.26、1.85±0.58。在KM12SM細(xì)胞中，兩組比較，P<0.05；在KM12C細(xì)胞中，兩組比較，P﹥0.05。

3 討論

現(xiàn)代分子生物學(xué)研究表明，人類基因組的大部分并不編碼蛋白質(zhì)，這些被稱為非編碼基因。以往的觀點(diǎn)認(rèn)為，這些序列無用并稱為垃圾DNA。越來越多的研究表明，非編碼基因在生物發(fā)育以及疾病發(fā)生過程中起著重要作用[7,8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在基因沙漠區(qū)的染色體8q24區(qū)域中SNPrs6983267位點(diǎn)附近存在非編碼基因，其等位基因轉(zhuǎn)錄的非編碼RNAG/U比率與結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移活性相關(guān)。

研究報(bào)道，SNPrs6983267不同的基因型與腫瘤發(fā)生相關(guān)。如在甲狀腺癌的研究中，G被認(rèn)為是隱性危險(xiǎn)因子(即GG基因型與疾病相關(guān)，GT或TT不相關(guān))[9]；在我國胃癌人群的研究中發(fā)現(xiàn)GT雜合型是危險(xiǎn)因子[10]?？梢?，不同基因型可能在腫瘤發(fā)生過程中起著不同作用。在結(jié)腸癌的研究中，通常認(rèn)為G為危險(xiǎn)因子，但是在糖尿病結(jié)合結(jié)腸癌病例對(duì)照研究以及無蒂鋸齒狀結(jié)腸癌的研究中，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的發(fā)生與基因型TT相關(guān)[11]。染色體8q24為基因沙漠區(qū)，缺少蛋白質(zhì)編碼基因。有研究報(bào)道，此區(qū)域有一非編碼基因CCAT2的表達(dá)[12]，上游也有miRNA的報(bào)道[12,13]。本研究的結(jié)果以及ENCODE數(shù)據(jù)庫(GM78細(xì)胞)也顯示此區(qū)域有非編碼RNA的表達(dá)。在本研究中，高轉(zhuǎn)移活性的KM12SM細(xì)胞的SNPrs6983267G/U比率高于低轉(zhuǎn)移活性的KM12C細(xì)胞，可能在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性的獲得過程中，存在某種基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的改變。研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑效應(yīng)因子RBPJ缺失會(huì)促進(jìn)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移[14]；Rho因子可能與Trio磷酸化相關(guān)，并可作為術(shù)后預(yù)后的重要指標(biāo)[15]。近年，無蒂鋸齒狀結(jié)腸癌的研究得到關(guān)注，其惡性程度更高、預(yù)后差，與普通結(jié)腸癌不同，rs6983267位點(diǎn)的TT基因型與腫瘤相關(guān)[11]。KM12系列細(xì)胞是常用的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性研究模型，建立時(shí)間早，當(dāng)時(shí)并沒有無蒂鋸齒狀結(jié)腸癌的分類，因此無法得知KM12系列細(xì)胞是否來自無蒂鋸齒狀結(jié)腸癌患者。

報(bào)告基因分析顯示，rs6983267位點(diǎn)存在轉(zhuǎn)錄活性，并具有RNA聚合酶Ⅲ的特點(diǎn)，這也與ENCODE數(shù)據(jù)庫一致。結(jié)果顯示，T型啟動(dòng)子的活性高于G型啟動(dòng)子活性，說明RNA的G/U差別來自轉(zhuǎn)錄水平的變化。轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控研究的樞紐,向上游可以分析信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，向下游可以分析基因的表達(dá)模式[16]。因此，有可能相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的改變影響了啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合及rs6983267的轉(zhuǎn)錄活性，從而造成其差異表達(dá)。

總之，本研究結(jié)果顯示，rs6983267位點(diǎn)的非編碼RNAG/U的表達(dá)比率可能與結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移活性相關(guān)。這也將有助于解釋全基因組關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果，同時(shí)也為其臨床應(yīng)用以及腫瘤的基礎(chǔ)研究提供可借鑒的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of SNP rs6983267-related non-coding RNA G/U on the metastatic activity of colon carcinoma cells

CAIWenchen,HAOXiaohui,SHENYangli,MENGChenxue,TIANJie,GUOZhiyi

(MedicalResearchCenterofNorthChinaofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To investigate the effect of SNP rs6983267 in the 8q24 region on chromosome-related non-coding RNA G/U on the metastatic activity of colon carcinoma cells.Methods We analyzed the non-coding RNA of SNP rs6983267 by bioinformatics. The KM12C and KM12SM cells were collected, and the total RNA was extracted from the cells. Reverse transcription and PCR amplification were performed. After the fragments were recovered, they were digested with Tsp45Ⅰ, and then the digested (digestion group) and non-digested templates (control group) received PCR amplification analysis. The non-coding RNA G/U expression of SNP rs6983267 in the two groups was detected by restriction endonuclease-PCR. pGL3-Gs-LUC (pGL3-Gs-LUC group), pGL3-Ts-LUC (pGL3-Ts-LUC group) and pGL3-Basic-LUC were respectively transfected into KM12C and KM12SM cells. The non-coding RNAs of transcriptional activity in KM12C and KM12SM cells were detected by the dual luciferase reporter gene analysis.Results The ENCODE database showed that non-coding genes existed near the SNP rs6983267 locus in the 8q24 region on chromosome. In the KM12C cells, the non-coding RNA G/U ratios of the SNP rs6983267 in the digestion group and control group were 0.71±0.09 and 1.43±0.11, and the ratios were 0.80±0.10 and 5.60±1.30 in the KM12SM cells. Compared with the control group, the non-coding RNA G/U ratio decreased in the KM12C cells and increased in the KM12SM cells (allP<0.05). In KM12C cells, the relative expression activity of the G promoter and T promoter on the rs6983267 locus was 0.81±0.14 in the pGL3-Gs-LUC group, and 0.82±0.25 in the pGL3-Ts-LUC group, and in the KM12SM cells they were 1.00±0.26 and 1.85±0.58, respectively. In KM12SM cells, statistically significant difference was found between these two groups (P<0.05), while in the KM12C cells, no statistically significant difference was found (P>0.05).Conclusion The G/U ratio of SNP rs6983267-related non-coding RNA may be associated with colon cancer metastasis.

colonic neoplasms; neoplasm metastasis; single nucleotide polymorphism; rs6983267; non-coding gene

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31050010)；教育部留學(xué)回國人員科研啟動(dòng)基金(教外司留[2015]311號(hào))；河北省人社廳歸國留

學(xué)基金擇優(yōu)資助項(xiàng)目(C201400358)。

蔡文臣(1991-)，女，碩士研究生在讀，主要研究方向?yàn)槟[瘤分子生物學(xué)。E-mail：1534760498@qq.com

郭志義(1971-)，男，副教授，主要研究方向?yàn)槟[瘤分子生物學(xué)。E-mail：guozhiyiguo@yahoo.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.003

R735.35

A

1002-266X(2016)45-0009-03

2016-03-24)