王健，顧兵，季珊維，吳瑜，劉季，王騰

(1常熟市第五人民醫(yī)院，江蘇常熟215500；2江南大學附屬醫(yī)院)

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乳腺癌組織中cyclin D1及MCT-1水平與患者化療療效、臨床病理特征及預后的關系

王健1，顧兵1，季珊維1，吳瑜1，劉季1，王騰2

(1常熟市第五人民醫(yī)院，江蘇常熟215500；2江南大學附屬醫(yī)院)

目的 探討乳腺癌組織中細胞周期蛋白D1(cyclin D1)與單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1(MCT-1)與患者化療療效、臨床病理特征及預后的關系。方法 回顧性分析112例晚期乳腺癌患者的臨床資料，免疫組化法檢測腫瘤組織中cyclin D1與MCT-1的表達水平，探討二者與化療療效、臨床病理特征及預后的關系。結(jié)果 細胞核cyclin D1、細胞膜MCT-1低表達患者化療后有反應者所占比例高于二者同時高表達者(P<0.01)。細胞膜MCT-1表達與年齡有關(P=0.02)。二者同時高表達為影響化療后無進展生存期的獨立不良預后因素(P<0.05)。結(jié)論 乳腺癌組織中細胞核cyclin D1與細胞膜MCT-1同時高表達提示化療耐藥及進展風險高。

乳腺腫瘤；細胞周期蛋白D；單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1

乳腺癌是我國女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率分別居女性惡性腫瘤的第1位和第5位[1]?；熥鳛槿橄侔┑闹饕委熓侄?，療效一直不能令人滿意，主要的原因是腫瘤對化療藥物的耐受。其具體機制目前尚不完全明晰。Wnt/β-catenin通路被認為與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥有關，其異常激活伴有多個下游靶基因的表達上調(diào)，包括細胞周期蛋白D1(cyclin D1)等。最近有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌細胞內(nèi)活化的Wnt/β-catenin通路可上調(diào)糖酵解水平，包括上調(diào)單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1(MCT-1)的表達水平，后者被認為與腫瘤的耐藥有關。本研究擬檢測晚期乳腺癌組織中cyclin D1及MCT-1的表達，分析二者水平變化的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2005年1月～2010年12月在常熟市第五人民醫(yī)院及無錫市第四人民醫(yī)院就診的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者112例，均經(jīng)組織病理學檢查確診，符合中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范(2015版)[2]中的診斷標準。年齡(68.3±6.7)歲，≤65歲73例、>65歲39例；低、未分化37例，中、高分化75例；雌激素/孕激素受體(ER/PR)陽性79例，ER/PR陰性33例；人表皮生長因子受體2(HER2)陽性23例，陰性89例。患者均有可評價轉(zhuǎn)移病灶(CT掃描示直徑至少1 cm)。所有病例預期生存期超過6個月。

1.2 治療方法 在接受粗針穿刺活檢后予蒽環(huán)類和(或)紫杉類為基礎的聯(lián)合化療2個周期，化療方案包括EC(表阿霉素+環(huán)磷酰胺)、TE(多西他賽+表阿霉素)、FEC(5-氟尿嘧啶+表阿霉素+環(huán)磷酰胺)。根據(jù)RECIST標準，將化療療效分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)和進展(PD)。其中PD者接受二線化療，CR、PR及SD者接受原方案化療直至PD或者出現(xiàn)不可耐受不良反應。無進展生存期(PFS)定義為腫瘤診斷到CT確認腫瘤進展的時間間隔?；颊唠S訪2～12個月、中位隨訪6個月，其中化療有反應(CR+PR)50例、無反應(SD+PD)62例。

1.3 組織cyclin D1、MCT-1的檢測方法 選擇所有患者化療前的粗針穿刺石蠟標本，切取4 μm厚切片，依次通過二甲苯脫蠟及梯度乙醇水化，檸檬酸鈉修復抗原，3% H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，胎牛血清封閉后，兔抗人cyclin D1一抗(1∶50)及鼠抗人MCT-1一抗孵育過夜，二抗(1∶500)37 ℃孵育30 min，DAB染色。兔抗人cyclin D1一抗(ab40754)及鼠抗人MCT-1一抗(ab90582)購自美國ABCAM公司，羊抗兔二抗(A0208)及羊抗鼠二抗(A0216)購自碧云天公司。根據(jù)染色強度分為3個等級(+、++、+++)，+為低表達，++、+++為高表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。cyclin D1、MCT-1的表達水平與臨床病理因素之間的關系采用χ2檢驗，單因素分析評價各因素與預后的關系，有預后價值的因素納入Cox多因素回歸分析，評估其對PFS的獨立影響。Kaplan-Meier方法繪制PFS生存曲線，log-rank法檢驗曲線間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中cyclin D1及MCT-1的表達水平與化療療效的關系 112例乳腺癌患者的腫瘤組織中，細胞核內(nèi)cyclin D1呈高表達48例，細胞膜MCT-1高表達61例，其余為低表達(見表1)?；熀笥蟹磻?0例，其中有同時存在胞核內(nèi)cyclin D1及細胞膜MCT-1高表達者7例；化療后無反應者62例，其中同時存在細胞核內(nèi)cyclin D1及細胞膜MCT-1高表達者32例。在細胞核cyclin D1低表達和高表達的患者中，化療后有反應者分別為36、14例，而化療后無反應者分別為28、34例，兩者化療后有反應者所占比例比較，P<0.01。在細胞膜MCT-1低表達和高表達的患者中，化療后有反應者分別為33、17例，而化療后無反應者分別為18、44例。兩者化療后有反應者所占比例比較，P<0.01。

2.2 乳腺癌組織中細胞核cyclin D1、細胞膜MCT-1表達水平與臨床病理因素的關系 見表1。

表1 乳腺癌組織中細胞核cyclin D1、細胞膜MCT-1表達水平與臨床病理因素的關系(例)

2.3 腫瘤組織中細胞核cyclin D1及細胞膜MCT-1的表達與預后的關系 單因素分析顯示，PFS與年齡[HR(95%CI) 1.295(0.795～1.741)，P=0.368]、分化程度[HR(95%CI) 0.685(0.498～1.311),P=0.187]、HER2[HR(95%CI) 2.364 (0.798～3.015),P=0.466]、細胞核cyclin D1水平[HR(95%CI) 1.258(0.865～2.145),P=0.362]、細胞膜MCT-1水平[HR(95%CI) 1.663(0.736～3.254),P=0.215]無關，與ER/PR及cyclin D1、MCT-1共同高表達有關[HR(95%CI) 1.657 (1.187～2.354),P=0.019;HR(95%CI)0.652(0.368～0.849),P<0.01]。進一步Cox多因素分析顯示，二者的共同高表達是影響PFS的獨立不良預后因素[HR(95%CI) 0.598(0.457～0.921),P<0.05]。

3 討論

惡性腫瘤細胞常出現(xiàn)葡萄糖攝取大量增加，即使在有氧條件下，仍選擇糖酵解作為主要的ATP生產(chǎn)方式(Warburg效應)，被認為是腫瘤細胞的十大基本特征[3]，是近年腫瘤治療中的研究熱點。Warburg效應伴隨著細胞內(nèi)產(chǎn)生過多的乳酸，后者需要通過單羧基轉(zhuǎn)運體(主要是MCT-1)排出細胞。研究發(fā)現(xiàn)，抑制MCT-1可導致細胞內(nèi)乳酸堆積，進一步抑制糖酵解及葡萄糖攝入，并引起細胞死亡[4]。這些研究結(jié)果證實，抑制糖酵解能量代謝是富有前景的腫瘤治療手段。

腫瘤細胞耐藥的機制包括藥物外排、DNA損傷修復、生存相關基因表達上調(diào)、抗凋亡和存活信號通路激活等[5]，而這一系列生命活動均需要大量的持續(xù)的ATP供給[6]，后者主要來自糖酵解。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷糖酵解過程可提高耐藥細胞的化療敏感性[7]，而提高糖酵解水平可提高卵巢癌細胞對化療藥物的耐受[8]，Zhou等[7]研究發(fā)現(xiàn)，與藥物敏感的腸癌細胞相比，耐藥細胞存在更高水平的糖酵解，而在抑制糖酵解、ATP耗盡后，化療敏感性升高，而藥物敏感的腸癌細胞在外源ATP補給的情況下化療耐藥性升高。關于乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，抑制糖酵解可逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥以及放療耐受[9]

腫瘤細胞異常活躍的糖酵解是癌基因激活以及抑癌基因失活的結(jié)果[4,10]，涉及多個腫瘤相關信號通路的參與[11]。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin通路激活后，可通過上調(diào)Warburg效應的關鍵基因MCT-1[4]和GLUT-1[12]的表達而促進糖酵解。最近一項關于結(jié)直腸癌的研究[13]證實，Wnt/β-catenin通路激活后可直接上調(diào)Warburg效應另一關鍵基因PDK1的表達，這些研究結(jié)果證明了Wnt/β-catenin通路對糖酵解的關鍵促進作用。

Wnt/β-catenin通路被認為促進多種腫瘤的化療耐藥，其機制尚未完全闡明。關于乳腺癌中Wnt/β-catenin通路與糖酵解之間的關系，目前尚未見明確的研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中細胞核內(nèi)Wnt/β-catenin通路的cyclin D1水平及細胞膜MCT-1水平高表達與化療療效差有關，提示乳腺癌中可能存在Wnt/β-catenin通路對糖酵解的正向調(diào)控，而且對于Wnt/β-catenin通路所誘導的耐藥特性，糖酵解可能起著維持作用。另外，雖然單因素分析提示細胞核內(nèi)cyclin D1高水平與細胞膜MCT-1高水平均與PFS無關，但多因素分析顯示僅僅二者共同高表達才是化療失敗的獨立不良預后因素，其中可能的解釋除了腫瘤的異質(zhì)性，更可能是Wnt/β-catenin通路與糖酵解均分別涉及腫瘤的多個生物學特征，單個因素在不同水平及不同條件下的激活可能并未導致腫瘤細胞的耐藥，而二者的同時激活(細胞核cyclin D1與細胞膜MCT-1共同高水平表達)更有可能是耐藥的特征，這也驗證了Wnt/β-catenin通路對糖酵解的正向調(diào)控。

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常熟市衛(wèi)生局科技計劃項目(csws201217)。

王騰(E-mail:drwangteng@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.022

R737.9

B

1002-266X(2016)45-0067-03

2016-08-17)