張莉恒， 王　師， 常亞青， 包振民， 丁　君??

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116023；2.中囯海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266003)

?

夏眠期仿刺參腸組織實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的篩選?

張莉恒1， 王師2， 常亞青1， 包振民2， 丁君1??

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116023；2.中囯海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266003)

摘要：在仿刺參(Apostichopus japonicus)正常時(shí)期、夏眠初期和中期，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)CA043、dpolm、ro60、grb2、hiat1、nlrc4、farp1、cyc和gapdh 9個(gè)候選內(nèi)參基因在腸組織中的表達(dá)穩(wěn)定性。利用Delta Ct、GeNorm、NormFinder和BestKeeper 4種程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。發(fā)現(xiàn)上述條件中，9個(gè)候選內(nèi)參基因在上述條件中的表達(dá)穩(wěn)定性存在一定差異，不同的軟件處理分析，得到的基因穩(wěn)定性排序不完全一致。綜合4種程序的方法，篩選出基因grb2表達(dá)最穩(wěn)定，可用作內(nèi)參基因，其次為基因ro60及dpolm，而表達(dá)最不穩(wěn)定的是CA043，不適宜作為內(nèi)參基因。本研究為仿刺參中基因表達(dá)定量分析奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為仿刺參中內(nèi)參基因的選擇提供一定參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：仿刺參；夏眠；內(nèi)參基因；熒光定量PCR

引用格式：張莉恒， 王師， 常亞青， 等. 夏眠期仿刺參腸組織實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的篩選[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016, 46(7): 35-43.

ZHANG Li-Heng, WANG Shi, CHANG Ya-Qing, et al. Selection of reference genes for quantitative real-time PCR of Apostichopus japonicus intestine during different periods of aestivation[J].Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(7): 35-43.

仿刺參(Apostichopusjaponicus)為中國(guó)現(xiàn)有海參中最主要的經(jīng)濟(jì)種類，目前已有學(xué)者從遺傳育種學(xué)、發(fā)育學(xué)和免疫學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域?qū)Ψ麓虆⑦M(jìn)行了研究，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)仿刺參的功能基因等分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究已成為近年來研究熱點(diǎn)。關(guān)于了解基因表達(dá)方式、揭示基因功能及闡明基因在生物體發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制等研究中，基因表達(dá)分析具有至關(guān)重要的作用。在基因表達(dá)分析方法中，由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)具有較高的敏感性和自動(dòng)化程度、較好的重復(fù)性、較快的檢測(cè)速度等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用[1-7]。利用該方法時(shí)，需要采用合適的內(nèi)參基因?qū)赡艽嬖诘牟町愡M(jìn)行校正及標(biāo)準(zhǔn)化。理想的內(nèi)參基因是指在各種類型細(xì)胞、組織及不同處理?xiàng)l件下均表達(dá)恒定，但大量研究表明，大多常用內(nèi)參基因只在特定細(xì)胞或組織、特定條件下表達(dá)較穩(wěn)定，而在不同類型細(xì)胞、不同發(fā)育階段及不同處理?xiàng)l件下表達(dá)具有差異[8-11]，從而使實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性受到內(nèi)參基因選擇的影響。因此，通過比較不同生理?xiàng)l件下、不同類型細(xì)胞及不同生長(zhǎng)階段等情況下基因的表達(dá)水平，選出合適的內(nèi)參基因使數(shù)據(jù)得到標(biāo)準(zhǔn)化具有重要意義。近年來，內(nèi)參基因的選擇已得到研究者的高度重視。常見的內(nèi)參基因有GAPDH基因、β-actin基因等管家基因[12-15]。目前，國(guó)內(nèi)內(nèi)參基因相關(guān)研究多見于高等動(dòng)植物[16]，水產(chǎn)動(dòng)物相關(guān)研究較少，主要有楊桂梅等[17]利用抑制差減技術(shù)檢測(cè)出gapdh和β-肌動(dòng)蛋白基因在牙鲆(Paralichthysolivaceus)發(fā)育過程中表達(dá)水平上可能存在差異；此外，楊愛馥等[18]對(duì)仿刺參cytb和β-actin基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了比較；封利穎等[19]利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)12種候選內(nèi)參基因在蝦夷扇貝不同組織及不同發(fā)育階段的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了分析；國(guó)外學(xué)者分析研究了斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[20]、大西洋鮭(Salmosalar)[21]等的內(nèi)參基因穩(wěn)定性。關(guān)于仿刺參夏眠特定條件下內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的研究尚未見報(bào)道。

本研究首次通過對(duì)仿刺參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，選擇了9個(gè)候選內(nèi)參基因，利用Delta Ct、GeNorm、NormFinder及BestKeeper 4種方法比較各候選內(nèi)參基因在仿刺參正常時(shí)期、夏眠初期及夏眠中期腸組織中的表達(dá)穩(wěn)定性，選擇出不同生理?xiàng)l件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，旨在探究仿刺參基因表達(dá)定量分析中內(nèi)參基因的選擇問題，為海參功能基因表達(dá)中內(nèi)參基因的選擇提供了參考。

1　材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)所用仿刺參取自大連黑石礁海域，分為3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，即仿刺參正常時(shí)期(2013-07-01)、夏眠初期(2013-09-11)和夏眠中期(2013-10-09)。每個(gè)時(shí)期取3頭，取其腸道組織，收集到1.5mL離心管內(nèi)，投入液氮中迅速冷凍，存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑與儀器DEPC水；Trizol；氯仿；3mol/L NaAc(pH=5.2)；75%乙醇；異丙醇；Nuclease-free水；1×TAE；瓊脂糖；10mmol/L dNTP；Oligo(dT)18 Primer；Recombinant RNase Inhibitor；Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)；SYBR Green Master(Rox)；移液槍(Eppendorf)；高速勻漿機(jī)(IKEA)；PCR儀(Bio-RAD)；純水系統(tǒng)(Milliore)；高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)； Nanoview(GE)；瓊脂糖電泳儀；凝膠成像系統(tǒng)(SIM)；制冰機(jī)；渦旋振蕩儀；超凈無菌工作臺(tái)；Qubit核酸濃度測(cè)定儀；高壓滅菌鍋；LightCycler實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀480Ⅱ。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取仿刺參不同夏眠時(shí)期的9個(gè)個(gè)體腸組織的RNA均用TRIzol Reagent(Invitrogen,CA，USA)提取，且所有操作均在低溫且無RNA酶的條件下進(jìn)行。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA的完整性，使用Nanoview(GE)檢測(cè)RNA的純度和濃度，選用A260/A280值為1.8～2.2的RNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)束檢測(cè)后將RNA放置-80℃冰箱凍存。

（2）缺乏針對(duì)工業(yè)控制網(wǎng)絡(luò)安全防御的相關(guān)技術(shù)手段。由于工業(yè)控制網(wǎng)絡(luò)對(duì)于運(yùn)行的連續(xù)性與響應(yīng)時(shí)間等方面的要求較高，有別于信息網(wǎng)絡(luò)的要求，研究針對(duì)工業(yè)控制網(wǎng)絡(luò)的安全防御理論及技術(shù)非常必要。

1.2.2 cDNA合成取2μgRNA，向其中加入1μL Oligo dT，并加入DEPC水補(bǔ)至體系為12.5μL，整個(gè)過程要求在冰上進(jìn)行，然后將其置于預(yù)熱至65℃的PCR儀中孵育5min，迅速取出置于冰上。向上述反應(yīng)物中加入4μL的5×Reaction Buffer、0.5μL的20URNasein、2μL的10mmol/L dNTP及1μL的200U M-MVL Reverse Transcriptase，混勻后置于42℃ 90min，70℃ 10min孵育以滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCRQPCR反應(yīng)是20μL體系、2μL的稀釋20倍的cDNA、4μL的2μmol/L引物S、4μL的2μmol/L引物A及10μL的SYBR Green Mastermix。將上述反應(yīng)液混勻離心后，置于LightCycler實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀480Ⅱ系統(tǒng)中，每個(gè)基因設(shè)置3個(gè)生物重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。按照以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15s。各引物最佳退火溫度下反應(yīng)1min，40次循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 1min，0.5℃/10s降至60℃，60℃1min。PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度的時(shí)間設(shè)定在擴(kuò)增反應(yīng)的退火過程中。為了排除引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)基因表達(dá)定量的影響，在PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行了熔解曲線分析，溫度從95℃以0.5℃/10s速率緩慢降至60℃，連續(xù)采集樣品的熒光信號(hào)以獲取熔解曲線。

1.2.4 候選內(nèi)參基因選擇及引物設(shè)計(jì)所有候選內(nèi)參基因序列由本實(shí)驗(yàn)室通過仿刺參轉(zhuǎn)錄組Illumina測(cè)序技術(shù)(Hiseq2000)測(cè)定而得。測(cè)序獲得仿刺參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將序列與Swissprot蛋白數(shù)據(jù)庫比對(duì)，得到基因注釋，同時(shí)比較分析各基因的表達(dá)水平，最后共選出10個(gè)候選內(nèi)參基因用來分析基因表達(dá)穩(wěn)定性，包括CA043(Uncharacterized protein C1orf43 homolog)、dpolm(dna-directed dna/rna polymerase mu)、ro60(60 kda ss-a ro ribonucleoprotein)、grb2(growth factor receptor-bound protein 2)、hiat1(hippocampus abundant transcript 1 protein)、nlrc4(nlr family card domain-containing protein 4)、farp1(FERM, RhoGEF and pleckstrin domain-containing protein 1)、cyc(cytochrome c)、gapdh(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)。利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，見表1。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.5 普通PCR檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物為了檢測(cè)cDNA的質(zhì)量、擴(kuò)增產(chǎn)物是否準(zhǔn)確及其是否具有特異性，在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR之前，先通過普通PCR驗(yàn)證。普通PCR反應(yīng)的10μL體系包括1μL的cDNA、1μL的Primer-F、1μL的Primer-R、0.8μL的10mmol/L dNTP、1μL的10×PCR buffer、0.1μL的rTaq酶及5.1μL的ddpO。將上述體系反應(yīng)物置于程序：95℃預(yù)變性2min后，按照95℃，30s；60℃，30s；72℃，15s的反應(yīng)程序進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，終延伸72℃,5min后置于4℃保存。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理和分析數(shù)據(jù)處理與分析采用Excel 2003和4種常用的內(nèi)參穩(wěn)定性評(píng)價(jià)軟件，包括Delta Ct、geNorm (http：//medgen.ugent.be/～jvdesomp/genorm/)[22]，NormFinder[23]和BestKeeper[24]軟件，根據(jù)各軟件說明對(duì)候選內(nèi)參基因在仿刺參正常時(shí)期、夏眠初期及夏眠中期腸組織中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。具體操作如下：設(shè)定不同樣本中某一內(nèi)參基因Ct值最小者表達(dá)量為1，在Excel 2003中標(biāo)準(zhǔn)化處理其他樣品

表1　9個(gè)候選內(nèi)參基因引物序列及相關(guān)信息

Note: ①Unigene; ②Annotation; ③Primer sequence(5’-3’); ④Length of amplified product

此內(nèi)參基因的表達(dá)量，即此內(nèi)參基因想其他樣本中的相對(duì)表達(dá)量為2-ΔCt(ΔCt=各樣本Ct值-最小Ct值)，將數(shù)據(jù)結(jié)果按格式要求導(dǎo)入GeNorm軟件，該軟件能夠計(jì)算各候選內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定值M以及分析內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)差異，從而篩選出表達(dá)較穩(wěn)定的內(nèi)參基因以及所需內(nèi)參基因的最適數(shù)目。NormFinder軟件與geNorm軟件類似，而BestKeeper軟件則輸入原始數(shù)據(jù)即可。

2　結(jié)果與分析

2.1 仿刺參正常時(shí)期、夏眠初期及夏眠中期腸組織總RNA提取

圖1　總RNA

2.2 候選內(nèi)參基因引物特異性分析

普通PCR擴(kuò)增后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果如圖2所示，在100～200bp之間，基因CA043、dpolm、ro60、grb2、hiat1、nlrc4、farp1、cyc和gapdh擴(kuò)增片段條帶清晰，片段長(zhǎng)度與預(yù)期片段大小一致，且條帶單一、不含雜帶與引物二聚體；同時(shí)對(duì)各候選內(nèi)參基因引物進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各候選內(nèi)參基因的熔解曲線均為顯著的單一峰(見圖3)。綜合分析，說明9個(gè)候選內(nèi)參基因引物均具有較高特異性，可用于后續(xù)的qRT-PCR分析；同時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)樣品擴(kuò)增曲線具有較好的重復(fù)性，這說明qRT-PCR的分析結(jié)果準(zhǔn)確可信。

(1：CA043；2：dpolm；3：ro60；4：grb2;5：hiat1；6：nlrc4；7：farp1；8：cyc；9：gapdh；M為DNA標(biāo)記M is DNA Marker.)

圖29 個(gè)候選內(nèi)參基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.2PCR products of 9 candidate reference genes

圖3　9對(duì)候選基因引物的熔解曲線

2.3 內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)分析

2.3.1 geNorm軟件評(píng)價(jià)分析結(jié)果仿刺參正常時(shí)期、夏眠初期及夏眠中期腸組織中9個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性見圖4。geNorm軟件是依據(jù)表達(dá)穩(wěn)定度平均值(M)的大小對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行評(píng)價(jià)，M值越小，說明內(nèi)參基因表達(dá)越穩(wěn)定；反之，則表明內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性差。經(jīng)過geNorm軟件的評(píng)價(jià)分析發(fā)現(xiàn)，在仿刺參正常時(shí)期、夏眠初期及夏眠中期腸組織中9個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性的平均值M從大到小依次為CA043>gapdh>farp1>cyc>nlrc4>hiat1>dpolm>ro60=grb2(見圖4a)，由此可見，穩(wěn)定性最好的基因?yàn)閞o60和grb2，其平均表達(dá)穩(wěn)定性M值均為0；而基因CA043與gapdh穩(wěn)定性最差，其平均表達(dá)穩(wěn)定性M值分別為1.59和1.42。除基因CA043外，其他8個(gè)候選內(nèi)參基因M值均小于1.5，在此條件下可作為內(nèi)參基因。此外，geNorm軟件通過分析標(biāo)準(zhǔn)化因子配對(duì)差異值，來確定所需內(nèi)參基因的最適數(shù)目，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化因子配對(duì)差異(pairwise variations)值低于0.15，即Vn(n+1)<0.15時(shí)，說明有n個(gè)基因可以作為實(shí)時(shí)熒光定量分析的內(nèi)參基因，不需要選擇使用數(shù)量大于等于n+1個(gè)基因作為內(nèi)參基因。如圖4b所示，本研究中標(biāo)準(zhǔn)化因子配對(duì)差異值均大于0.15，但是以V3/4最小，即在此之后增加更多的內(nèi)參基因也不能降低標(biāo)準(zhǔn)化因子配對(duì)差異值(Vn/n+1)，所以理想的內(nèi)參基因數(shù)目應(yīng)選為3個(gè)，建議選用基因grb2、ro60和dpolm作為內(nèi)參基因。

(其中a為選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定度的平均值，b為內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)差異分析。a is Average expression stability M, b is Pairwise Variations.)

圖4GeNorm軟件分析候選基因在仿刺參不同夏眠時(shí)期腸組織的表達(dá)穩(wěn)定性

Fig.4Average expression stability values of the candidate reference genes in intestine of

japonicus during different aestivation analyzed by GeNorm

2.3.2 Delta Ct方法評(píng)價(jià)分析結(jié)果根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果，利用Delta Ct方法對(duì)仿刺參正常時(shí)期、夏眠初期及夏眠中期腸組織中9個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5。由圖5可知9個(gè)候選內(nèi)參基因平均穩(wěn)定性值從大到小排序?yàn)镃A043>gapdh>cyc>farp1>nlrc4>hiat1>dpolm>ro60=grb2，基因grb2和ro60穩(wěn)定性較高，平均表達(dá)穩(wěn)定性值均為0.205，之后依次為基因dpolm、hiat1、nlrc4、farp1、cyc、gapdh，基因CA043表達(dá)穩(wěn)定性最差，其平均表達(dá)穩(wěn)定性值為0.44。

2.3.3 NormFinder 軟件評(píng)價(jià)分析結(jié)果NormFinder軟件分析內(nèi)參基因的原理與GeNorm軟件相似，都是根據(jù)基因平均表達(dá)穩(wěn)定值的大小評(píng)估，穩(wěn)定值越小，基因表達(dá)的穩(wěn)定性越高。但是該軟件不能預(yù)測(cè)內(nèi)參基因組合的數(shù)目。經(jīng)NormFinder軟件評(píng)價(jià)分析發(fā)現(xiàn)，NormFinder分析結(jié)果與GeNorm分析結(jié)果基本一致(見圖6)?；騞polm平均表達(dá)穩(wěn)定值最小，為0.04，可作為候選內(nèi)參基因；其次為基因grb2與ro60，平均穩(wěn)定值均為0.072；同樣基因CA043平均穩(wěn)定值最高，為0.408。

2.3.4 BestKeeper軟件評(píng)價(jià)分析結(jié)果BestKeeper軟件與GeNorm、NormFinder軟件原理不同，該軟件是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差(SD)與調(diào)節(jié)系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差SD[±X-fold]對(duì)基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)判，其值越小則表示基因表達(dá)越穩(wěn)定。經(jīng)過BestKeeper軟件評(píng)估分析，仿刺參正常時(shí)期、夏眠初期及夏眠中期腸組織中9個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性見圖7與表2。由表2和圖7可知，與geNorm和NormFinder軟件分析結(jié)果不同，BestKeeper軟件分析結(jié)果以基因CA043表達(dá)最為穩(wěn)定，SD為0.76；同時(shí)基因grb2、ro60及dpolm表達(dá)穩(wěn)定性仍排列在前四名，其SD值分別為1.01、1.17、1.20；而表達(dá)最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)閒arp1，SD值為1.40。

圖5　Delta Ct法分析候選基因在仿刺參不同夏眠時(shí)期腸組織的表達(dá)穩(wěn)定性

圖6　利用NormFinder評(píng)價(jià)內(nèi)參候選基因仿刺參不同夏眠時(shí)期腸組織的表達(dá)穩(wěn)定性

圖7　利用BestKeeper評(píng)價(jià)內(nèi)參候選基因在仿刺參不同夏眠時(shí)期腸組織的表達(dá)穩(wěn)定性

參數(shù)Parameters基因GenesCA043dpolmro60grb2hiat1nlrc4farp1cycgapdhGeoMeans[CP]22.9827.4128.2126.7426.2727.2327.3124.8226.99ARMean[CP]23.0027.4428.2426.7626.3127.3327.4324.9527.03Min[CP]22.0425.5726.5525.0324.4624.8024.7822.0824.17Max[CP]24.9729.3031.4928.8528.5031.7633.5030.2929.72SD[±CP]0.761.201.171.011.202.142.192.171.40CV[%CP]3.304.384.143.764.577.847.988.715.16Min[X-fold]-1.92-3.59-3.16-3.26-3.51-5.37-5.78-6.70-7.05Max[X-fold]3.973.729.724.344.6923.0773.0944.336.67SD[±X-fold]1.672.302.252.012.304.424.564.512.63

本研究利用Delta Ct、geNorm、Normfinder和BestKeeper 4種軟件綜合分析篩選出仿刺參正常時(shí)期、夏眠初期及夏眠中期腸組織中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參基因。表3顯示，基因grb2表達(dá)最穩(wěn)定，其次為ro60基因及dpolm基因，而基因CA043表達(dá)穩(wěn)定性較差。因此，可選基因grb2、ro60及dpolm作為內(nèi)參基因。

表3　9個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定度排序

3　討論

夏眠是仿刺參特有的重要生理習(xí)性，由學(xué)者M(jìn)itsukuri于日本首次發(fā)現(xiàn)[25]。夏眠期間仿刺參會(huì)產(chǎn)生一系列的生理生態(tài)變化，主要表現(xiàn)為活動(dòng)降低、停止攝食、體質(zhì)量減輕、消化道退化萎縮、代謝降低等。這一生理習(xí)性在一定程度上影響了仿刺參的質(zhì)量及產(chǎn)量。因此，研究夏眠過程中仿刺參的代謝生理調(diào)控機(jī)制，以期望打破夏眠這一生理習(xí)性，對(duì)能夠更好的實(shí)現(xiàn)仿刺參的經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有重要意義。另外，由于夏眠是仿刺參的特殊生理習(xí)性，能夠準(zhǔn)確的取到各夏眠時(shí)期仿刺參樣品具有一定的難度。目前，關(guān)于夏眠期間仿刺參內(nèi)參基因選擇的研究尚未見報(bào)道，本文首次比較了9個(gè)候選基因在仿刺參正常時(shí)期、夏眠前期及夏眠中期腸組織中的表達(dá)穩(wěn)定性，以期望得到表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因，為以后關(guān)于仿刺參夏眠過程中代謝調(diào)控機(jī)制的研究提供參考。

對(duì)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究而言，選擇合適的內(nèi)參基因是其能夠準(zhǔn)確分析基因表達(dá)穩(wěn)定性的前提。通常理想的內(nèi)參基因是指在不同類型細(xì)胞或組織器官、不同發(fā)育階段及各種處理?xiàng)l件下均穩(wěn)定表達(dá)[26]。但實(shí)際上幾乎不存在能同時(shí)滿足這些條件的基因，目前所研究的基因在不同類型的細(xì)胞、組織器官及實(shí)驗(yàn)條件下表達(dá)均存在差異[27-29]。因此，研究者可以特定驗(yàn)條件對(duì)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行分析。本研究即對(duì)仿刺參夏眠這一特殊生理?xiàng)l件下的腸道組織進(jìn)行內(nèi)參基因的穩(wěn)定性的分析。

之前大量學(xué)者多以文獻(xiàn)中報(bào)道過的常用管家基因作為候選內(nèi)參基因來進(jìn)行基因表達(dá)穩(wěn)定性分析。而本研究首次通過由本實(shí)驗(yàn)室對(duì)仿刺參轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行Illumina測(cè)序，獲得仿刺參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將序列與Swissprot蛋白數(shù)據(jù)庫比對(duì)，得到基因注釋，同時(shí)比較分析各基因的表達(dá)水平，從而獲得CA043、dpolm、ro60、grb2、hiat1、nlrc4、farp1、cyc和gapdh共9個(gè)候選內(nèi)參基因用來分析基因表達(dá)穩(wěn)定性。其中基因grb2，即生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞分化等功能，在多個(gè)信號(hào)通路中擔(dān)任著“接力棒”的角色，目前已成為研究最為透徹的接頭蛋白。董迎輝等[30]擴(kuò)出泥蚶grb2基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并研究分析了其組織表達(dá)、生物信息學(xué)及發(fā)育階段表達(dá)特征；周維霞等[31]研究發(fā)現(xiàn)基因grb2的表達(dá)與胰腺癌的生物學(xué)行為密切相關(guān)。此外，grb2基因在哺乳動(dòng)物中已被證實(shí)是調(diào)控生長(zhǎng)以及胚胎發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路的重要基因，基于夏眠期間仿刺參的生理生態(tài)變化的表現(xiàn)，這一結(jié)論與本研究得到的grb2基因表達(dá)最穩(wěn)定的結(jié)果一致。Eli Eisenberg等[32]認(rèn)為CA043基因可用作內(nèi)參基因；ro60參與了RNA聚合酶III啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的生物過程；基因polm在人、牛、小鼠等中是保守的；Neil Romberg等[33]研究表明nlrc4的突變可導(dǎo)致小腸結(jié)腸炎；BinQuan Zhuang等[34]研究發(fā)現(xiàn)基因farp1能促進(jìn)脊柱運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樹突的生長(zhǎng)；基因cyc即為細(xì)胞色素C，具有增強(qiáng)細(xì)胞氧化與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用；基因gapdh為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，該酶是糖酵解反應(yīng)中的一個(gè)酶。封利穎等[19]利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)12種候選內(nèi)參基因在蝦夷扇貝不同組織及不同發(fā)育階段的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，并得到基因cyc和gapdh可作為內(nèi)參基因，本研究結(jié)果與其不同。為了能夠更充分了解各基因的相關(guān)信息，上述基因有待于進(jìn)一步深入研究。

目前常用于評(píng)價(jià)分析內(nèi)參基因穩(wěn)定性的生物學(xué)軟件有GeNorm、NormFinder及BestKeeper 3種，如果單獨(dú)選擇其中一種生物學(xué)軟件分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性以篩選最佳內(nèi)參基因，得到的結(jié)果并不理想[35]。因此本研究利用基于Excel 2003平臺(tái)的Delta Ct、GeNorm、NormFinder及BestKeeper 4種軟件對(duì)仿刺參正常時(shí)期、夏眠初期及夏眠中期條件下腸道組織中的9個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，經(jīng)過Delta Ct、GeNorm及NormFinder軟件分析的結(jié)果基本一致，基因grb2、ro60及dpolm表達(dá)穩(wěn)定性排序均為前3，GeNorm與NormFinder軟件的區(qū)別是前者能夠確定合適內(nèi)參基因組合的數(shù)目，而后者只能得到表達(dá)最穩(wěn)定的基因。與上述3種方法分析結(jié)果不同，BestKeeper軟件分析結(jié)果為基因CA043最為穩(wěn)定，其他基因穩(wěn)定性排序也與另外3種分析方法差異，這可能是由于BestKeeper軟件的原理是直接將原始數(shù)據(jù)Ct值輸入到程序中，這樣計(jì)算出的數(shù)據(jù)會(huì)產(chǎn)生虛假的變化[36-37]。綜合分析，合適的內(nèi)參基因組合數(shù)目為3個(gè)，分別為基因grb2、ro60及dpolm；并篩選出了在仿刺參夏眠期條件下的表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)間rb2。

4　結(jié)語

本研究首次嘗試研究仿刺參在夏眠這一特殊生理?xiàng)l件下評(píng)價(jià)分析候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性。為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具說服力，利用Delta Ct、GeNorm、NormFinder和BestKeeper 4種生物學(xué)軟件，綜合系統(tǒng)地比較仿刺參正常時(shí)期、夏眠初期及夏眠中期腸道組織的Real-time PCR數(shù)據(jù)，篩選出了適合研究仿刺參夏眠期條件下的基因表達(dá)的內(nèi)參基因組合數(shù)目是3個(gè)，其中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)間rb2。研究結(jié)果為仿刺參夏眠相關(guān)基因表達(dá)分析中的內(nèi)參基因的選擇提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)也對(duì)仿刺參不同組織及不同實(shí)驗(yàn)條件處理下內(nèi)參基因的篩選提供了參考資料。

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責(zé)任編輯朱寶象

基金項(xiàng)目：?國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA10A412)；遼寧省農(nóng)業(yè)攻關(guān)及成果產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目(2015203003)資助

收稿日期：2015-03-05；

修訂日期：2016-05-05

作者簡(jiǎn)介：張莉恒(1990-)，女，碩士生，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖研究。E-mail:shiqudeyoushang@126.com ??通訊作者：E-mail： dingjun1119@dlou.edu.cn

中圖法分類號(hào)：S917

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-5174(2016)07-035-09

DOI:10.16441/j.cnki.hdxb.20150051

Selection of Reference Genes for Quantitative Real-Time PCR ofApostichopusaponicusIntestine During Different Periods of Aestivation

ZHANG Li-Heng1, WANG Shi2, CHANG Ya-Qing1, BAO Zhen-Min2, DING Jun1

(1.The Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China′s Sea, Ministry of Agriculture, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2.The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding (MGB), Ministry of Education, College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Abstract：Apostichopus japonicus is the most important economic species in China. Its special physiological habit is aestivation. There have been many studies on breeding, development, immunology and others, molecular biological research has become important. Domestic reference gene-related research is more in higher plants and animals than in aquatic animal. The study on the stability of reference gene in aestivation has not been reported. From transcriptome data analysis, we selected nine candidate refe-rence genes. In normal times, and at beginning of aestivation and in the mid of aestivation, With quantitative real-time PCR, we assessed the expression stability of nine candidate reference genes (CA043, dpolm, ro60, grb2, hiat1, nlrc4, farp1, cyc and gapdh) in intestinal tissues of A. japonicus. The stability of nine candidate reference genes analyzed by the 4 procedures (Delta Ct, GeNorm, NormFinder and BestKeeper). In conclusion, through the different software, the stability of candidate reference genes were not entirely consistent. The most stable gene was grb2, which can be used as the reference. The stability of ro60 and dpolm was the second; and the least stable was CA043. This study was the first to evaluate and analyze the expression stability of candidate reference genes in aestivation, laid a foundation for the further quantitative analysis of gene expression in A. japonicus.

Key words:Apostichopus japonicus; aestivation; reference gene; quantitative real-time PCR

Supported by the National High Technology Researchand PevelopmEnt Program (2012AA10A412); Industrialization Project of Agricultural Research and Achievements in Liaoning Province (2015203003)