冀　宏，底　旺，嚴(yán)　麗，張霖雷,李清懷

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院甲狀腺外科，河北 石家莊 050000)

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miR-221在甲狀腺疾病中的表達(dá)及意義

冀宏，底旺，嚴(yán)麗，張霖雷,李清懷*

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院甲狀腺外科，河北 石家莊 050000)

[摘要]目的探討miR-221在甲狀腺疾病穿刺細(xì)胞活檢組織及外周血中的定量表達(dá)及意義。方法51例甲狀腺結(jié)節(jié)患者采用超聲引導(dǎo)下粗針穿刺細(xì)胞活檢法獲取標(biāo)本，術(shù)前抽取外周血標(biāo)本，采用定量 PCR 法檢測組織及血漿中 miR-221的表達(dá)水平。結(jié)果miR-221在甲狀腺良性結(jié)節(jié)組織中的表達(dá)與周圍正常組織差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-221 在甲狀腺癌組織中的表達(dá)明顯高于穿刺病灶周圍正常組織(P<0.05)；miR-221在不同甲狀腺癌腫瘤病理分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甲狀腺癌組外周血miR-221水平顯著高于健康對(duì)照組和甲狀腺良性病變組(P<0.05)。結(jié)論miR-221高表達(dá)與甲狀腺癌的惡化過程關(guān)系密切，可為甲狀腺癌術(shù)前診斷和個(gè)體化治療提供新的思路。

[關(guān)鍵詞]甲狀腺腫瘤；聚合酶鏈反應(yīng)；活組織檢查，針吸

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.05.011

甲狀腺癌是臨床最常見的內(nèi)分泌腫瘤，臨床上對(duì)甲狀腺癌的術(shù)前診斷最常依據(jù)彩超檢查，并可進(jìn)行超聲引導(dǎo)下穿刺活檢來協(xié)助診斷，細(xì)針穿刺細(xì)胞活檢(fine needle aspiration biopsy，F(xiàn)NAB)具有較高的特異度和準(zhǔn)確率，但由于一些客觀因素如取材量不當(dāng)?shù)纫约凹?xì)胞結(jié)構(gòu)特異性不夠，往往導(dǎo)致部分患者不能明確診斷，而隨著超聲引導(dǎo)下粗針穿刺活檢技術(shù)的不斷進(jìn)步，廣泛開展后大大提高了診斷的準(zhǔn)確率。戴維德等[1]報(bào)道微小 RNA(miRNA)是新近廣泛研究的分子腫瘤標(biāo)記物，已被證實(shí)與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[2]。在miRNA家族中，miRNA因能反映惡性腫瘤的侵襲程度而受到廣泛關(guān)注。在已發(fā)生侵襲的甲狀腺癌組織中，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)miR-221基因簇的表達(dá)顯著高于未轉(zhuǎn)移的FTC腫瘤組織，并與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)[3]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-221在甲狀腺癌中的高表達(dá)可作為良惡性腫瘤的鑒別方式[4]。但目前尚無關(guān)于將miR-221作為腫瘤標(biāo)記物的相關(guān)報(bào)道。本研究應(yīng)用RT-PCR技術(shù)探討miR-221在不同甲狀腺疾病患者術(shù)前穿刺活檢組織及外周血中的定量表達(dá)情況。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2013年5月—2015年8月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院收治的行甲狀腺穿刺活檢患者51例，男性13例，女性38 例；年齡 22～70 歲，平均( 45.8±23.6)歲，其中<45歲者25例，≥45歲者26例；手術(shù)切除后病理檢查證實(shí)為甲狀腺癌31例(乳頭狀癌25例，濾泡癌3例，髓樣癌3例)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例，TNM分期Ⅰ+Ⅱ期23例，Ⅲ+Ⅳ期8例；甲狀腺良性病變20例，其中結(jié)節(jié)性甲狀腺腫17例，橋本甲狀腺炎2例，腺瘤1例。所有患者均無絕對(duì)手術(shù)禁忌癥，手術(shù)前均未接受放療、化療及其他治療，無其他臟器轉(zhuǎn)移及合并疾病。另隨機(jī)選擇我院體檢中心50例無腫瘤病變的健康志愿者用于血清學(xué)對(duì)照。健康對(duì)照組男性18例，女性32例，年齡22～68歲，平均(41.2±21.9)歲。2組一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

所有入組者均予以告知，所有患者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法所有患者術(shù)前均行超聲引導(dǎo)下穿刺活檢術(shù)，應(yīng)用西門子公司Sequoia 512型彩色多普勒超聲診斷儀，穿刺活檢器材為美國巴德公司產(chǎn)BARDVIG1822型全自動(dòng)活檢槍，穿刺過程中采用18 GTru-cut活檢針(彈射距離分15 mm和22 mm兩檔)。穿刺前患者凝血功能無明顯異常，均停用抗凝藥物7 d以上。穿刺時(shí)囑患者平臥位充分暴露頸部，先行甲狀腺常規(guī)超聲選取最佳進(jìn)針角度，常規(guī)消毒鋪巾，2%的利多卡因局部麻醉，將18 G粗針在超聲引導(dǎo)下到達(dá)腫塊邊緣，穿刺針道及針尖前方避開大血管及氣管等重要器官，按壓活檢槍取得標(biāo)本送檢。

外周血標(biāo)本采集：同期采集51例甲狀腺疾病患者術(shù)前和50例健康對(duì)照組人群外周血標(biāo)本，對(duì)比兩者外周血miR-221表達(dá)量。

1.3RT-PCR檢測提取全基因組mRNA，引物由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。①逆轉(zhuǎn)錄過程： 將合成的cDNA加A反應(yīng)在20 μL體系中進(jìn)行，2 μL10X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.5 μL Poly(A)聚合酶3 mL miRNA混勻后37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s，反應(yīng)的cDNA在-80 ℃低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。②PCR過程：采用兩步法反應(yīng)程序，95 ℃變性5 min，40個(gè)PCR循環(huán)(95 ℃ 5 s、57 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s)；循環(huán)結(jié)束后60 ℃延伸10 min，每個(gè)標(biāo)本均作復(fù)管 PCR 反應(yīng)，至少重復(fù) 3 次。采用相對(duì)定量方法(2△△CT)對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析，計(jì)算2個(gè)復(fù)孔的平均值作為每個(gè)樣本的實(shí)際CT值，同一樣本的CT值減去其內(nèi)參β-actin的CT值，獲得△CT值，然后同一組的樣本獲得一個(gè)平均△CT值，在所有實(shí)驗(yàn)組的△CT值中選擇一個(gè)最大△CT(Max)作為衡量的標(biāo)準(zhǔn)，用其他樣本組的△CT值減去△CT(Max)值,最后根據(jù)待測基因和內(nèi)參循環(huán)數(shù)CT值，按照公式相對(duì)值=2△△CT計(jì)算出待測樣本待測基因相對(duì)于內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用 SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料比較分別采用F檢驗(yàn)、q檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1甲狀腺疾病患者超聲表現(xiàn)所有患者超聲共表現(xiàn)72枚結(jié)節(jié)，直徑0.5～2.7 cm，形態(tài)不規(guī)則者24例，邊界不清者7例，周圍有暈環(huán)者18例，內(nèi)可見微鈣化者21例，中央型血供者19例，有甲狀腺囊腫者5例。超聲引導(dǎo)下患者甲狀腺穿刺活檢均一次成功，切割不同層面長條狀甲狀腺瘤樣組織，穿刺過程中無明顯不適主訴，穿刺后僅1例患者因血供豐富而出現(xiàn)穿刺針道出血情況，壓迫20 min后完全止血。穿刺完成后獲得明確的病理結(jié)果，31例甲狀腺癌穿刺活檢病理與術(shù)后病理結(jié)果完全符合，診斷符合率100%。

2.2miR-221在不同甲狀腺組織中的表達(dá)情況與病灶周圍正常甲狀腺組織相對(duì)比，miR-221在良性甲狀腺結(jié)節(jié)病灶中表達(dá)量無明顯升高(P>0.05)，而在甲狀腺癌中的表達(dá)量則顯著增加(P<0.05)，見表1。

2.3miR-221高表達(dá)與甲狀腺癌臨床病理特征間的關(guān)系miR-221表達(dá)水平在不同腫瘤病理分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甲狀腺癌患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.4miR-221在不同甲狀腺疾病術(shù)前外周血中的表達(dá)甲狀腺癌、甲狀腺良性病變及健康對(duì)照組外周血miR-22相對(duì)表達(dá)量分別為0.96±0.22、0.35±0.13、0.16±0.11，甲狀腺癌組外周血miR-221水平顯著高于健康對(duì)照組和甲狀腺良性病變組(F=258.074，P<0.05)。

表1miR-221在不同甲狀腺組織中的表達(dá)比較

組別例數(shù)miR-221相對(duì)表達(dá)量甲狀腺病灶周圍正常組織510.23±0.07甲狀腺良性結(jié)節(jié)200.31±0.05甲狀腺癌300.89±0.16*# F413.578 P 0.000

*P<0.05與甲狀腺病灶周圍正常組織比較#P<0.05與甲狀腺良性結(jié)節(jié)比較(q檢驗(yàn))

表2miR-221表達(dá)與甲狀腺癌病理參數(shù)關(guān)系

參數(shù) 例數(shù)miR-221相對(duì)表達(dá)量tP年齡 <45 ≥4514170.86±0.030.88±0.061.185>0.05性別 男 女10210.86±0.020.85±0.031.099>0.05TNM分期 Ⅰ+Ⅱ Ⅲ+Ⅲ2380.81±0.031.02±0.078.227<0.05淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有 無18130.98±0.020.83±0.0315.685<0.05

3　討　　論

甲狀腺結(jié)節(jié)術(shù)前FNAB是臨床上廣泛應(yīng)用并認(rèn)可的診斷手段之一，有文獻(xiàn)報(bào)道FNAB在甲狀腺結(jié)節(jié)術(shù)前診斷的敏感度及特異度均高達(dá)90%以上[5]。雖然有學(xué)者將FNAB視為診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的首選手段[6]并將其列入甲狀腺疾病診治指南，但由于細(xì)針穿刺只能抽吸少量組織液進(jìn)行細(xì)胞檢測，標(biāo)本量不足造成漏診情況較多，會(huì)大大降低其診斷的敏感度和特異度，假陰性率較高，難以準(zhǔn)確鑒別良、惡性疾病[7]。為了提高術(shù)前診斷準(zhǔn)確率，臨床上逐漸開展超聲引導(dǎo)下粗針穿刺活檢，憑借超聲定位優(yōu)勢，在提高穿刺準(zhǔn)確度的同時(shí)，降低了觸診活檢的并發(fā)癥[8]。相比于細(xì)針穿刺活檢，粗針穿刺活檢優(yōu)點(diǎn)是非常明確的。本研究粗針活檢結(jié)果與術(shù)后病理結(jié)果對(duì)比顯示，對(duì)甲狀腺癌的診斷符合率可達(dá)到100%，具有明顯優(yōu)勢，此種方法不僅可以切割到長條狀的甲狀腺結(jié)節(jié)組織，還可以在超聲導(dǎo)引下對(duì)不同層面的組織及被膜進(jìn)行活檢，這對(duì)后續(xù)的病理診斷及分型是非常有價(jià)值的[9]。而本研究5例甲狀腺囊腫患者標(biāo)本采集過程中在明確診斷的同時(shí)，給予囊腫液的抽吸并硬化治療，使囊腫縮小，表明超聲引導(dǎo)下的甲狀腺粗針穿刺活檢不僅診斷價(jià)值較高，還可以對(duì)良性病變實(shí)施有效的微創(chuàng)治療，避免了此類良性病變實(shí)施手術(shù)切除的風(fēng)險(xiǎn)，降低了患者治療費(fèi)用。

甲狀腺粗針穿刺活檢在彩超引導(dǎo)下可避開病變周圍大血管、神經(jīng)及氣管組織，并且可根據(jù)腫塊大小及其周圍毗鄰情況選擇不同的切割深度，從而避免損傷重要器官。本研究僅有1例出現(xiàn)針道出血，考慮其周圍血供豐富而損傷小分支供血血管，經(jīng)壓迫后即可止血，表明粗針穿刺活檢是相對(duì)安全可靠的檢查方法。但此項(xiàng)技術(shù)的廣泛開展需要獨(dú)立的超聲介入科配合，受限于穿刺操作人員的臨床經(jīng)驗(yàn)及甲狀腺結(jié)節(jié)部位血供程度的不同，故在很多基層醫(yī)院仍以FNAB為主。針對(duì)術(shù)前無法明確診斷的甲狀腺結(jié)節(jié)患者，則需依賴術(shù)中冰凍病理檢查或手術(shù)后病理檢查來明確診斷，但這部分不能確診患者術(shù)中或術(shù)后病理檢查結(jié)果僅可使20%～25%的患者確診為甲狀腺癌，而其余大部分患者無需手術(shù)切除治療。能否在甲狀腺癌中探尋到一項(xiàng)高靈敏度和特異度的分子診斷標(biāo)志物顯得尤為重要，但目前的相關(guān)研究還停留在分子水平，缺少與臨床病理資料的結(jié)合。

miRNA是一類由19～25個(gè)核苷酸組成的細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)的非編碼小分子RNA，廣泛存在于脊椎動(dòng)物中，具有高度保守性[10]。其表達(dá)及在腫瘤機(jī)制方面，已在肝癌、乳腺癌、胃癌等多種常見腫瘤中得到了深入研究，而在以甲狀腺癌為代表的內(nèi)分泌系統(tǒng)癌癥中尚處于起步階段[11]。本研究選擇了miR-221這一在甲狀腺癌及其他多種惡性人類腫瘤組織中均為高表達(dá)[12]的亞型進(jìn)行臨床病理相關(guān)研究。對(duì)甲狀腺癌患者的全基因組miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)異常的miRNA表達(dá)譜，其可以明確區(qū)分正常甲狀腺組織與甲狀腺癌組織，而在甲狀腺癌組織中miR-221的表達(dá)相比正常甲狀腺組織顯著增加[13]。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌患者血漿miR-221水平顯著高于甲狀腺良性結(jié)節(jié)及健康對(duì)照者(P<0.05)，同時(shí)甲狀腺癌活檢組織中miR-221 的表達(dá)水平明顯高于甲狀腺良性結(jié)節(jié)及病灶周圍正常甲狀腺組織。這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。表明 miR-221 高表達(dá)可作為甲狀腺癌的潛在標(biāo)志物，可作為補(bǔ)充診斷方法。本研究結(jié)果還顯示，miR-221 在TNMⅢ、Ⅳ患者的甲狀腺癌組織中表達(dá)水平明顯高于TNM Ⅰ、Ⅱ期的甲狀腺癌組織，提示miR-221 在甲狀腺癌發(fā)生及進(jìn)展中可能發(fā)揮重要作用；同時(shí)，miR-221 在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌組織中的表達(dá)量有明顯差異，表明其在腫瘤的侵襲性方面有重要的意義。機(jī)制可能為 miR-221 通過抑制下游基因PTEN 及 TIMP3 的表達(dá)，最終使癌細(xì)胞容易發(fā)生浸潤及轉(zhuǎn)移[15]。

總之，與正常組織及甲狀腺良性結(jié)節(jié)相比，miR-221在甲狀腺癌組織中高表達(dá)，術(shù)前超聲引導(dǎo)下粗針穿刺活檢聯(lián)合 miR-221檢測可明顯提高甲狀腺結(jié)節(jié)的早期診斷準(zhǔn)確率并為指導(dǎo)甲狀腺癌的個(gè)性化治療提供新的思路。

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(本文編輯：劉斯靜)

[收稿日期]2016-01-25；[修回日期]2016-02-17

[作者簡介]冀宏(1981-),女,河北棗強(qiáng)人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事甲狀腺、乳腺外科疾病診治研究。 *通訊作者。E-mail:aining1@163.com

[中圖分類號(hào)]R736.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-3205(2016)05-0540-04

Expression and significance of miR-221 in patients with thyroid diseases

JI Hong, DI Wang, YAN Li, ZHANG Lin-lei, LI Qing-huai*

(Department of Thyroid Surgery, the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017, China )

【Abstract】ObjectiveTo study the expression of miR-221 in biopsy tissue of thyroid disease and peripheral blood. MethodsSpecimens were obtained by ultrasound guided core-needle in 51 cases of patients diagnosed with thyroid nodules. Peripheral blood samples were collected before operation. Quantitative PCR method was used to detect the expression of miR-221 levels in tissue and plasma. ResultsThe difference of the expression of miR-221 in benign lesions and normal tissue was not statistically significant(P>0.05). In thyroid cancer cases, miR-221 expression level in cancerous tissue were significantly higher than that in normal tissue adjacent to thyroid leisions(P<0.05). There were significant differences in the expression of miR-221 in different pathological stages of thyroid carcinoma and in lymph node metastasis(P<0.05). The level of miR-221 in peripheral blood of patients with thyroid cancer was significantly higher than that in healthy control group and in benign thyroid disease group(P<0.05). ConclusionThe high expression of miR-221 is closely related to the progression of thyroid carcinoma., which can provide novel ideas with preoperative diagnosis and individualized treatment for thyroid cancer.

[Key words]thyroid neoplasms； polymerase chain reaction； biopsy, needle