陳　培，滕艷杰，楊旭芳，楊曉帆

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，黑龍江 牡丹江　157011； 2.牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江 牡丹江　157011； 3.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 牡丹江　157011)

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海馬區(qū)Fas蛋白表達與糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的相關(guān)性Δ

陳培1*，滕艷杰2，楊旭芳1，楊曉帆3#

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，黑龍江 牡丹江157011； 2.牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江 牡丹江157011； 3.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 牡丹江157011)

目的：探討海馬區(qū)Fas蛋白表達與糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的相關(guān)性。方法：選取健康雄性大鼠30只，以隨機數(shù)字表法分為正常對照組、腦缺血再灌注組、糖尿病腦缺血再灌注組各10只。采用線栓法構(gòu)造大鼠腦中動脈閉塞模型，并采用蘇木精-伊紅染色法觀察海馬CA1神經(jīng)元缺失情況，采用免疫組化法檢測Fas蛋白表達量。結(jié)果：蘇木精-伊紅染色結(jié)果中，正常對照組未觀察到細胞凋亡和神經(jīng)元缺失，而腦缺血再灌注組和糖尿病腦缺血再灌注組大鼠均觀察到細胞凋亡和神經(jīng)元缺失，其中糖尿病腦缺血再灌注組大鼠神經(jīng)元缺失較為嚴(yán)重；正常對照組僅觀察到極少量的Fas染色陽性細胞，而糖尿病腦缺血再灌注組和腦缺血再灌注組大鼠可以較為明顯地觀察到Fas染色陽性細胞，且糖尿病腦缺血再灌注組大鼠Fas蛋白表達顯著高于腦缺血再灌注組。結(jié)論：糖尿病局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元Fas蛋白的表達較為明顯，F(xiàn)as蛋白介導(dǎo)的細胞凋亡是海馬神經(jīng)元損傷的重要機制之一。

海馬區(qū)； Fas蛋白； 糖尿??； 腦缺血再灌注損傷

糖尿病是一種機體慢性代謝疾病，不僅與腦血管發(fā)病有關(guān)，還與神經(jīng)系統(tǒng)的損傷有密切關(guān)聯(lián)，是導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的獨立危險因素[1]。研究結(jié)果表明，腦缺血再灌注損傷也是導(dǎo)致認(rèn)知障礙的關(guān)鍵因素[2]，腦缺血再灌注損傷容易引發(fā)神經(jīng)元凋亡，而Fas蛋白作為細胞凋亡的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，國內(nèi)關(guān)于其在海馬神經(jīng)元組織的表達及機制研究的報道較少。本研究探討糖尿病大鼠腦缺血再灌注海馬神經(jīng)元損傷中Fas蛋白不同時間點的表達情況及其與神經(jīng)元損傷的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1　材料

1.1儀器

強生穩(wěn)豪倍易型血糖儀[強生(中國)醫(yī)療器材有限公司]；Fas免疫組化檢測試劑盒(武漢博士德生物工程公司)；LIOO S600 系列生物顯微鏡(北京京昊永成商貿(mào)有限公司)。

1.2藥品與試劑

鏈脲佐菌素[生興生物技術(shù)(南京)有限公司，純度≥95%； 熔點：121 ℃；規(guī)格：100 mg；批號：X20140733]；水合氯醛(上海士鋒生物科技有限公司，批號：F01038742)。

1.3動物模型

30只健康雄性Wister大鼠，由牡丹江市醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)試驗動物中心提供，大鼠均處于2～3月齡，體質(zhì)量200～250 g，以隨機數(shù)字表法分為正常對照組、腦缺血再灌注組、糖尿病腦缺血再灌注組各10只。

1.3.1腦缺血再灌注組：大鼠局灶性腦缺血再灌注模型采用線栓法和環(huán)扎法完成，采用神經(jīng)評分判定，大鼠左側(cè)肢體癱瘓或者行走向右旋轉(zhuǎn)為實驗大鼠[3]。

1.3.2糖尿病腦缺血再灌注組：大鼠禁食8 h后，分別于左腹腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，3 d后進行血糖測定，取大鼠尾尖血液，空腹血糖水平≥16.7 mmol/L表示具有糖尿病[4]。針對糖尿病大鼠，不采取胰島素干預(yù)，動態(tài)觀察糖尿病大鼠的癥狀及體征變化。在此基礎(chǔ)上，按照“1.3.1”方法建立糖尿病腦缺血再灌注組動物模型。

1.4方法

3組實驗動物經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，分別在左心室插管下灌入0.9%氯化鈉溶液和4%多聚甲醛各100 ml，處死并取腦，制作標(biāo)本后采用4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液進行固定，固定處理24 h后，進行酒精脫水并低溫石蠟包埋。組織連續(xù)快速切片，切片厚度5 μm，進行常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色處理。依據(jù)Fas免疫組化檢測試劑盒說明進行Fas蛋白免疫組化，以磷酸鹽緩沖液(0.01M PBS)作為陰性對照組，同時每張切片海馬區(qū)的陽性細胞觀察在400倍光鏡下處理，隨機選取8個互不重疊的視野觀察。

2　結(jié)果

2.1HE染色結(jié)果

正常對照組大鼠未觀察到明顯的神經(jīng)細胞凋亡；2 d后，觀察到腦缺血再灌注組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元明顯減少；糖尿病腦缺血再灌注組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元減少更為嚴(yán)重，見圖1。

2.2免疫組化結(jié)果

正常對照組大鼠Fas蛋白表達量極少，而腦缺血再灌注組大鼠Fas染色陽性細胞較多，糖尿病腦缺血再灌注組大鼠Fas染色陽性細胞表達量顯著高于腦缺血再灌注組，見圖2。

A.正常對照組； B.腦缺血再灌注組； C.糖尿病腦缺血再灌注組A.Normal control group; B.Cerebral ischemia-reperfusion group; C.Diabetes, cerebral ischemia-reperfusion group圖1　海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡觀察圖Fig 1　Hippocampus neuronal apoptosis

D.正常對照組； E.腦缺血再灌注組； F.糖尿病腦缺血再灌注組D.Normal control group; E.Cerebral ischemia-reperfusion group; F.Diabetes, cerebral ischemia-reperfusion group圖2　海馬區(qū)Fas蛋白表達情況Fig 2　Hippocampus Fas protein expression

3　討論

糖尿病不僅是缺血性腦血管病發(fā)病的獨立危險因素，還在一定程度上影響著缺血性腦血管病的神經(jīng)元損傷狀況[5-7]。近年來，隨著人們生活方式的改變，糖尿病患者的數(shù)量也不斷增加，糖尿病成為了醫(yī)療診治中廣受關(guān)注的疾病，其具有較高的致殘率、致死率，也是引發(fā)腦血管疾病的關(guān)鍵因素，對患者認(rèn)知功能有一定的影響[8-9]。因此，深入研究糖尿病腦缺血再灌注神經(jīng)元細胞損傷的機制具有積極的現(xiàn)實意義。

Fas蛋白是一種細胞表面蛋白，又稱為CD95，細胞凋亡主要是通過Fas配體與Fas靶細胞集合而起作用[10-11]，在糖尿病腦缺血患者的神經(jīng)組織中，F(xiàn)as蛋白是機體細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的關(guān)鍵。糖尿病大鼠的海馬神經(jīng)元會出現(xiàn)椎體細胞核固縮、線粒體腫脹、染色質(zhì)?；犬惓０Y狀，這些癥狀是神經(jīng)細胞凋亡的典型特征[12-13]。本研究中，糖尿病腦缺血再灌注組大鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Fas不斷上調(diào)，在2 d后出現(xiàn)高峰表達狀態(tài)，顯著高于腦缺血再灌注組。糖尿病腦缺血再灌注組與腦缺血再灌注組的HE染色變化趨勢基本一致，但糖尿病腦缺血再灌注組神經(jīng)染色細胞較為顯著，說明高血糖在一定程度上能夠增強Fas活性。因此，糖尿病腦缺血再灌注由于Fas介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡機制導(dǎo)致了神經(jīng)元損傷，進一步研究Fas與神經(jīng)元細胞凋亡其他信號間的關(guān)系，可以尋找有效的Fas抑制劑，從而明顯減輕Fas蛋白對糖尿病海馬區(qū)缺血神經(jīng)的損傷，該研究方向是今后局灶性腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷的探索重點。

綜上所述，海馬區(qū)Fas蛋白表達與局灶性腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)，也是導(dǎo)致糖尿病腦缺血后出現(xiàn)認(rèn)知障礙的關(guān)鍵因素，臨床應(yīng)加強對Fas蛋白的表達機制及其抑制機制的研究。

[1]丁欣，張季生，吳軍，等.Fas蛋白在糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)的表達及意義[J].解剖科學(xué)進展，2008，14(3)：284-286.

[2]張爾楓.糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)Fas和Tau蛋白的表達意義[D].沈陽：中國醫(yī)科大學(xué)，2005.

[3]張季聲，丁欣，吳軍，等.糖尿病大鼠腦缺血再灌注海馬CAl區(qū)Fas蛋白的表達[J].中國生物制品學(xué)雜志，2007，20(6)：413-415.

[4]丁欣，陳曉敏，吳迪賓，等.依達拉奉對糖尿病大鼠腦缺血再灌注海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2014，34(16)：4595-4597.

[5]鄭廣順，高亮，楊涌杰，等.降鈣素基因相關(guān)肽對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織P53蛋白表達的調(diào)節(jié)作用[J].解剖科學(xué)進展，2005，11(1)：19-21.

[6]謝柏梅，傅衛(wèi)紅，徐朝霞.慢性阻塞性肺疾病大鼠呼吸、認(rèn)知功能和海馬區(qū)腦代謝物之間相關(guān)性研究[J].國際呼吸雜志，2015，35(5)：342-346.

[7]賀麗蓉，邵曉珊，李宇紅，等.Fas/FasL在原發(fā)性腎小球疾病患兒腎組織中的表達[J].貴州醫(yī)藥，2015，39(3)：210-213.

[8]張瑞鳳，劉艷清，王艷玲.三磷酸胞二鈉對大鼠局灶性腦缺血再灌注后Fas蛋白表達的影響[J].中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2005，8(7)：783-784.

[9]趙志偉.大鼠肢體缺血-再灌注后海馬Fas蛋白表達的變化[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2005.

[10]何倩，李花，周小青，等.丹龍醒腦片對大鼠腦缺血再灌注后海馬區(qū)AI及Fas/FasL、TNF-α表達的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，29(2)：23-25.

[11]左艷麗，于凌志，賈孟輝，等.Fas/FasL系統(tǒng)與腦缺血再灌注損傷相關(guān)性的研究進展[J].醫(yī)學(xué)信息，2016，29(5)：26-27.

[12]李建民，趙雅寧，劉樂，等.高血壓大鼠全腦缺血再灌注后海馬區(qū)c-Jun氨基末端激酶激活與GRP78表達的關(guān)系[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2014，27(5)：473-477.

[13]王軍，陳靜，張冬秀，等.缺氧缺血性腦損傷大鼠腦組織海馬區(qū)p-tau蛋白與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的關(guān)系[J].山東醫(yī)藥，2014，54(45)：1-3.

Correlation of Hippocampus Fas Protein Expression and Diabetes Focal Cerebral Ischemia Reperfusion Injury in RatsΔ

CHEN Pei1, TENG Yanjie2, YANG Xufang1, YANG Xiaofan3

(1.Dept.of Physiology and Physiology, Mudanjiang Medical College, Heilongjiang Mudanjiang 157011, China; 2.Medical Research Center, Mudanjiang Medical University, Heilongjiang Mudanjiang 157011, China; 3.Dept.of Internal Medicine-Neurology, Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical College, Heilongjiang Mudanjiang 157011, China)

OBJECTIVE：To probe into the correlation of hippocampus Fas protein expression and diabetes focal cerebral ischemia reperfusion injury in rats. METHODS: 30 healthy male rats were randomly selected and divided into normal control group (n=10), cerebral ischemia reperfusion group (n=10), diabetes cerebral ischemia reperfusion group (n=10). MCAO was established by thread approach, CA1 neuronal loss was observed by HE staining, and Fas protein expression was detected by immunohistochemistry. RESULTS: HE staining results in the normal control group showed no apoptosis and neuronal loss, and cerebral ischemia reperfusion group and diabetes cerebral ischemia reperfusion group were observed apoptosis and neuronal loss, and the neuronal loss in diabetic cerebral ischemia reperfusion group were relatively severe. A small amount of Fas staining positive cells were observed in normal control group, yet Fas staining positive cells cerebral were clearly observed in ischemia reperfusion group and cerebral ischemia reperfusion group; and the Fas protein expression in diabetic cerebral ischemia reperfusion group was higher than that in cerebral ischemia reperfusion group. CONCLUSIONS: The diabetic rat focal cerebral ischemia reperfusion injury in the hippocampus neuron Fas protein expression is relatively apparent, Fas protein mediated apoptosis is one of the important mechanisms of hippocampal neuron damage.

Hippocampus; Fas protein; Diabetes; Cerebral ischemia reperfusion injury

2016-04-14)

牡丹江市科學(xué)技術(shù)計劃項目(No.z2014s023)；牡丹江醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項目(No.zs201511)

主治醫(yī)師。研究方向：腦老化與腦血管病。E-mail:qingqingfanying@sina.com

R743.31

A

1672-2124(2016)07-0894-03

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.07.011

*講師。研究方向：腦老化與腦血管病。E-mail:hongmeisu@163.com