王冬梅　董　軻　徐文瑾　 張金魁　黃國(guó)英　安月玲　劉　峰

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五羥色胺對(duì)糖尿病大鼠臟器保護(hù)作用研究

王冬梅董軻徐文瑾 張金魁黃國(guó)英安月玲劉峰

青海清華博眾生物技術(shù)有限公司(西寧 810016)

摘要：目的研究沙棘提取物中五羥色胺對(duì)糖尿病大鼠的臟器保護(hù)作用。方法高糖高脂飲食聯(lián)合STZ造模糖尿病大鼠模型，隨機(jī)分為單用安慰劑組、單用五羥色胺組、沙棘提取物提取五羥色胺組,觀察糖尿病大鼠一般狀況、血糖血脂變化情況。結(jié)果模型組在分別給予沙棘提取物提取五羥色胺、單用五羥色胺后，與安慰劑組相比，2組指標(biāo)變化情況趨勢(shì)一致，如下。血糖下降(P<0.01)，血脂下降(P<0.01)，下丘腦五羥色胺含量上升(P<0.01)，外周血五羥色胺含量下降(P<0.01)，其中沙棘提取物提取五羥色胺組和單用五羥色胺組差別不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論沙棘提取物中五羥色胺具有通過(guò)降低糖尿病大鼠血糖血脂水平從而保護(hù)糖尿病大鼠臟器的作用。

關(guān)鍵詞：沙棘；沙棘提取物，五羥色胺，糖尿病

大量文獻(xiàn)研究顯示：沙棘提取物在降糖、降血脂、提高免疫力方面療效顯著[1～9]。五羥色胺提取困難，植物來(lái)源極為罕見(jiàn)，沙棘提取物中發(fā)現(xiàn)的五羥色胺為我們提供了新的研究思路[10]，本課題主要通過(guò)外源補(bǔ)充植物源性五羥色胺觀察五羥色胺對(duì)糖尿病大鼠血糖血脂的影響，探討植物源性五羥色胺對(duì)糖尿病大鼠的臟器保護(hù)作用。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，40只，200～250 g，雄性，購(gòu)買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京) 2012～0001。飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，飼養(yǎng)溫度18～22℃，濕度45～65%。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品1.2.1沙棘提取物由青海清華博眾生物技術(shù)有限公司提供。采用青海沙棘果、果渣提取成濃度50%水提取物，乙醚、乙酸乙酯和三氯甲烷萃取沙棘水提液，HPLC定量沙棘提取物中五羥色胺含量為2.923μg/ml，沙棘提取物中五羥色胺得率為51%。95%乙醇和2%的鹽酸純化、干燥，收獲純沙棘五羥色胺備用，0.9%生理鹽水溶液臨用前配制，配制終濃度1μg/μl。

1.2.2STZStreptozotocin，鏈脲佐菌素注射液，美國(guó)SIGMA公司。按大鼠公斤體質(zhì)量及所需試劑劑量，用微量秤稱取所需試劑，用雙蒸水配制0.1mol/L、PH=4.5的檸檬酸鈉溶液,檸檬酸鈉溶液配置1%的鏈脲佐菌素溶液，避光、4 ℃保存。按大鼠體質(zhì)量分別用1ml注射器抽取STZ溶液備用。

1.3試劑大鼠5-羥色胺(5-HT)ELISA檢測(cè)試劑盒大連范邦生物科技有限公司。

1.4實(shí)驗(yàn)儀器酶標(biāo)儀BIO-TEK ELX-800, MagNA Lyser組織勻漿儀。

1.5實(shí)驗(yàn)方法1.5.1糖尿病大鼠模型制備將40只雄性SD大鼠(180±20)隨機(jī)選取10只作為對(duì)照組(A組)，余下30只大鼠高糖高脂飼料飼喂4周后，腹腔注射STZ造模。造模方法如下。 STZ臨用前溶解在pH=4.0的0.17mmol/L檸檬酸緩沖液內(nèi)，25mg/Kg，1次/d，連續(xù)2d, 注射藥物兩天后測(cè)定大鼠空腹血糖(測(cè)試前禁食12h)，血糖值監(jiān)測(cè)高于16.7mmol/L顯示造模成功。1.5.2分組將造模成功大鼠隨機(jī)分為3組。分別為：安慰劑組(B組)、五羥色胺組(C組)、沙棘提取物提取五羥色胺組(D組)。

1.5.3給藥A組給予腹腔注射0.9%生理鹽水溶液0.3ml/Kg。造模成功后，B組給予腹腔注射0.9%生理鹽水溶液0.3ml/Kg，C組腹腔注射DOI 0.3mg/Kg，D組給予0.9%生理鹽水溶液0.3ml/Kg，各組均自由飲食。

1.5.4標(biāo)本采集最后一次給藥一周后將大鼠用 10%水合氯醛麻醉(麻醉劑量0.35 mL/100 g),剖腹,腹主動(dòng)脈采血,約 7～9ml，存放于2個(gè)非抗凝管中，其中一管送生化檢驗(yàn)；另一管 4℃ 3000rpm 離心10分鐘后留取血清存放于-80℃低溫冰箱備用。取大鼠下丘腦。

1.6指標(biāo)觀察

1.6.1一般情況觀察實(shí)驗(yàn)期間觀察各組大鼠行為學(xué)、精神狀態(tài)、體重、攝食情況等變化。

1.6.2血糖檢測(cè)觀察大鼠用藥前后血糖的變化情況。

1.6.3血清及下丘腦五羥色胺水平檢測(cè)[11]大鼠腹主動(dòng)脈取血少量檢測(cè)血糖血脂值，余下標(biāo)本4℃、3500 r/min離心 10 min, 取上清液, -20 ℃凍存，血清五羥色胺含量按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)。下丘腦稱重,加 9 倍量冷生理鹽水(生理鹽水的體積為下丘腦質(zhì)量的 9 倍), 10 000 r/min 研磨制成 10%組織勻漿, 4℃、2000 r/min 離心 10 min,取上清液,-20 ℃保存。按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)下丘腦五羥色胺含量。

2　結(jié)果

2.1一般狀態(tài)造模前各組大鼠精神狀態(tài)良好、毛色光澤、活潑好動(dòng)。模型組大鼠在注射STZ后體重呈緩慢增長(zhǎng)、逐步較前下降、消瘦走勢(shì),神態(tài)倦怠、皮毛散亂無(wú)光澤、喜扎堆或蟄伏、觀察發(fā)現(xiàn)有多飲、多尿、多食等糖尿病癥狀。造模成功大鼠28只，實(shí)驗(yàn)組分3組給藥，其中C組和D組大鼠在給藥后精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn),消瘦走勢(shì)減緩，體質(zhì)量有上升趨勢(shì)，逐漸由喜扎堆蟄伏狀態(tài)開(kāi)始變得活波，觀察發(fā)現(xiàn)多飲多食多尿等癥狀有所好轉(zhuǎn)，但大鼠整體狀態(tài)仍略遜于對(duì)照組，安慰劑組大鼠精神狀態(tài)最差。

2.2體質(zhì)量變化對(duì)照組大鼠生長(zhǎng)良好,體質(zhì)量持續(xù)增加,無(wú)其他癥狀。對(duì)照組和造模組大鼠分別喂養(yǎng)4周后，造模組大鼠體質(zhì)量明顯增加，出現(xiàn)明顯的腹型肥胖。STZ注射后，模型組大鼠造模成功28只，隨機(jī)分3組分別為安慰劑組(B組)、五羥色胺組(C組)、沙棘提取物提取五羥色胺組(D組)，各實(shí)驗(yàn)組用藥后，大鼠體質(zhì)量出現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。其中對(duì)照組(A組)大鼠體質(zhì)量正常增加，B組大鼠體質(zhì)量出現(xiàn)初期快速下降，后期下降減緩趨勢(shì)；C組、D組用藥后大鼠質(zhì)量重出現(xiàn)先下降，后逐漸回升趨勢(shì)，但體質(zhì)量仍低于正常組。各組大鼠體質(zhì)量變化情況如下。見(jiàn)表1。

表1　對(duì)照組大鼠與各實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量變化

注：2)表示與對(duì)照組相比，P<0.01, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.3各組大鼠血清和下丘腦五羥色胺含量變化情況造模成功后B組大鼠與A組相比，血清中五羥色胺含量升高，下丘腦中五羥色胺含量下降。C組和D組在給藥后，均可見(jiàn)大鼠血清中五羥色胺含量略有下降，與B組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但不能達(dá)到對(duì)照組血清中五羥色胺含量水平(P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)；造模后B組大鼠下丘腦五羥色胺含量明顯下降，與A組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，C組和D組經(jīng)治療后，大鼠下丘腦五羥色胺含量與安慰劑組相比明顯升高(P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，但含量仍低于A組(P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，其中D組五羥色胺含量略高于C組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

2.4大鼠血清中總膽固醇和甘油三酯含量變化糖尿病大鼠在造模成功后，B組血清中總膽固醇和甘油三酯含量持續(xù)升高，與A組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。C組和D組在給藥后，總膽固醇和甘油三酯含量下降，與安慰劑組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中D組下降程度略大于C組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表2　大鼠各組血清和下丘腦五羥色胺含量

注：2)表示與安慰劑組相比，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

表3　第13周大鼠對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組總膽固醇和甘油三酯含量

注：2)表示與對(duì)照組相比，P<0.01, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3　討論

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)沙棘的研究很多，探討沙棘中新發(fā)現(xiàn)成份和功效可以為開(kāi)發(fā)沙棘新產(chǎn)品提供重要的研究及轉(zhuǎn)化方向。沙棘提取物在降糖、降脂、提高免疫力方面療效顯著。經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi)外專家的不懈努力，沙棘對(duì)糖尿病患者的臟器保護(hù)作用已經(jīng)得到了學(xué)術(shù)上的認(rèn)可。大量文獻(xiàn)研究顯示：沙棘提取物(沙棘黃酮、維生素、礦物質(zhì)、微量元素、SOD等)能降低血糖、控制糖尿病的病情進(jìn)展，提高患者生存質(zhì)量。五羥色胺作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)人體神經(jīng)、情志、內(nèi)分泌系統(tǒng)有影響，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠體內(nèi)五羥色胺含量明顯不同于正常大鼠，探討五羥色胺對(duì)糖尿病大鼠的臟器影響具有重要意義。

英國(guó)劍橋大學(xué)Addenbrooke’s醫(yī)院周里鋼等[12]研究發(fā)現(xiàn)，五羥色胺受體激動(dòng)劑可以改善2型糖尿病的黑色素皮質(zhì)素受體通路，通過(guò)建立下丘腦-脊髓-外周肌肉-白色脂肪之間有效的中樞神經(jīng)-外周組織通路,最終改善外周肌肉和脂肪組織的葡萄糖的代謝過(guò)程，有效地改善肥胖小鼠葡萄糖耐量和胰島素抵抗，為我們探索通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用于外周組織防治2型糖尿病提供了理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)合周里鋼等實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)，采用體內(nèi)補(bǔ)充外源性五羥色胺的方法，驗(yàn)證五羥色胺對(duì)糖尿病大鼠血糖血脂的影響，從而判斷五羥色胺是否對(duì)糖尿病大鼠具有臟器保護(hù)作用。本研究在糖尿病大鼠造模成功后，可見(jiàn)伴隨著糖尿病大鼠血糖、血脂的升高，外周血血清五羥色胺含量逐漸升高，而下丘腦五羥色胺含量反而下降(安慰劑組與對(duì)照組相比，差異明顯，P<0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)；當(dāng)模型組分別給予DOI和沙棘提取物提取五羥色胺后，可見(jiàn)隨著血糖血脂指標(biāo)的下降，外周血血清中五羥色胺含量反而下降，而下丘腦五羥色胺含量逐漸上升(C組、D組與B組相比，差異明顯，均P<0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，給藥后兩組血糖、血脂數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)向正常大鼠轉(zhuǎn)變，但均不能達(dá)到正常水平(C組、D組與B組相比，差異明顯，均P<0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。

已有研究表明五羥色胺含量變化可以影響血腦屏障通透性的改變。本研究的結(jié)果提示，補(bǔ)充外源五羥色胺可以有效改善糖尿病大鼠血糖血脂指標(biāo)，其機(jī)制可能與補(bǔ)充外源五羥色胺后改變了血腦屏障的通透性，間接提高了下丘腦五羥色胺含量有關(guān)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)給藥后，沙棘提取物組對(duì)血糖血脂的改善效果明顯優(yōu)于五羥色胺組(C組與D組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究?？傊狙芯匡@示沙棘提取物通過(guò)外源補(bǔ)充的方式可以有效對(duì)糖尿病大鼠起到降糖、降血脂的作用，其中植物源性五羥色胺的作用居功至偉。

最初外源補(bǔ)充的五羥色胺是從動(dòng)物血液及腸黏膜中提取的，容易產(chǎn)生交叉感染、過(guò)敏性反應(yīng)的現(xiàn)象，并且存在血制品污染和動(dòng)物中的病毒、細(xì)菌感染的危險(xiǎn)。為了避免以上問(wèn)題，從植物中提取天然、綠色的5-羥色胺尤為重要，受限于五羥色胺植物來(lái)源極為罕見(jiàn)，沙棘提取物中新發(fā)現(xiàn)的五羥色胺為我們提供了一個(gè)重要的研究思路。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了沙棘提取物中植物源性五羥色胺對(duì)糖尿病大鼠的降血糖、血脂的效果，為開(kāi)發(fā)沙棘提取物新產(chǎn)品提供了良好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

[1]J.Santos,M.Zaniquel i,et al. Aluminum Ion Complex Formation with 3-Hydroxy Flavone in Langmuir and Langmuir Blodgett Films[J].Colloids and Surfaees, 2002,(198):569-576.

[2]S.Gayot,X Santareli,D Coulon.Modifieation of Flavonoid Using Lipase in Non-conventional Media:Effect of the Water Content[J].Joumal of Biotechnology, 2003,(101):29-36.

[3]周原生，烈 勇，王 玥，等. 沙棘萃取物降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖[J] . 國(guó)際沙棘研究與開(kāi)發(fā)，2007,12( 5) :14-15.

[4]Baoru Yang, HeiKKI Kallio.Composition and Physiological effects of sea buckthon (hiPPophae) liPids[J].Trends in Food Seience& Technology, 2002,13(5):160-167.

[5]黃桂紅，賀 敬. 鏈脲佐菌素致糖尿病小鼠模型的建立及抗氧化能力的影響[J].中國(guó)藥事，2009,23(8) :755-757.

[6]涂獻(xiàn)玉，王文英，鄧德明，等.低聚原花青素對(duì)STZ糖尿病小鼠血糖水平的影響[J] .長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006,12(4):247-249.

[7]Vahid Bilaloglu Guliyeva,Mustafa Gulb.Hippophae rhamnoides L. Chromatographic methods to determine chemical composition,use in traditional medicine and pharmacological effeets[J].Jourmal of Chromatography B,2004,812:291-307.

[8]Yuangang Zu, Chunying Li, Yujle Fu, et al. Simultaneous determination of catechin, rutin, quercetin, kaempferol and isorhamnetin in the extract of sea buckthorn(Hippophae rhamnoides L)leaves by RP-HPLC with DAD[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006,41:714-719.

[9]Xing J, Yang B, Dong Y, et al .Effeets of sea buekthorm (hippophae rhamnoides L.)seed and pulp oil on experimental models of gastric ulcer in rats[J]. Fitoterapia, 2002,73:644-650.

[10]劉忠．藏藥沙棘的化學(xué)成分概述[J]．中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志2004(3):147-148.

[11]王路，王德山，劉旭東,等.眼針對(duì)抑郁模型大鼠海馬及下丘腦五羥色胺表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32(5)990-992.

[12]周里鋼.五羥色胺2C受體激動(dòng)劑改善2型糖尿病的黑色素皮質(zhì)素受體通路探討[A].2008中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)內(nèi)分泌代謝科醫(yī)師分會(huì)年會(huì)論文匯編[C].2008：49-52.

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.05.022 1.2.31-(2,5-Dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane hydrochloride,1- (2,5-二甲氧基-4-碘苯基)-2-氨基丙烷鹽酸鹽;五羥色胺受體激動(dòng)劑,Sigma,St.Lous, MO,純度≧98%。按大鼠公斤體質(zhì)量及所需試劑劑量，用微量秤稱取所需試劑, 0.9%生理鹽水溶液臨用前配制，配制濃度1μg/μl。

文章編號(hào)：1003-8914(2016)-05-0655-04

收稿日期：(本文校對(duì)：劉言言2015-07-09)

Research on 5-HT in Seabuckthorn Extract Protection Diabetic Rats from Organ Injury

WANG DongmeiDONG KeXU WenjinZHANG JinkuiHUANG GuoyingAN YuelingLIU Feng

(Qinghai Tsinghua Biotry Bio-Tech Company Limited, Qinghai, Xi'ning 810016, China)

Abstract：ObjectiveTo observe 5-HT (5-hydroxytryptamine) in seabuckthorn extract protect diabetic rats from organ injury. MethodsFed high sugar and high fat diet joint low-doses streptozotocin (STZ ) build typeⅡdiabetic rat model. The diabetic rats were randomly divided into the placebo group (group B), use of 5-HT group (group C) and use of seabuckthorn extract group (group D). After diabetic rats were dealt with different treatment methods, the changing of the general condition, blood sugar and blood fat levels in those diabetic rats were observed. ResultsThe model group was given after feeding seabuckthorn extract or using 5-HT respectively, comparing with the placebo group, groups C and D variation tendency were consistent, as follows: the blood sugar (P < 0.01) and blood lipid decreased (P < 0.01), the hypothalamus 5-HT increased (P < 0.01), the peripheral blood serum 5-HT levels decreased (P < 0.01), of which the seabuckthorn extract group and 5-HT group difference were not obvious, there was no statistical significance. ConclusionSeabuckthorn extracts of 5-HT can protect diabetic rats from organ injury through decreasing diabetic rat's blood lipid and sugar levels.

Key words：Seabuckthorn; Seabuckthorn extract; 5-HT; Diabetes